歐可，彭秀達，費書珂

（南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 肝膽胰脾外科，湖南 衡陽 421001）

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injure，HIRI）廣泛存在于失血性休克復蘇、創(chuàng)傷、肝移植、肝切除等臨床過程中[1-2]。目前HIRI的發(fā)病機制主要為兩個階段，最初的細胞損傷由缺血缺氧直接導致，主要改變是代謝性酸中毒和細胞內鈣水平的升高以及相應的損傷；隨后當血液再灌注回流時，活性氧的異常蓄積和庫普弗細胞、淋巴細胞、中性粒細胞的激活會導致后續(xù)一系列的細胞反應[3]。其中炎癥反應的傳播和進一步組織損傷的機制涉及細胞因子/趨化因子、多種細胞類型和各種信號通路的復雜相互作用[4-5]。隨著研究的逐步深入，HIRI中越來越多的信號通路和機制被證實或發(fā)現(xiàn)，有的通路通過促進免疫細胞激活加重肝細胞損傷；有的通路通過介導適應性應激或抑制免疫細胞激活對肝細胞產(chǎn)生保護；有的通路則根據(jù)調控通路中不同途徑起到雙向調節(jié)的作用。目前HIRI相關分子機制的研究仍處于由臨床現(xiàn)象到動物實驗的轉化，因此為了更好地實現(xiàn)基礎實驗到臨床的轉化，我們需要更進一步的深入了解在HIRI中信號通路各部分的調控過程、相關效果以及各個通路的相互作用。本文根據(jù)信號通路在HIRI被激活后對機體的作用，從損傷性作用、保護性作用、雙向調節(jié)、相互串擾四個方面對近年來HIRI相關通路的最新研究進行介紹，為后續(xù)研究提供參考。

1 HIRI的損傷性相關信號通路

1.1 HIPPO/YAP

MST1/2-LAST1-YAP（mammalian Ste20-like kinase1/2-large tumor suppressor-yes-Associated Protein，MST1/2-LAST1-YAP）通路即我們俗稱的河馬通路，最初被發(fā)現(xiàn)是作為調節(jié)器官大小的因子。河馬信號通路的功能主要通過調節(jié)YAP的磷酸化和失活，既往研究表明YAP在人惡性腫瘤中被廣泛激活。近年來有研究表明內源性YAP在小鼠HIRI中的表達有變化，HIRI促進河馬核心激酶信號級聯(lián)（MST1/2-LAST1）并磷酸化YAP，使YAP的核轉位減少，增加了Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）驅動的炎癥[6]。同時當YAP的核轉位減少后，抗氧化基因的表達減少，增加了活性氧的蓄積導致肝細胞的凋亡和壞死，加重HIRI[7]。在驗證HIRI動物體內實驗的同步低氧-復氧應激的原代肝細胞實驗中，促進YAP的表達能減少肝細胞的死亡，并保存了線粒體的完整性，同時抑制YAP的表達加劇肝細胞的死亡[7]。Li等[8]的研究表明，在小鼠HIRI模型中骨髓間充質干細胞通過使MST1/2和LATS1的磷酸化減少，降低NLRP3/Caspase-1活性和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的釋放，增加M2巨噬細胞表型，使河馬信號通路的表達受到抑制，從而減輕HIRI。同時有實驗發(fā)現(xiàn)加入YAP激動劑溶血磷脂酸能夠抑制小鼠HIRI模型中巨噬細胞的募集和和活化，緩解小鼠HIRI[9]。

1.2 HMGB1/TLR4

高遷移率族蛋白B1（high mobility group box protein 1，HMGB1）是一種真核細胞中重要的損傷相關的分子，具有細胞因子樣活性，并通過與TLR4受體復合體中的髓樣分化蛋白-2結合介導無菌性炎癥[10-11]。在小鼠HIRI期間，HMGB1可來自損傷壞死的肝細胞中被動釋放，也可被部分激活的細胞主動分泌。HMGB1與TLR4結合會激活細胞內信號級聯(lián)反應，該過程包括激活后的TLR4受體募集并活化髓樣分化因子88，活化后的髓樣分化因子88同時募集著IL-1 受體相關激酶，導致絲裂原活化蛋白激酶通路的激活，以及NF-κB（nuclear factor kappa-B）的核轉位和下游基因的轉錄，使免疫細胞的募集與激活增加以及炎癥因子和趨化因子分泌增多，進而促進炎癥、細胞死亡和器官損傷，加重HIRI[10]。有研究表明，在小鼠HIRI模型中重組人血栓調節(jié)蛋白（RTM）能通過抑制HMGB-1/TLR4 通路，使肝細胞中HMGB1和TLR4的釋放減少，對HIRI起保護作用[12]。同時解天軍通過實驗證明，甘草次酸能夠通過抑制小鼠HIRI中HMGB-1/TLR4 通路的激活，降低HMGB1的表達，減少炎癥因子的釋放及中性粒細胞的浸潤，實現(xiàn)減輕HIRI[13]。

