葉靜雅，黃愛潔，付真真，龔穎蕓，楊洪遠(yuǎn)，周紅文

研究報(bào)告

基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致先天性全身性脂肪萎縮的分子機(jī)制研究

葉靜雅1，黃愛潔1，付真真1，龔穎蕓1，楊洪遠(yuǎn)2，周紅文1

1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210029 2. 澳大利亞新南威爾士大學(xué)生物技術(shù)與生物分子科學(xué)學(xué)院，悉尼 999029，澳大利亞

先天性全身性脂肪萎縮(congenital generalized lipodystrophy，CGL)是一種極端罕見的常染色體隱性遺傳病，表現(xiàn)為明顯的全身脂肪極度缺失，肌肉感明顯，并伴有一系列的代謝指標(biāo)異常，包括嚴(yán)重的胰島素抵抗，高血糖，高脂血癥，脂肪肝以及黑棘皮等。本文針對(duì)1例CGL患者及其家系進(jìn)行研究。先證者為19歲年輕女性，自幼皮下脂肪缺如，血清瘦素水平僅0.14 μg/L。對(duì)患者及其親屬(父母、弟弟)進(jìn)行全基因組檢測(cè)，顯示該患者基因5號(hào)外顯子存在復(fù)合雜合突變(c.560A>G和c.565G>T)，c.560A>G突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的187位的氨基酸由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?p.Y187C)，從而引起編碼的SEIPIN蛋白發(fā)生錯(cuò)義突變；c.565 G>T突變引起對(duì)應(yīng)編碼的189位氨基酸轉(zhuǎn)為終止密碼子(p.E189X)，產(chǎn)生蛋白截短突變。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，患者父親攜帶c.565G>T雜合突變，患者母親攜帶c.560A>G雜合突變，患者弟弟未攜帶基因致病性突變。本研究通過轉(zhuǎn)染突變p.Y187C質(zhì)粒至HEK293細(xì)胞，觀察到SEIPIN蛋白量及與甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT3)互作減少；原代培養(yǎng)的患者皮膚成纖維細(xì)胞體外功能實(shí)驗(yàn)表明，患者的SEIPIN蛋白量明顯低于正常健康人，加入組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors, HDACis)可部分挽救SEIPIN蛋白表達(dá)。此外，油酸刺激下患者皮膚成纖維細(xì)胞脂滴小于正常健康人。本文同時(shí)綜述國內(nèi)外既往文獻(xiàn)中報(bào)道的基因突變位點(diǎn)，豐富了CGL的臨床表型譜和致病基因突變譜，有助于提高臨床醫(yī)生對(duì)CGL的臨床診治和致病機(jī)制的理解。

先天性全身性脂肪萎縮；/SEIPIN；成纖維細(xì)胞；HDACi；糖尿病

先天性全身性脂肪萎縮(congenital generalized lipodystrophy, CGL)，又稱貝賽綜合征(Berardinelli- Seip syndrome)，是一種極端罕見的常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率約為1/10,000,000[1]。CGL的患者表現(xiàn)為明顯的全身脂肪缺如，肌肉感明顯，并伴有一系列的代謝指標(biāo)異常，包括嚴(yán)重的胰島素抵抗，高血糖，高脂血癥，脂肪肝以及黑棘皮等[2,3]。此外，在CGL患者血中來自脂肪細(xì)胞分泌的瘦素和脂聯(lián)素水平低下，平均約為0.63 ng/mL和1.5 μg/mL[4]，正常人血清瘦素和脂聯(lián)素的平均含量分別為16 ng/mL 和6.8 μg/mL[5,6]。

