蔡健宇，余婧，張景云，李翔宇，賈蒙驁，尹國英，葉定勇，薛曉兵，張盼，鄒頡，郭玉雙*

1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081 2.浙江省寧波市寧海縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江省寧波市寧海縣桃源中路118號 315600 3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，南昌市青云譜區(qū)南蓮路602號 330200 4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，哈爾濱市南崗區(qū)學(xué)府路368號 150030 5.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽市花溪區(qū)大學(xué)城棟青南路 550030

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，而赤霉素（Gibberellin,GA）是一種在煙草種植中被廣泛使用的植物激素，能夠影響煙草的株型、抗性和煙葉的質(zhì)量［1-2］。DELLA蛋白在GA信號通路中為抑制效應(yīng)因子，內(nèi)源GA可誘導(dǎo)其降解并解除其抑制效應(yīng)［3］。研究顯示，GA缺失時，DELLA-GFP融合蛋白在細(xì)胞核中富集；GA存在時，融合蛋白在核中的信號消失［4］，GA誘導(dǎo)的DELLA蛋白降解依賴于DELLA蛋白中的DELLA結(jié)構(gòu)域［5］，缺失該結(jié)構(gòu)域的DELLA蛋白在GA存在的情況下仍然穩(wěn)定。此外，研究者們以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）為研究對象，通過單突變或者多突變的方式逐個驗證DELLA蛋白序列中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的功能，逐步解析其在擬南芥生長發(fā)育過程中的多面調(diào)節(jié)作用［6-8］。目前，擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了包括GAI在內(nèi)的5個DELLA蛋白家族類似基因。除擬南芥外，其他植物中也相繼鑒定出了DELLA蛋白家族基因，包括水稻中的SLENDER RICE 1（SLR1）［9］、番茄中的PROCERA［10］、葡萄中的VvGAI1［11］、玉米中的DWARF8（D8）和DEARF9（D9）［12］等，且 鑒 定 出 的DELLA蛋白家族普遍N端有一個DELLA結(jié)構(gòu)域，C端有一個GRAS結(jié)構(gòu)域，且都是核定位［13］。

目前，擬南芥和一些其他模式植物中DELLA蛋白功能的研究較多［14-15］，如韓雨欣等［16］利用生物信息學(xué)方法從茶樹全基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了分析，推測茶樹DELLA基因廣泛參與了茶樹生長發(fā)育及非生物逆境脅迫的響應(yīng)；陳英杰等［17］利用同源重組的方法，發(fā)現(xiàn)棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因可能參與GA信號途徑進(jìn)而抑制植物生長發(fā)育。然而，煙草中的相關(guān)研究還鮮見報道。因此，利用電子克隆的方法，將擬南芥DELLA蛋白的GAI基因序列在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對，結(jié)合RT-PCR和SMARTer RACE技術(shù)，在煙草K326基因組中克隆DELLA蛋白家族基因成員，并對它們的cDNA進(jìn)行克隆。同時，結(jié)合生物信息學(xué)對煙草中DELLA蛋白基因的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化等進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上通過熒光定量PCR和基因芯片技術(shù)對其組織特異性、時期特異性、非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，旨在了解煙草DELLA蛋白的抗逆機(jī)制，為其生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試煙草品種為K326（Nicotiana tabacum L.）。將K326種子進(jìn)行消毒、浸種和催芽，在貴州省煙草科學(xué)研究院采用溫室漂浮盤播種。溫室溫度設(shè)為28℃，每天交替進(jìn)行12 h光照/12 h黑暗處理。采用100 mg/L GA和10μmol/L脫落酸（Abscisic acid，ABA）分別噴灑三周齡苗葉面，于噴灑后第0、2、5、8、11和14 h取葉片組織。此外，分別對三周齡煙苗采用100 g/L PEG6000澆灌根部模擬干旱脅迫，低溫（4℃）處理、接種煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），于處理后第7 d取葉片組織，用于檢測基因的非生物脅迫響應(yīng)。上述材料取樣后液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA、RNA提取及cDNA合成

基因組DNA提取采用CTAB法［18］，總RNA提取采用TRIZOL Reagent試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。cDNA的合成使用TransScript?