1.3 mTOR/S6K/HIF-1α

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）作為非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶在新陳代謝、細胞生長和增殖等過程中起著重要的調節(jié)作用[14]，mTOR的作用靶點是兩個不同的多蛋白復合體，即mTORC1（mTOR complex1）和mTORC2（mTOR complex2）[15]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）主要是在細胞凋亡中發(fā)揮作用。在小鼠HIRI過程中，mTOR/S6K/HIF-1α通路會被激活，mTOR的靶蛋白mTORC1被激活后會磷酸化激活S6K（ribosome protein subunit 6 kinase），雖然HIF-1α的穩(wěn)定性不受mTORC1的調節(jié)，但是HIF-1α的蛋白翻譯過程受到S6K的調控[16]，因此mTOR/S6K信號正向調節(jié)HIF-1α的活性，HIF-1α的活化通過促進巨噬細胞的浸潤和活化促進炎癥的進展[17]，進而加重HIRI。Zhu等[18]的研究表明在小鼠HIRI中轉錄激活因子3 缺乏通過上調mTOR及下游靶基因S6K，進而激活固有的TLR4，增加HIF-1α，同時降低脯氨酸羥化酶1的活性，導致誘導叉頭盒蛋白3表達陽性（Foxp3+）的調節(jié)性T細胞的抑制，促進維A酸相關孤兒受體γt表達陽性（RORγt+）的輔助性T細胞的分化，從而加重IR誘導的肝臟炎癥。

1.4 ALOX12-12HETE-GPR31

花生四烯酸-1 2-脂加氧酶（arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）具有調節(jié)血小板聚集、細胞遷移、癌細胞增殖的功能[19-20]，既往研究主要集中于腫瘤、動脈粥樣硬化等方面，最近的研究發(fā)現(xiàn)ALOX12在小鼠HIRI缺血期中高表達，ALOX12在肝細胞中的上調促進了12 羥基二十碳四烯酸（12-hydroxyeicosatetraenoic acid，12-HETE）的積聚，12-HETE可直接與G蛋白偶聯(lián)受體31（G-proteincoupled receptor 31，GPR31）結合，激活下游的NFκB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)反應，以及隨后炎癥反應的發(fā)生，包括白細胞募集和激活等過程，從而引發(fā)肝臟炎癥，加劇肝臟損傷，應用ALOX12 抑制劑能顯著抑制HIRI中肝功能障礙、細胞死亡和炎癥反應[21]。

2 HIRI的保護性相關信號通路

2.1 HO-1-SIRT1-p53

血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種限速酶，在哺乳動物和人類中廣泛存在，其主要功能是催化血紅素轉化為鐵、一氧化碳和膽綠素，具有抗氧化和抗炎等功能[22]。Sirtuin 1（SIRT1）是一種去乙?；?，既往研究主要表明其在細胞衰老、炎癥和應激抵抗等方面起關鍵作用，目前已有研究表明SIRT1在小鼠HIRI中具有抗炎作用[23]。腫瘤蛋白53（the p53 tumor suppressor protein，p53）是一種轉錄因子，在細胞凋亡、細胞周期、DNA修復和腫瘤的發(fā)生中能夠調節(jié)靶基因的表達。有實驗發(fā)現(xiàn)在小鼠HIRI模型中一條新的信號軸即HO-1-SIRT1-p53信號通路，在該通路中HO-1 正向調節(jié)SIRT1，而SIRT1 誘導的抑癌基因Arf抑制MDM2（murine double minute 2，MDM2）E3連接酶活性使p53泛素相關的降解減少，最終該通路中上調的p53 使巨噬細胞的激活減少，進而減少巨噬細胞活化后釋放的促炎因子及趨化因子使HIRI減輕[24]。同時有研究表明，遠端缺血預處理能夠通過影響抗氧化應激及炎癥反應減輕小鼠急性肝損傷，其機制可能與通過調控HO-1的表達有關[25]。因此我們下一步研究可以探討遠端缺血預處理是否對HIRI中HO-1-SIRT1-p53信號通路產(chǎn)生影響。