臨床上根據(jù)突變基因不同將CGL分為4類，分別為CGL1(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2,基因突變)，CGL2(Berardinelli-Seip congenital lipodystrophy 2,基因突變)，CGL3 (caveolin 1,基因突變)和CGL4(polymerase I and transcript release factor,基因突變)?；蛲蛔儗?dǎo)致的2型CGL是所有類型中最嚴(yán)重的，部分患者會(huì)伴發(fā)心肌病、神經(jīng)遲滯、早死和智力缺損[7,8]。CGL2型的突變基因位于人13號(hào)染色體上，編碼一種跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜保守蛋白SEIPIN。SEIPIN在大腦，睪丸，脂肪組織中高表達(dá)[9,10]，在脂滴融合、聚集與擴(kuò)大的過程中起重要作用[3,11～13]。相關(guān)研究表明通過調(diào)控中樞下丘腦–垂體軸以及外周脂肪細(xì)胞分化來影響脂質(zhì)儲(chǔ)存過程，基因突變的哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯現(xiàn)出異常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)–脂滴接觸以及增多的小脂滴[14,15]，此外，臨床報(bào)道中，突變的CGL2患者中也表現(xiàn)出嚴(yán)重的脂肪組織萎縮[2]。這些結(jié)果提示基因編碼的SEIPIN蛋白有著顯著調(diào)控細(xì)胞脂滴融合的能力。

CGL2于20世紀(jì)50年代首次報(bào)道[16]，后陸續(xù)在美洲、歐洲、非洲、亞洲等多個(gè)種族人群中發(fā)現(xiàn)[7,17～19]。迄今為止，中國僅有少數(shù)病例報(bào)道[20～22]。本文報(bào)道1例先天性全身性脂肪萎縮的中國女性患者，通過全基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)其攜帶基因復(fù)合雜合突變(c.560A>G, p.Y187C和c.565G>T, p.E189X)，利用患者皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明患者來源的細(xì)胞中SEIPIN蛋白減少，脂肪酸刺激下細(xì)胞中形成的脂滴形態(tài)偏小，加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors, HDACis)可部分挽救SEIPIN蛋白表達(dá)，最后，本文還總結(jié)了既往文獻(xiàn)中報(bào)道的基因突變位點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及臨床資料收集

患者19歲，女性，因“自幼皮下脂肪缺如伴血糖升高1年”來本院就診?；颊呔驮\前1年出現(xiàn)多飲多尿癥狀，于當(dāng)?shù)乜h醫(yī)院診斷“糖尿病”，空腹血糖在15～20 mmol/L之間波動(dòng)，患者在疾病過程中，未出現(xiàn)酮癥酸中毒。初次本院就診體格檢查：身高160 cm，體重46 kg，BMI 17.9 kg/m2，神清，精神可，全身皮下脂肪缺如，可見明顯的二頭肌、四頭肌和小腿肌肉、肌腱和皮下靜脈，黑棘皮，多毛，肝臟在右鎖骨中線右肋下2 cm處可觸及，脾在左鎖骨中線左肋下3cm處可見，血壓正常，四肢活動(dòng)正常，心肺檢查未見明顯異常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無明顯異常。父母及其弟弟體重正常，無明顯消瘦?？偰懝檀肌⒏视腿?、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、促甲狀腺激素全套、口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)、高胰島素正糖鉗夾(評(píng)估胰島素敏感性)、血清瘦素均在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)?；颊呒凹覍倬押炇鹬橥鈺狙芯糠桨附?jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 全外顯子測(cè)序及驗(yàn)證

患者及其父母，弟弟的基因組DNA均提取自采集的外周血液樣本，提取的DNA送至北京諾禾致源公司進(jìn)行基因全外顯子測(cè)序，測(cè)序返回的結(jié)果進(jìn)行Sanger一代測(cè)序驗(yàn)證，基因序列與GenBank(Gene ID: 26580)進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序結(jié)果用Sanger測(cè)序驗(yàn)證，基因5號(hào)外顯子擴(kuò)增測(cè)序引物序列，正向引物：5′-AGGGACCTGAGGAAGAAG-3′，反向引物5′-AGAATCCTGGGCTAATGG-3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及HDACi挽救實(shí)驗(yàn)

