劉廣寶 康冉冉 王麗 高媛

自Mullis于1985年首次發(fā)明PCR技術以來，PCR技術已經在臨床診斷中得到廣泛應用，現已衍生出數十種PCR技術，如原位PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR(digital PCR，dPCR)等[1-2]。dPCR屬于第三代PCR技術，自20世紀末提出以來，作為一種絕對定量分析技術在生物標志物檢測、臨床診斷等方面表現出巨大的應用潛力，引起生物、醫(yī)學等領域的高度重視并得以迅速發(fā)展[3-5]。隨著dPCR技術不斷改進和完善，其應用范圍也進一步拓展，目前該技術主要應用于癌細胞突變位點、病原微生物及食品成分分析等相關領域的檢測[3,6-7]。與傳統(tǒng)PCR技術相比較，dPCR不依賴標準曲線和標準品，可直接檢測樣品中核酸的原始濃度，且技術靈敏度更高、耐受性更強，并且快速簡單、價格低廉[8]。按照分液技術的不同，目前dPCR主要分為三種：以孔板為載體的微孔板數字PCR、以“油包水”微滴為特點的微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和以芯片為反應倉的微流控芯片數字PCR。其中，ddPCR利用油包水乳化微滴顆粒作為反應器進行檢測，其研究和應用最為廣泛[9]。

產前診斷(prenatal diagnosis)是運用各種技術手段，在出生前對胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進行檢測診斷，對可治性疾病可選擇適當時機行宮內治療；不可治療的疾病做到知情選擇[10]。目前ddPCR技術已開始應用于產前診斷領域，本文就ddPCR技術在產前診斷中的應用進展進行綜述。

一、原理

ddPCR是將總反應體系分為2萬個獨立的PCR反應單元，每個反應單元為體積相近的納升級微滴，微滴為“油包水”的結構，每個微滴包含或者不包含1個或多個拷貝的靶分子，經單分子模板PCR擴增后，利用探針上的特異性熒光信號對每個微滴逐一檢測，其中包含靶分子的微滴熒光信號為陽性，不包含靶分子的微滴熒光信號為陰性[11]，根據泊松分布的原理，由檢測的熒光信號陽性及陰性的微滴數，即可計算出樣本中的靶分子數[4,7]。利用統(tǒng)計學方法計算原始樣本中靶基因的拷貝數。

二、優(yōu)勢

與熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)及其他分子診斷技術相比，ddPCR在靈敏度、絕對定量、耐受性等方面具有一定的優(yōu)勢[12]。

1.高靈敏度：ddPCR技術把不同DNA模板分隔在2萬個油包水小微滴中，每個微滴獨立檢測目的序列，大大提高了檢測的靈敏度。在無創(chuàng)產前領域可準確檢測孕婦外周血血漿胎兒的游離核酸(cell-free DNA，cffDNA)含量僅為2%甚至更低的樣本，其檢測下限明顯優(yōu)于qPCR等檢測技術[13-14]。

2.絕對定量：該技術通過泊松分布原理，可以由公式λ= - ln(1- k/ n)計算出靶分子的起始濃度，其中k為陽性微滴數，n為微滴總數，λ為平均微滴數[15]。與qPCR相比，ddPCR通過終點測量收集熒光信號，其結果不依賴于Ct值和標準曲線，有效地避免了因起始濃度低而造成檢測結果準確性較差的缺陷[8]。

3.高耐受性：對血液、組織、羊水等樣本進行檢測時，在相應的PCR反應體系中，可能會存在擴增反應的抑制劑、母源性基因序列以及其他因素的干擾，一定程度上會對檢測結果的準確性造成影響。ddPCR技術微滴化的過程中，干擾因素和靶分子均勻的分配到每個反應單元，從而顯著降低了干擾因素的影響，同時又以終點信號的有無為判斷依據，不受擴增效率的限制，有效地提高了對干擾因素的耐受能力[5]。

此外，與其他分子診斷技術相比，ddPCR還具有重復性強、檢測周期短、價格低廉等優(yōu)勢[16]，這些優(yōu)點使得ddPCR能夠在產前診斷中得到很好的應用。