One-Step gDNA Remocal and cDNA Synthesis SuperMi試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），5’端擴(kuò)增使用5’RACE試劑盒（日本TAKARA公司），具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.3 煙草DELLA基因家族的鑒定及克隆

以擬南芥DELLA蛋白家族基因AtGAI全長cDNA序列（Gene Bank編號：NM-101361）為信息探針，在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索，對檢索到的部分高同源性EST，利用軟件Geneious進(jìn)行新的基因組裝配分析，獲得3條較長拼接序列，根據(jù)拼接序列設(shè)計引物，以煙草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合5’RACE獲得基因全長。膠回收純化后，將PCR產(chǎn)物與pMD-18T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送上海生物工程股份有限公司測序。

1.4 基因結(jié)構(gòu)與序列分析

使用Interpro Scan軟件（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）分析編碼蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)；采用最大似然法通過MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Cluster W多序列比對工具進(jìn)行氨基酸序列比對；使用SWISS-MODEL在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過植物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞在線分析工具Plant mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）對DELLA蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.5 發(fā)育時期表達(dá)譜分析

根據(jù)中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中的煙草基因芯片數(shù)據(jù)，對煙草DELLA基因家族中的DELLA1～DELLA3基因在煙草不同發(fā)育時期的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了搜集整理，并用Origin軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析制圖。

1.6 半定量PCR及熒光定量PCR分析

參照郭玉雙等［19］2015年建立的基因表達(dá)檢測方法進(jìn)行RNA的提取、cDNA第一鏈的合成、半定量PCR及Real time RT-PCR擴(kuò)增。以延伸因子基因EF-1-α（Elongation Factor 1-alpha 1 gene）作為Real time RT-PCR的內(nèi)參。設(shè)計引物序列如表1所示。相對 表 達(dá) 量 采 用2-ΔΔCt［ΔΔCt=Ct（target gene）-Ct（internal reference gene）］法計算，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草DELLA基因家族的克隆

將擬南芥DELLA基因家族的序列在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫中比對，獲得了部分煙草中與之同源度較高的EST序列，使用Geneious軟件將收集到的EST進(jìn)行新的基因組裝配分析，發(fā)現(xiàn)可以組裝出3條長于1 400 bp的EST序列（圖1）。其中第一條序列（NtDELLA1）是由FG200921.1、FG177469、FG137259.1、EB442187、EB441042.1、EB439180和DV159588共7個序列信息組裝拼接而成，全長1 870 bp，且通過ORF分析發(fā)現(xiàn)有一個編碼570個氨基酸的通讀框；第二條序列（NtDELLA2）由FG166698.1、EB451523.1、EB451304.1 和FG172890.1共4個EST組裝拼接而成，全長1 413 bp，且通過ORF分析發(fā)現(xiàn)其有一個編碼404個氨基酸的開放閱讀框；第三條序列（NtDELLA3）由

圖1 煙草DELLA基因的拼接Fig.1 Assembly of tobacco DELLA genes

FG170978.1、FG167716.1、FG134302.1、FG165341.1、FG138336.1、FG166698.1和FG165403.1共7個序列信息拼接而成，全長1 954 bp，且通過ORF分析發(fā)現(xiàn)其有一個編碼390個氨基酸的開放閱讀框。對3個開放閱讀框?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白家族均具有保守的DELLA基序和GRAS結(jié)構(gòu)域，將拼接獲得的3個煙草基因分別命名為NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3。

以栽培煙草K326的cDNA為模板，根據(jù)獲得的3個基因開放閱讀框序列分別設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3的CDS全長，結(jié)果如圖2所示。NtDELLA1基因CDS全長1 704 bp，編碼567個氨基酸；NtDELLA2基因全長1 764 bp，編 碼587個 氨 基 酸；NtDELLA3全 長 為1 692 bp，編碼563個氨基酸。

圖2 以煙草cDNA和基因組DNA為模板NtDELLAs的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of NtDELLAs using tobacco cDNA and genomic DNA as templates

為明確NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3在基因組中的基因結(jié)構(gòu)，以栽培煙草K326基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明這3個煙草DELLA蛋白家族基因均沒有內(nèi)含子，這與擬南芥和水稻等模式植物中DELLA基因的結(jié)構(gòu)一致。此外，NtDELLA1的基因組擴(kuò)增條帶經(jīng)過切膠測序后，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果中存在一個長1 229 bp的片段。序列比對結(jié)果顯示，該序列與NtDELLA1的CDS序列高度相似（相似度97%），但相比NtDELLA1其基因末端缺失約480 bp，此缺失導(dǎo)致其蛋白質(zhì)序列的C端出現(xiàn)移碼并提前終止，產(chǎn)生一個截短的蛋白。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)該基因具有完整的開放閱讀框，且其翻譯的蛋白質(zhì)序列含有DELLA特征結(jié)構(gòu)域，因此命名為NtDELLA4（圖3A）。同時，以基因組DNA和cDNA分別作為模板對NtDELLA4進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)基因組中能擴(kuò)增出NtDELLA4的條帶，但是cDNA中無法擴(kuò)增（圖3B），這表明NtDELLA4很有可能由于結(jié)構(gòu)缺失演化為一個不表達(dá)的假基因。