患者及年齡性別匹配正常人對(duì)照皮膚成纖維細(xì)胞提取步驟如前所述[23]。細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM (Gibco，美國)培養(yǎng)基中，含有10%胎牛血清及1%雙抗。HDACi藥物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid)、帕比司他(Panobinostat)均購于美國MCE公司，加藥濃度為2.5 μmol/L，加藥時(shí)間48 h。

1.4 蛋白質(zhì)印記(Western blot)和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)實(shí)驗(yàn)

兔抗人源SEIPIN抗體由河南醫(yī)科大學(xué)的高明明教授團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng)，羊抗兔二抗購買于Abcam公司(美國)，使用稀釋度為1∶2000。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用磁珠吸附法(Invitrogen, 美國)。貼壁細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)皿中刮取收集，加入IP裂解液，細(xì)胞蛋白4℃高速離心后收集，加入相應(yīng)一抗及磁珠孵育過夜。用重懸試劑將抗體結(jié)合的蛋白重新與磁珠分離，并后續(xù)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫熒光(immunofluorescence, IF)實(shí)驗(yàn)

成纖維細(xì)胞種在玻片上，用4%的多聚甲醛固定15 min后，用PBS緩沖液清洗3遍，再用0.2% Triton X-100固定5 min，繼續(xù)用含有1%BSA的PBS封閉1 h，分別加入一抗4℃過夜，PBS洗3遍，熒光二抗避光孵育2 h后，添加熒光抗淬劑封片并在熒光顯微鏡下成像拍片。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式展現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析方法以Student’s-test和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 患者的臨床表現(xiàn)

除了顯著的脂肪萎縮癥狀(圖1A)，核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)及雙能X線(dual energy X-ray absorptiometry, DEXA)結(jié)果顯示，CGL病人表型出明顯的皮下脂肪缺如(圖1，B和D)，而患者骨密度沒有明顯改變(圖1C)?；颊哐甯视腿?，糖化血紅蛋白均升高，分別為2.3 mmol/L和10.6%，同時(shí)伴有胰島素抵抗(空腹胰島素1001 pmol/L)，高血糖(空腹血糖16.37 mmol/L)，患者血清瘦素極低，僅只有0.14 μg/L血清膽固醇、HDL-c、FT3、FT4沒有明顯異常(表1)。OGTT證明該患者血糖升高伴隨胰島素抵抗，而患者父母及親弟弟血清葡萄糖水平與糖刺激下胰島素分泌正常(圖1G)。除此以外，高胰島素正糖鉗夾技術(shù)發(fā)現(xiàn)患者胰島素敏感性指標(biāo)葡萄糖輸注率(glucose infusion rate, GIR)僅為1.6 mg/kg/min，低于課題組前期究隊(duì)列里正常的中國成年人(平均GIR為10.9± 2.25 mg/kg/min)。這些結(jié)果均提示患者因全身性脂肪缺失而伴有嚴(yán)重的胰島素抵抗癥狀。

圖1 CGL患者臨床表型

A：CGL患者從正面、背面和側(cè)面拍攝的照片，以及手臂、腿、手指、腳、腹部和后腰部的照片。B：患者和肥胖對(duì)照受試者的腹部MRI圖像。紅色箭頭：腹部脂肪組織。C：骨密度圖像，L1～L4腰椎和髖骨。D：患者體脂成分分析。黃色，脂肪；紅色：肌肉等瘦組織；藍(lán)色：骨骼。E：c.560A>G和c.565G>C突變的測(cè)序結(jié)果。F：CGL患者的家族譜系。綠色：p.E189X突變，橙色：p.Y187C突變。正方形：男性，圓形：女性。G：OGTT 觀察患者及家屬的血糖、胰島素、C肽。

表1 CGL家系實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)

加粗?jǐn)?shù)值為異常值。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果分析顯示先證者攜帶BSCL2基因復(fù)合雜合突變