三、ddPCR在產前診斷中的應用

據2012年衛(wèi)生部發(fā)布的官方數據，中國出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷數高達90萬例[17]，給家庭和社會帶來巨大的精神和經濟負擔，開展產前篩查與診斷，及早發(fā)現嚴重致殘或致死性異常是防止出生缺陷發(fā)生的重要措施。隨著分子遺傳學的發(fā)展，產前診斷技術不斷朝著快速、準確、高靈敏度、無創(chuàng)傷的方向發(fā)展。

1.胎兒染色體非整倍體的產前檢測：21-三體綜合征又稱為唐氏綜合征，是一種常見的染色體非整倍體疾病，活產新生兒的發(fā)病率為1/600～1/800，患兒通常表現為特殊面容，智力障礙，生長發(fā)育遲緩和肌張力減退等[18]。目前臨床上通常聯合孕婦年齡、超聲學檢查和血清學檢查進行21-三體綜合征產前篩查，但該方法存在一定的假陰性率和較高的假陽性率[19-20]。1997年Ioan等[21]在孕婦外周血中檢測到Y染色體上特異性DNA序列，證實孕婦外周血中存在胎兒游離核酸，這一發(fā)現為無創(chuàng)產前檢測奠定了基礎。無創(chuàng)產前檢測技術(non-invasive prenatal testing，NIPT)就是利用孕婦外周血胎兒游離DNA對胎兒的某些遺傳信息進行檢測，是一種無創(chuàng)操作，避免了有創(chuàng)操作帶來的不良妊娠風險。近年來，隨著高通量測序技術(next-generation sequencing，NGS)的發(fā)展，無創(chuàng)產前檢測日益完善，并在孕婦染色體非整倍體疾病、單基因遺傳病等方面廣泛應用[22]。但是NGS成本較高、操作復雜、檢驗周期長、數據解讀困難，給疾病檢測帶來一定的困難，而ddPCR在痕量樣本、低頻突變、拷貝數變異等檢測上的準確性、靈敏性和穩(wěn)定性，使其在cffDNA的檢測上具有一定的優(yōu)勢[23]。

Allach等[15]人應用ddPCR，設計出一種通過檢測孕婦外周血血漿中游離核酸(cell-free DNA，cfDNA)中胎兒游離核酸(cell-free fetal DNA，cffDNA)的含量來鑒別胎兒是否為染色體非整倍體的方法，并對213例孕婦血漿DNA進行了驗證實驗，利用一組針對21號染色體和參照染色體(1號染色體)的水解探針，對孕婦血漿中cffDNA進行分子計數。實驗結果證實，即使樣本中目的基因的含量低至5%，ddPCR技術依然可以準確的區(qū)分21-三體組和正常組。Lee等[24]人用157例陰性樣本和三個T21陽性孕婦的四種不同來源的DNA樣本(羊水、細胞系、全血和孕婦血漿)作為標準，以此確定高風險的閾值，進而對877例孕婦的血漿樣本行ddPCR的檢測，再利用金標準(羊膜腔穿刺等)對每例孕婦行產前診斷。通過比較，ddPCR檢測的準確率高達99.66%。

以上研究表明，具備靈敏度高、簡便易行、檢測周期短等優(yōu)點的ddPCR技術，有望成為一種產前檢測21-三體的新選擇，值得在臨床上推廣[15,20,24-25]。

2.單基因遺傳病產前檢測中的應用：ddPCR技術在單基因遺傳病檢測方面尚處于起步階段，鄒洋等[16]運用ddPCR技術對56個脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)家系共138例樣本(其中121例外周血樣本，13例羊水樣本，2例臍帶血樣本，2例絨膜絨毛樣本)行SMN1基因第7外顯子拷貝數檢測，其結果與多重連接依賴性探針擴增技術(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)——目前國際推薦臨床應用的SMN1基因第7外顯子拷貝數變異的檢測技術——檢測的結果一致，為SMA臨床基因檢測和產前診斷提供了新方法。

徐佩文等[26]應用ddPCR技術對一白化病家系和苯丙酮尿癥家系孕婦進行無創(chuàng)產前檢測，通過檢測孕婦外周血漿cffDNA以確定胎兒是否遺傳了父親的致病基因突變位點，結果顯示ddPCR技術檢測結果與羊水DNA Sanger測序結果一致。Emmanuel等[27]應用ddPCR技術對1例囊性纖維化高風險的家系進行無創(chuàng)產前檢測結果顯示胎兒攜帶父源性突變位點，不能排除子代患囊性纖維化的可能，須進一步行有創(chuàng)產前診斷，檢測是否攜帶母源性突變位點。

