盧珮

（崇左市人民醫(yī)院，廣西 崇左，532200）

結(jié)核病作為全球性公共健康問題，截止至2020 年，全球新發(fā)結(jié)核病例數(shù)高達700 萬例。成功診斷、治療可促使每年上百萬結(jié)核病患者避免死亡，但最新數(shù)據(jù)顯示[1]，據(jù)統(tǒng)計2000～2020 年可避免5400 萬人死亡。當前對結(jié)核病檢出持續(xù)存在一定漏洞。目前結(jié)核分枝桿菌特異性抗原分析特點為簡單、成本低、操作方便及測定快速等優(yōu)點，成為篩查結(jié)合病例有利方法，特別為中國、印度等資源受限國家[2]。目前對結(jié)核病診斷血清學研究領(lǐng)域中，國內(nèi)外學者致力于尋找在結(jié)核病患者中能引起強烈抗體反應潛在血清診斷抗原，而新型結(jié)核病免疫學實驗室檢測技術(shù)不斷出現(xiàn)。文章就對近些年來國內(nèi)外結(jié)核病免疫學實驗室檢測方面技術(shù)進展如下分析，以促進優(yōu)良實用的結(jié)核病診斷新技術(shù)在我國各級醫(yī)療機構(gòu)普及應用，現(xiàn)報道如下。

1 結(jié)核菌素皮膚試驗（TST）

TST 為一項遲發(fā)型超敏反應免疫試驗。而結(jié)核菌素作為結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物，可引起特異性反應。包括舊結(jié)核菌素、純蛋白衍生物兩種。Koch 發(fā)明舊結(jié)核菌素，從結(jié)核菌培養(yǎng)基提取，含有結(jié)核蛋白外并包括培養(yǎng)基及菌體等成分[3]。純蛋白衍生物則是由Seibert 制備，包括結(jié)合蛋白，依據(jù)制取來源并分為數(shù)種。通過一定量PPD 經(jīng)皮注射至體內(nèi)，觀察局部皮膚紅腫硬結(jié)程度并判斷反應強度[4]。當前認為TST 對活動性結(jié)核病及潛伏性結(jié)核感染診斷價值高。同時，伴隨著現(xiàn)階段卡介苗接種范圍擴大，上述試驗結(jié)果陽性并非可直接確診為結(jié)核病，降低結(jié)核菌素試驗陽性率。研究指出[5]，結(jié)核菌素試驗相比較其他檢測手段，陽性率高達76.5%，靈敏度為88.2%，特異性低至34.4%，表明TST 具有較高假陽性率。同時，種類不同PPD 試驗結(jié)果也存在著不同。但TST 低廉、方便及快速特點下，成為欠發(fā)達地區(qū)結(jié)核病檢測主要手段。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA 法）

ELISA 原理是指抗原或抗體吸附在特殊固相載體表面，吸附于載體上抗原或抗體會保留原有免疫活性，隨后添加樣本，并對樣本中受檢物質(zhì)與固相化物質(zhì)因特異性的抗原抗體反應而相互結(jié)合。加入受檢物質(zhì)后并依據(jù)洗板除去非特異性結(jié)合物，添加既有酶活性又有免疫學活性酶標記抗原及抗體。再次洗板并添加底物與酶反應顯色后，利用酶標儀讀取酶標板孔中光密度值，依據(jù)光密度值并定性、定量分析。實驗表明融合性的MPT64-Rv1985c 抗原可有效鑒別活動性肺結(jié)核、潛伏感染者，ESAT-6 可區(qū)分BCG 接種者及結(jié)核菌感染者。同時上述方式應用上有一定局限性，抗原抗體反應時，會因個體差異、邊緣效應、抗原本身濃度及PH 等因素對兩者結(jié)合效率造成影響。結(jié)核特異性抗原ELISA 檢測靈敏度為60%～85%，特異度為80%～95%[6]。敏感性范圍變化上，反應酶聯(lián)免疫吸附試驗不穩(wěn)定性?？焖?、簡便、準確血清學免疫診斷方式應用上受到臨床廣泛關(guān)注，可作為ELISA 發(fā)展指明方向。

3 斑點免疫膠體金滲濾法（TB-DOT）

TB-DOT 原理是采取斑點免疫膠體金滲濾技術(shù)并將提純的Mtb 特異性膜蛋白作為抗原，降低固定于硝酸纖維膜上，并將含有抗外膜蛋白抗體被檢血清標本時，在毛細管層析作用下與特定抗原結(jié)合，加入吸附作用膠體金顆粒，依據(jù)反應是否出現(xiàn)紅色斑點判斷是否感染結(jié)核病[7]。當前特異性膜蛋白應用上包括MPB64、ESAT-6、14kD 等抗原。結(jié)核分枝桿菌抗體檢測中膠體金免疫層析法應用期間具有顯著優(yōu)勢，如耗費時間短、成本低以及操作簡便等，被廣泛用于大樣本量篩查中，但仍然存在一定假陽性、假陰性。報道提示[8]，對結(jié)核抗體檢測敏感性、特異性分析上為10%～90%、47%～100%，而不同研究上試劑、方法之間有一定差異性[9]。因此，上述檢測項目歸為一類輔助診斷方式，配合痰細菌學、影像學及臨床表現(xiàn)等，可提高臨床結(jié)核病診斷率，協(xié)助應用于早期診斷中，可指導患者擬定出合理治療方案，改善結(jié)核病患者預后。