全外顯子檢測(cè)顯示先證者攜帶基因5號(hào)外顯子復(fù)合雜合突變(c.560A>G, p.Y187C和c.565G>T, p.E189X)，患者父親攜帶c.565G>T(p.E189X)突變，患者母親攜帶c.560A>G(p.Y187C)突變，患者弟弟未攜帶基因致病性突變，符合常染色體隱性遺傳致病模式(圖1，E和F)。c.560A>G突變表現(xiàn)為外顯子5的560位點(diǎn)的腺嘌呤突變?yōu)轼B嘌呤，從而引起錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)編碼的187位的氨基酸有由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?p.Y187C)，查閱1000G、ESP、ExAc等數(shù)據(jù)庫，該突變位點(diǎn)位于熱點(diǎn)突變區(qū)域，與關(guān)鍵酶的活性位點(diǎn)相關(guān)，且人群突變頻率極低，ACMG評(píng)級(jí)為可能致病突變。c.565G>T突變表現(xiàn)為565位鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?，從而引起截短突變，?duì)應(yīng)編碼的189位氨基酸轉(zhuǎn)為終止密碼子而停止翻譯，ACMG評(píng)級(jí)為致病突變。

2.3 蛋白定量與功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證突變細(xì)胞脂滴變小

SEIPIN蛋白錯(cuò)義突變p.Y187C位點(diǎn)盡管數(shù)年前在日本人群中被報(bào)道，然而相關(guān)蛋白功能沒有得到進(jìn)一步驗(yàn)證。課題組在HEK293工具細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶HA標(biāo)簽的p.Y187C突變質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染p.Y187C質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)SEIPIN含量明顯減少(圖2A)，免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步提示攜帶突變質(zhì)粒的細(xì)胞SEIPIN蛋白分布異常(圖2B)。澳大利亞楊洪遠(yuǎn)教授等報(bào)道了甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyl-trans-ferase，GPAT3)與SEIPIN蛋白互作共同調(diào)控脂滴的大小[24]，因此，本研究進(jìn)一步通過免疫共沉淀觀察突變蛋白與GPAT3的互作能力，結(jié)果表明突變SEIPIN蛋白導(dǎo)致兩者的結(jié)合減少(圖2C)。此外，來自CGL患者的皮膚成纖維細(xì)胞SEIPIN蛋白含量也明顯減少(圖2，E和G)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SEIPIN蛋白對(duì)脂滴融合能力的影響，用油酸(oleic acid, OA)刺激原代培養(yǎng)的患者及健康人的皮膚成纖維細(xì)胞，結(jié)果表明患者的成纖維細(xì)胞中形成的脂滴變小，融合能力減弱(圖2，D和F)。

圖2 SEIPIN突變的功能特性

A和B：攜帶HA標(biāo)簽p.Y187C 質(zhì)粒及野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(A)和免疫熒光觀察(B)結(jié)果。藍(lán)色：DAPI，紅色：HA-SEIPIN。標(biāo)尺：5 μm。C：免疫沉淀HA標(biāo)記的SEIPIN的蛋白質(zhì)印跡及其與標(biāo)記的GPAT3的相互作用。p.T78A：無義突變；p.Y187C：腺嘌呤到鳥嘌呤替換突變。D：OA刺激后，來自年齡性別匹配的健康志愿者(Ctrl)和CGL患者的皮膚成纖維細(xì)胞脂滴染色。藍(lán)色：DAPI；綠色：Bodipy。標(biāo)尺：5 μm。E：蛋白質(zhì)印跡觀察HDACis (SAHA或Panobinostat)處理48 h的人成纖維細(xì)胞中SEIPIN含量。F和G：脂滴染色(D)和蛋白印跡(E)統(tǒng)計(jì)分析圖，*<0.05。

2.4 組蛋白去乙?；敢种苿┩炀葘?shí)驗(yàn)證明HDACi可部分挽救SEIPIN蛋白表達(dá)