圖3 NtDELLA4和NtDELLA1蛋白結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Protein structures of NtDELLA4 and NtDELLA1

2.2 煙草DELLA蛋白的生物信息學(xué)分析

將NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列在EBI的蛋白結(jié)構(gòu)特征在線分析軟件Interpro Scan中進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)NtDELLA1蛋白全長為567個氨基酸，分子質(zhì)量為62.287 kDa，等電點為4.94；NtDELLA2蛋白全長為587個氨基酸，分子質(zhì)量為64.246 kDa，等電點為4.76；NtDELLA3蛋白全長為563個氨基酸，分子質(zhì)量為62.172 kDa，等電點為4.61。

通過結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)這3個蛋白的氨基酸序列有2個明顯的結(jié)構(gòu)特征，包括N端的DELLA結(jié)構(gòu)域和C端的GRAS特征結(jié)構(gòu)域，可見這3個蛋白為典型的DELLA家族成員（圖4）。多重序列比對結(jié)果（圖5）顯示煙草DELLA蛋白含有2個DELLA家族的特征結(jié)構(gòu)域（DELLA結(jié)構(gòu)域和GRAS結(jié)構(gòu)域），且N端的DELLA結(jié)構(gòu)域含有高度保守的VHYNP基序。3個煙草的DELLA蛋白與擬南芥的該蛋白高度同源，故它們的作用機(jī)制可能相似。

圖4 3個煙草DELLA蛋白結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of three tobacco DELLA proteins

圖5 NtDELLAs蛋白和其他物種NtDELLAs蛋白的氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of tobacco NtDELLAs and those of other plants

對煙草DELLA蛋白的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NtDELLA1和水稻的OsGAI聚類在一起，親緣關(guān)系較近；NtDELLA2和擬南芥RGL2聚類在一起；NtDELLA3和擬南芥RGA聚類在一起（圖6）。

圖6 不同物種DELLA蛋白的進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of DELLA proteins of different species

三維結(jié)構(gòu)建模結(jié)果如圖7所示，在3個DELLA蛋白的三維結(jié)構(gòu)中有保守的N端DELLA結(jié)構(gòu)域和C端的GRAS結(jié)構(gòu)域，兩者由中間的部分肽段相連。且蛋白兩端結(jié)構(gòu)非常保守，而連接DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域的中間部分氨基酸序列變化較大。此外，煙草中的3個DELLA蛋白與擬南芥的DELLA蛋白GAI空間結(jié)構(gòu)高度相似，所以可能也有相似的功能——作為赤霉素信號通路中的抑制因子發(fā)揮作用。

圖7 煙草NtDELLAs蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Predicted tertiary structures of NtDELLAs

通過Plant-mPLoc植物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位在線預(yù)測工具對本研究中的煙草DELLA蛋白家族成員DELLA1～DELLA4進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)DELLA1～DELLA4定位在細(xì)胞核中，這與其他作物中DELLA蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致，說明煙草DELLA蛋白也定位于細(xì)胞核中，并在細(xì)胞核中發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制功能。

2.3 不同生長發(fā)育時期NtDELLAs表達(dá)特異性分析

煙草不同生長發(fā)育時期煙草DELLA基因家族的表達(dá)量如圖8所示。由表達(dá)曲線可見NtDELLA1基因整體表達(dá)量較高，各個時期NtDELLA2和NtDELLA3表達(dá)量相近且趨勢相同。從小十字期到團(tuán)顆期NtDELLA1表達(dá)水平有一個緩慢的上升趨勢，在團(tuán)棵期的表達(dá)量達(dá)到最高，旺長期表達(dá)量明顯下調(diào)，在盛花期表達(dá)量最低，且NtDELLA1在不同時期的表達(dá)量均高于NtDELLA2和NtDELLA3，這也表明NtDELLA1可能是煙草DELLA家族成員的主效基因；NtDELLA2在不同的生長發(fā)育時期表達(dá)波動較小，但從營養(yǎng)生長到生殖生長時期表達(dá)量有逐漸降低的趨勢，但在成熟期略有回升；NtDELLA3基因在煙苗營養(yǎng)生長階段表達(dá)量逐漸上升，旺長期達(dá)到最高，但旺長期到盛花期NtDELLA3的表達(dá)量急劇下調(diào)，在盛花期達(dá)到最低，在衰老過程中表達(dá)量又有所回升。由此可見，NtDELLA3可能參與調(diào)控?zé)煵蓍_花及衰老。

圖8 不同生長發(fā)育時期煙草NtDELLAs表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of NtDELLAs at various growth and development stages