Camunas-Soler等[28]利用ddPCR技術檢測cffDNA的方法，設計了一套針對單基因遺傳病的無創(chuàng)產前檢測技術，并用之檢測9名有生育單基因疾病患兒風險的孕婦血液樣本，所涉及的疾病包括血友病、囊性纖維化、鳥氨酸氨甲酰轉移酶缺乏癥、β-地中海貧血、甲羥戊酸激酶缺乏癥、乙酰膽堿受體缺乏癥和非綜合征型耳聾等。結果顯示2例陽性7例陰性，由新生兒測試予以證實，該技術在孕11周且胎兒DNA含量僅為3.7%時即可檢測成功。

孫藝佳等[29]應用ddPCR技術建立了一種檢測母體血漿cffDNA中父源CD41-42基因突變的β-地中海貧血的方法，適用于夫婦為非同型β-地中海貧血基因突變攜帶者，排除父源CD41-42基因突變的無創(chuàng)產前檢測，并對20例孕婦血漿樣本進行檢測，結果與確診結果完全相符。

綜上，對于父源性致病基因突變的單基因遺傳病，可采用ddPCR技術對胎兒是否攜帶致病基因行無創(chuàng)產前檢測，在不排除是否攜帶母源性致病基因的前提下，可有效避免有創(chuàng)產前診斷。

3.在鑒定胎兒性別和血型中的應用：Rh血型系統(tǒng)是臨床輸血醫(yī)學最復雜最重要的系統(tǒng)之一，有D、E、C、c、e五種抗原，其中D抗原免疫原性最強，臨床上將缺乏D抗原者成為Rh陰性[30]。Rh陰性婦女懷有D抗原陽性胎兒，可產生初次免疫，再次懷有D抗原陽性胎兒時會造成新生兒溶血病，胎兒期即可出現嚴重溶血、貧血全身水腫，甚至死胎。因Rh陰性血型稀少，對孕產婦產后出血等危急情況的輸血治療帶來很大的難度。如何早期對Rh陰性孕婦進行產前診斷，對防治Rh血型引發(fā)的新生兒溶血病具有重要的意義[30-31]。

Madgett等[13]用ddPCR和qPCR兩種方法對46例RhD陰性孕婦的血液樣本行產前診斷，以RhD基因第5外顯子(RhD5)為靶片段時，ddPCR(100%)的靈敏度明顯高于qPCR(83%)。而且針對cffDNA含量低于2%的樣本，ddPCR的靈敏度均為100%，qPCR卻無法達到相同的水平。

某些伴性遺傳疾病的發(fā)生與胎兒性別密切相關，如杜氏肌營養(yǎng)不良、血友病等，為降低后代患病風險，對已明確攜帶相關致病基因的夫婦可在孕期進行胎兒性別鑒定，或直接行胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing,PGT)。D′Aversa等[14]采用ddPCR技術對29例孕早期的孕婦血漿中cffDNA行胎兒性別鑒定，結果顯示ddPCR可準確的檢測出全部孕婦血漿中SRY基因靶點，表明ddPCR是一種靈敏、可靠的胎兒性別鑒定技術。

4.在其他相關領域的應用：qPCR具有檢測成本低廉、操作便捷且結果準確等優(yōu)點，是目前最常用的核酸檢測技術。耿娟等[32]采用ddPCR技術和短串聯重復序列的qPCR技術，分別檢測40組產前診斷標本母體細胞污染情況，比較兩種方法結果的準確性和靈敏度，ddPCR技術(≥1.56%)明顯優(yōu)于qPCR技術(≥6.25%)。

四、小結與展望

ddPCR技術作為一項新型生物檢測技術，在無創(chuàng)產前檢測中，發(fā)揮其在低含量核酸樣本檢測高靈敏度的優(yōu)勢，具有十分重要的臨床意義和應用價值[5,33]。當然，ddPCR在臨床應用上還存在諸多局限性，如對整倍體變異、染色體平衡易位、基因倒位或大片段缺失等檢測的準確性還有待提高[34-35]。但隨著應用研究的逐步深入和完善，ddPCR已被越來越多的科研工作者所熟知和使用，其適用范圍會進一步擴展，檢測的準確性、時效性和廉價性也會逐步提高，進而在產前診斷中發(fā)揮更大的作用。