HDACi可以通過調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)與未折疊蛋白的敏感性，減少泛素通路以及溶酶體通路對(duì)于錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，HDACi在其他罕見及常見代謝病中挽救部分被錯(cuò)誤折疊的蛋白有效性得到證實(shí)，如尼曼–皮克病(Niemann-Pick Disease)[25,26]，囊性纖維化[27]，以及2型糖尿病[28]。目前文獻(xiàn)中并沒有報(bào)道過HDACi用于治療CGL，本研究使用HDACi(SAHA及帕比司他)處理患者來源的成纖維細(xì)胞，并觀察SEIPIN蛋白的穩(wěn)定性，結(jié)果表明HDACi可部分挽救SEIPIN蛋白表達(dá)(圖2，E和G)。

2.5 BSCL2基因不同位點(diǎn)突變引起不同疾病

基于本病例的發(fā)現(xiàn)，本研究總結(jié)了1954～2021年的CGL2型病例基因突變位點(diǎn)，并繪制了基因-SEIPIN蛋白關(guān)聯(lián)圖(圖3)。SEIPIN蛋白由398個(gè)氨基酸組成，包括胞質(zhì)N末端(1～26氨基酸)、C末端(264～398氨基酸)、兩個(gè)跨膜區(qū)(26～48和242～264氨基酸)和一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守中心環(huán)(48～242氨基酸)。總共約有140個(gè)不同的突變位點(diǎn)，其中65個(gè)突變位于SEIPIN蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔面?zhèn)龋?8個(gè)突變位于蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿側(cè)以及17個(gè)突變位于蛋白跨膜區(qū)。涉及的病種包括：先天性全身性脂肪萎縮；遠(yuǎn)端遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(distal hereditary motor neuropathies，DHMN)；腓骨肌萎縮癥(Charcot- Marie-Tooth disease, DMT)以及多種疾病并存。同時(shí)，本研究統(tǒng)計(jì)了不同大洲的突變頻率，美洲最多(70%)，其次為歐洲(20%)，亞洲(9%)，大洋洲(1%)。

圖3 BSCL2基因突變位點(diǎn)到SEIPIN蛋白及臨床疾病的關(guān)聯(lián)圖

SEIPIN蛋白包括胞質(zhì)N末端(1～26氨基酸)、C末端(264～398氨基酸)、兩個(gè)跨膜區(qū)(26～48和242～264氨基酸)和一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守中心環(huán)(48～242氨基酸)。顏色表示疾病的類別，綠色：先天性全身性脂肪萎縮；藍(lán)色：遠(yuǎn)端遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病；紅色：腓骨肌萎縮癥；黑色：多種疾病并存；灰色：未找到相應(yīng)的臨床疾病。數(shù)字代表不同的大陸。(1)：美洲；(2)：歐洲；(3)：非洲；(4)：亞洲；(5)：大洋洲。下劃線：中國報(bào)道的病例。三角：本例患者突變位點(diǎn)。

3 討論

本文報(bào)道了1例先天性全身性脂肪萎縮年輕女性病例，患者因“自幼皮下脂肪缺如伴血糖升高”就診，血清瘦素水平極低僅有0.14 μg/L。全身皮下脂肪缺如，可見明顯的二頭肌、四頭肌和小腿肌肉、肌腱和皮下靜脈，同時(shí)伴有胰島素抵抗，高血糖，高脂血癥，黑棘皮，多毛。攜帶基因復(fù)合雜合突變(c.560A>G, p.Y187C和c.565G>T, p.E189X)，體外實(shí)驗(yàn)證明，突變導(dǎo)致SEIPIN含量減少，降解增多，HDACi可以增加突變蛋白穩(wěn)定性，保留部分突變蛋白功能。