2.4 逆境條件及激素處理對煙草DELLA基因家族表達(dá)的影響

3個煙草DELLA基因?qū)Σ煌耐饨缫蛩卮碳け憩F(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。如圖9所示，煙草DELLA基因家族3個基因?qū)Φ蜏?、干旱和TMV接種響應(yīng)較為強(qiáng)烈，而鹽脅迫對DELLA基因家族的表達(dá)影響不大。在低溫脅迫的條件下，NtDELLA1基因的表達(dá)顯著上調(diào)，而NtDELLA2和NtDELLA3基因的表達(dá)則沒有顯著差異；在干旱脅迫條件下，DELLA基因家族3個基因的表達(dá)均明顯下調(diào)，其中NtDELLA1和NtDELLA2的下調(diào)尤其明顯。此外，TMV接種導(dǎo)致煙草DELLA基因家族的3個基因上調(diào)表達(dá)，說明煙草DELLA基因家族的表達(dá)能夠被TMV接種顯著誘導(dǎo)。

圖9 NtDELLAs對多種逆境的響應(yīng)Fig.9 Responses of NtDELLAs to various stress

施加外源GA和ABA的煙草DELLA基因家族的表達(dá)模式見圖10。在施加外源GA時，煙草的3個NtDELLA基因在第0～14 h區(qū)間整體顯示出了下降趨勢，NtDELLA1在處理后第11 h降至最低值，之后逐漸回升；但NtDELLA2在處理后第5～8 h區(qū)間內(nèi)顯著下降，之后緩慢下降，在處理后第14 h達(dá)到最低水平。施加外源ABA后DELLA家族成員的表達(dá)結(jié)果顯示，在ABA施加后的第11～14 h，DELLA蛋白的轉(zhuǎn)錄水平被抑制最為顯著，NtDELLA1和NtDELLA3在處理后第0～14 h整體呈下降趨勢，但NtDELLA1在處理后第5～8 h間有顯著下降，之后緩慢下降，在處理后第14 h達(dá)到最低值；NtDELLA2在處理后第11 h達(dá)到最低水平，之后出現(xiàn)回升趨勢。

圖10 NtDELLAs對GA和ABA的響應(yīng)Fig.10 Responses of NtDELLAs to GA and ABA

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)NtDELLAs對低溫、干旱和TMV侵染3種脅迫的響應(yīng)較明顯，對鹽脅迫不敏感，其中NtDELLA1對低溫脅迫響應(yīng)最為明顯，所有NtDELLAs對干旱脅迫均表現(xiàn)出明顯的下調(diào)模式，這與前人的研究結(jié)果一致［20-21］，說明GA信號通路和ABA信號通路存在交聯(lián)，干旱脅迫條件下NtDELLA基因的下調(diào)可能和ABA應(yīng)答干旱脅迫相關(guān)。NtDELLA2在TMV接種后表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，說明煙草DELL A基因家族參與煙草對TMV的應(yīng)答過程。

GA處理導(dǎo)致DELLA基因家族成員表達(dá)下調(diào)，說明外源GA不僅誘導(dǎo)內(nèi)源DELLA蛋白降解，同時施加外源ABA也出現(xiàn)了和GA處理類似的結(jié)果，尤其是在ABA施加后的第11～14 h時DELLA基因的轉(zhuǎn)錄水平受抑制的程度最大，這和前人的研究結(jié)果一致［22］，說明GA也可通過某種調(diào)節(jié)方式，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制DELLA基因的轉(zhuǎn)錄，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。DELLA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化又會導(dǎo)致其蛋白水平的變化，DELLA蛋白精細(xì)調(diào)控植物的生長發(fā)育與抗逆性以適應(yīng)環(huán)境因子變化的相關(guān)分子機(jī)制也仍待進(jìn)一步研究。同時，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，可通過基因編輯技術(shù)改變煙草DELLA基因的序列，從而創(chuàng)制出在煙草株型、生物量和抗逆性等方面具有獨(dú)特表型的煙草株系，為煙草育種提供重要的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

煙草中克隆的4個NtDELLA基因，除NtDELLA4基因結(jié)構(gòu)N端出現(xiàn)缺失為假基因外，NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3編碼的蛋白均具有典型的DELLA蛋白結(jié)構(gòu)。NtDELLAs在煙草不同組織及不同生長發(fā)育時期均有表達(dá)，其中NtDELLA1表達(dá)量最高，說明NtDELLAs基因家族成員間功能存在冗余，NtDELLA1可能為煙草DELLA基因家族的主效基因。此外，煙草NtDELLAs在低溫脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫和TMV接種4種逆境條件下均有轉(zhuǎn)錄水平的響應(yīng)，響應(yīng)模式各異。NtDELLAs對GA和ABA的響應(yīng)模式類似，均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的抑制。