4 結(jié)核感染T 細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）

T-SPOT.TB 定義：利用機體T 淋巴細胞并受到毒力的TBAg刺激后，活化分泌結(jié)核分枝桿菌特異性γ干擾素效應T 細胞，并檢測、計數(shù)效應T 細胞數(shù)量，用于評估機體是否感染結(jié)核分枝桿菌[10]。試驗中，TBAg 可作為致病結(jié)核分枝桿菌RD1 區(qū)上Rv3874 編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10、Rv3875 編碼的早期分泌靶向抗原6。研究指出[11]，T-SPOT.TB 試驗下，對378 例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者、824 例體檢健康者檢測結(jié)果得出，T-SPOT.TB結(jié)果下，陽性診斷活動性結(jié)核敏感性、特異性維持在91.0%、75.2%。對結(jié)果深度分析結(jié)果得出，依據(jù)TBAg/植物血凝素斑點數(shù)的比值并對活動性結(jié)核、潛伏性結(jié)核感染區(qū)分，整體效果優(yōu)于T-SPOT.TB 斑點技術(shù)對陽性結(jié)果判斷，并對該項比值診斷肺外結(jié)核時有一定參考價值[12]。伴隨著近些年來T-SPOT.TB 不斷更新、應用，新型T 細胞檢測技術(shù)（ELISPOT-IL-2 技術(shù)）廣泛應用，基于T-SPOT.TB 基礎(chǔ)上，以原核表達結(jié)核分枝桿菌標準菌株P(guān)PE36-p27 蛋白為刺激原，可刺激機體產(chǎn)生細胞因子IL-2，并通過固相載體上包被的抗人IL-2 單克隆抗體，后加入生物素標記IL-2 單克隆抗體，分別結(jié)合后并添加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，形成固相抗人IL-2 單克隆抗體-待測抗原-生物素標記IL-2 單克隆抗體-HRP 標記的鏈霉親和素復合物，洗滌后顯色，并對形成斑點觀察。伴隨著T-SPOT.TB 多種改進技術(shù)在后期進一步優(yōu)化，被用于結(jié)核病診療，上述新方法中仍需進一步深入研究。

5 蛋白芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)定義：將不同目標蛋白質(zhì)依據(jù)預先設置排列順序固定于各種載體表面，并做成微陣列檢測芯片，分析抗原抗體高度特異性結(jié)合特點，并對特定熒光物質(zhì)的針對芯片上蛋白質(zhì)TBAg 或抗體與檢測芯片反應，洗滌并去除未與芯片上蛋白質(zhì)特異性結(jié)合熒光抗原、抗體后，利用激光共聚掃描技術(shù)、熒光掃描儀檢測芯片上各點熒光強度，依據(jù)熒光強度，并分析各種待測樣本中蛋白質(zhì)。目前蛋白質(zhì)芯片被用于尋找新藥作用靶點、腫瘤標志物檢測及科研等方面[13]。研究指出[14]，蛋白質(zhì)芯片篩選腦脊液120 種細胞因子，并檢測83 種細胞因子，分析62 例患者腦脊液因子含量，可得出γ-干擾素、白介素-8 及單核細胞趨化蛋白-2 作為結(jié)核性腦膜炎診斷性細胞因子。研究指出[15]，蛋白質(zhì)芯片檢測420 例結(jié)核病患者血液標本，結(jié)果顯示，涂陽肺結(jié)核陽性率76.15%，結(jié)核蛋白質(zhì)芯片固定TBAg 蛋白16000、38000、結(jié)核分枝桿菌特異性細胞壁脂多糖抗原三抗體聯(lián)合檢測下，結(jié)核病陽性率、診斷準確率顯著提升，被用于結(jié)核病診斷中有一定輔助價值。但近些年來結(jié)核蛋白質(zhì)芯片法作為一類新型研究方式，對臨床診斷、療效評估及科學研究仍需進一步分析。

結(jié)核病免疫學檢測手段日趨豐富，多種免疫檢測方式應用及聯(lián)合成為結(jié)核病診斷新趨勢。但目前臨床應用有一定局限性，精確、可靠及快速及低廉檢測手段仍需探索設計。同時，部分免疫學檢測仍需臨床大規(guī)模探索驗證，才能不斷改良及完善。盡管針對結(jié)核病免疫學檢測發(fā)展過程中仍然面臨挑戰(zhàn)，但伴隨著結(jié)核病免疫學機制研究及生物學發(fā)展不斷深入，結(jié)核病免疫檢測被廣泛應用，對結(jié)核病早診斷、早干預及早治療具有重要意義?？偟膩碚f，結(jié)核病免疫學檢測對結(jié)核病防治意義深遠，同時仍需科學家發(fā)現(xiàn)更加有效檢測方法。