中國人口龐大，CGL病例報(bào)道卻僅有數(shù)例，提示罕見基因突變引起的CGL疾病存在漏診或誤診的現(xiàn)象，如何區(qū)分單純營養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病如糖尿病，腫瘤造成的脂肪萎縮，對(duì)于有效診治CGL至關(guān)重要。臨床上存在4中類型的CGL，由基因突變導(dǎo)致的CGL2是最常見的一種[29]。CGL2幾乎丟失了全身性的脂肪組織。這些患者被報(bào)道部分患有心肌病、神經(jīng)遲滯、早死和智力缺損、較低的血瘦素和脂聯(lián)素水平[7,30]。Nishiyama等[31]在2009年報(bào)道了一名3個(gè)月的患有CGL的日本嬰兒攜帶p.Y187C純合突變。2007中國最早報(bào)道了一個(gè)7歲CGL男孩攜帶SEIPIN蛋白p.E189X純合突變，該男孩表現(xiàn)出皮下脂肪普遍缺乏、明顯的肌肉征、臉頰凹陷、黑棘皮、背部多毛、肝脾腫大、陰莖硬結(jié)、心肌功能異常、左心室肥大、輕度智力低下，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示患兒有胰島素抵抗、高甘油三酯血癥和脂肪肝。這些癥狀與本文的CGL患者十分相似，然而也存在部分不同，本文患者的智力和神經(jīng)系統(tǒng)方面也未見明顯異常。由此推測(cè)，相較于p.E189X截?cái)嗤蛔?，p.Y187C錯(cuò)義突變可能仍然保留一些 SEIPIN 功能。

SEIPIN蛋白具有398個(gè)氨基酸，包含胞質(zhì)N端、C端、兩個(gè)跨膜區(qū)和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中的一個(gè)保守的中心環(huán)?；?c.565G>T)的突變導(dǎo)致 189 位的翻譯終止密碼子而不是正常的谷氨酸 (E189X)。因此，推測(cè)無義突變 E189X導(dǎo)致截短的蛋白質(zhì)丟失后續(xù)209個(gè)氨基酸，引起ER腔面、第二跨膜結(jié)構(gòu)域區(qū)和C端結(jié)構(gòu)區(qū)缺失，蛋白功能完全喪失。錯(cuò)義突變p.Y187C為SEIPIN蛋白中的單個(gè)氨基酸變化，p.Y187C 位于保守的中央環(huán)，類似于A212P結(jié)構(gòu)。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，與在相同啟動(dòng)子下表達(dá)的野生型SEIPIN蛋白相比，Y187C的蛋白水平顯著降低，這些結(jié)果表明p.Y187C突變體可能會(huì)影響SEIPIN蛋白的穩(wěn)定性。

脂肪營養(yǎng)不良的治療包括生活方式干預(yù)和個(gè)體化治療，目前CGL尚無特效療法，主要以對(duì)癥治療為主。貝特類降脂藥適用于患有極度高甘油三酯血癥的患者[32]，應(yīng)監(jiān)測(cè)本研究患者的甘油三酯水平以確定貝特類降脂藥的必要性。合并糖尿病的CGL患者必須進(jìn)行降糖治療。大多數(shù)CGL患者可能需要大劑量的胰島素，以及包括二甲雙胍和磺脲類藥物在內(nèi)的口服藥物[33]。此外，還需要考慮糖尿病的并發(fā)癥。住院期間，患者接受了胰島素泵治療，最大劑量為每天126 IU?？崭寡?～6 mmol/L，餐后血糖5～9 mmol/L。出院后，目前接受門冬胰島素(18U-18U-16U)和甘精胰島素(72U)治療?？崭寡窃?～6 mmol/L之間波動(dòng)，餐后2 h血糖在7～ 8 mmol/L之間波動(dòng)。瘦素由脂肪組織分泌，CGL2患者的血清瘦素水平明顯低于健康個(gè)體[30]，基于美曲普汀(人類瘦素的重組類似物)的瘦素療法備受關(guān)注。美曲普汀已被證明可以顯著改善代謝紊亂，包括糖尿病、高甘油三酯血癥和肝脂肪變性[33]，以及顯著改善脂肪營養(yǎng)不良和嚴(yán)重瘦素缺乏癥患者的糖脂代謝[34～36]，然而，這些治療僅降低血漿和肝臟甘油三酯水平，針對(duì)血糖改善仍較局限[37]。

除了對(duì)癥治療，尋找新的藥物來減少突變蛋白的降解也至關(guān)重要。組蛋白脫乙酰酶通過組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和伴侶蛋白(包括Hsp90)的翻譯后修飾來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[38]。通過改變這些蛋白質(zhì)的乙?；?，HDACis可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在熱休克反應(yīng)中的基因表達(dá)，并減少泛素化和蛋白酶體降解以恢復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的功能。SAHA是第一個(gè)獲批用于臨床治療晚期皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的HDACi[39]。據(jù)報(bào)道，HDACis可通過維持部分突變的蛋白質(zhì)活性來治療包括戈謝病和尼曼–皮克病在內(nèi)的罕見疾病[40,41]。本文還研究了SAHA和帕比司他這兩種臨床獲批的HDACis，體外使用的藥物濃度與患者的SAHA血清濃度一致[42]。用SAHA或Panobinostat處理的患者來源的成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析顯示SEIPIN蛋白顯著增加。然而，這種效應(yīng)尚未在人體中得到證實(shí)，結(jié)合現(xiàn)有報(bào)道，HDACis治療CGL的有效性仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本文報(bào)道了1例攜帶基因復(fù)合雜合突變(p.Y187C和p.E189X)的CGL2患者?；颊弑憩F(xiàn)出嚴(yán)重的脂肪營養(yǎng)不良與高血糖，但沒有明顯的心肌病及智力低下?；蛲蛔儗?dǎo)致SEIPIN蛋白含量下降、分布異常，HDACis可部分挽救SEIPIN蛋白表達(dá)。本研究豐富了CGL2的臨床表型譜，并總結(jié)了CGL2的致病基因突變譜，有助于提高臨床醫(yī)生對(duì)CGL2的診治水平和對(duì)致病機(jī)制的理解。

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A study of congenital generalized lipodystrophy (CGL) caused bygene mutation

Jingya Ye1, Aijie Huang1, Zhenzhen Fu1, Yingyun Gong1, Hongyuan Yang2, Hongwen Zhou1

Congenital generalized lipodystrophy (CGL) is an extremely rare genetic disease mainly characterized by absence of whole-body adipose tissue and metabolic dysfunctions such as insulin resistance, diabetes mellitus, hypertriglyceridemia, hepatic steatosis, and acanthosis nigricans. In this study, we reported a novel case of a young woman patient with CGL. The patient came to the hospital for early-onset lipodystrophy and diabetes. She was 19-year-old with a height of 160 cm, a weight of 46 kg, BMI of 17.9 kg/m2, and a serum leptin level of 0.14 μg/L. Genomic DNA was extracted from blood samples of the patient and her family members, including her mother, father and brother. Genetic analysis revealed compound heterozygous mutations of thegene (c.560A>G and c.565G>T) in the patient. Her father carried a heterozygous mutation (c.565G>T), and her mother carried a heterozygous mutation (c.560A>G) in thegene. The mutant p.Y187C plasmid was transfected into HEK293T cells. The protein expression of SEIPIN and its interaction with glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT3) were observed to be reduced. In addition, based on primary cultured skin fibroblasts from the patient, SEIPIN protein was decreased, and lipid droplets were much smaller when fatty acid was stimulated compared with those observed from healthy subject controls. However, histone deacetylase inhibitors (HDACis) was found capable of rescuing SEIPIN protein in fibroblasts of the patient. In addition, we further summarized and discussed gene mutations ofreported in the current literature. Collectively, these findings have expanded the clinical phenotype and pathogenic gene spectrum of CGL, which might help clinicians to achieve better management of lipodystrophy.

CGL;/SEIPIN; fibroblast; HDACi; diabetes

2022-06-30;

2022-09-12;

2022-09-26

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2018YFA0506904，2019YFA0802701)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：82170882，91854122)資助[Supported by the National Key Research and Development Program(Nos. 2018YFA0506904,2019YFA0802701), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 82170882, 91854122)]

葉靜雅，博士，醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌與代謝病。E-mail: yezi88999@163.com

周紅文，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：內(nèi)分泌與代謝病。E-mail: drhongwenzhou@njmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-222

(責(zé)任編委: 孟卓賢)