2.2 Wnt/β-catenin

Wnt介導的通路包括典型的Wnt通路和非典型的Wnt通路[26]，已有研究證明該通路在細胞的增殖、分化、發(fā)育和死亡中起著重要的調節(jié)作用。目前研究最廣泛的是典型Wnt通路，即是Wnt/β-catenin通路，主要通過調節(jié)轉錄共激活因子β-catenin的數(shù)量發(fā)揮作用。在小鼠HIRI過程中Wnt/β-catenin通路被激活，β-catenin不會被降解復合體（Axin、Apc和Gsk3β）磷酸化，然后移位到細胞核內，在核內β-catenin與T細胞因子4 結合，激活靶基因的表達，起到促進細胞增殖的作用。β-catenin一方面可以抑制PTEN10（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）的活性，促進PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/Akt）信號轉導，減少細胞凋亡和炎癥反應；另一方面，β-catenin還可以直接抑制NF-κB的激活，從而抑制一系列炎癥反應。有實驗證明，AgM通過激活Wnt/β-catenin途徑減輕小鼠HIRI時的炎癥反應和細胞凋亡，從而減少HIRI；與此同時，當Wnt/β-catenin通路被相關通路抑制劑抑制時，AgM的保護作用減弱[27]。方祀福研究證明，飽和氫氣生理鹽水能夠通過促進Wnt/β-catenin通路，減少β-catenin降解，調控大鼠HIRI中細胞凋亡及炎癥反應減輕HIRI[28]。

2.3 Hedgehog/SMO/Gli1

Hedgehog/SMO/Gli1通路已被證實可調節(jié)細胞的生長、分化和免疫功能[29-30]。Hedgehog/SMO/Gli1通路的激活需要兩種必須蛋白質，包括G蛋白偶聯(lián)受體smoothened（SMO）和12 跨膜區(qū)段蛋白Patch1（Ptch1）。在沒有Hedgehog配體的情況下，Ptch1 抑制SMO的激活，但當Hedgehog信號在配體與Ptch1結合時被激活，導致SMO激活膠質瘤相關癌基因（glioma-associated oncogene，Gli）蛋白，然后Gli蛋白以激活的GLI2和GLI3蛋白的形式轉移到細胞核，誘導Hedgehog靶基因的表達，使轉錄激活因子Gli1（GLI family zinc finger 1）活性增加，抑制了受體相互作用蛋白激酶3及NLRP3的激活，減輕小鼠HIRI中壞死性凋亡及炎癥的作用，而Gli1 的缺失則促進了免疫細胞的激活和組織炎癥[31]。Sheng等[32]發(fā)現(xiàn)Hedgehog/SMO/Gli1信號通過Gli1和胞內結構域（notch intracellular domain，NICD）之間的直接相互作用來控制在小鼠HIRI模型中NLRP3驅動的肝臟炎癥。

2.4 Notch

Notch通路與細胞生長、分化和存活密切相關[33]，在炎癥反應中，Notch信號通路在調節(jié)免疫細胞的發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要的作用。Notch的經(jīng)典通路為Notch被γ分泌酶切割，釋放NICD，NICD移位到細胞核內，與RBPJ（recombinant recognition sequence binding protein at the Jκ site）形成復合物，并激活其靶基因Hes1（hairy and enhancer of split-1，Hes1）。最近有研究證實Notch1可以在小鼠HIRI中被激活，Notch靶基因Hes1抑制JNK結合蛋白（JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1，JSAP1）介導的ROCK1（Rho-associated protein kinase 1）激活，抑制JSAP1 可減低PTEN，增強AKT活性，導致HIRI中TLR4信號的抑制，從而減少TLR4介導的免疫細胞的激活及促炎因子的產(chǎn)生。此外，Notch-Hes1軸抑制JSAP1依賴的ROCK1和Caspace-3活性，從而減少HIRI引發(fā)的肝臟炎癥中肝細胞的凋亡和壞死[34]。Kageyama等[35]報道，Serelaxin通過激活Notch1信號通路在小鼠原位肝移植中，使小鼠HIRI損傷顯著減輕。同時有研究報道，低溫攜氧機械灌注在小鼠心臟死亡后器官捐獻肝臟的IRI中能夠激活Notch1信號通路，減少炎癥因子的釋放及減輕氧化應激反應，從而減輕HIRI[36]。

3 HIRI的雙向調節(jié)通路

HIRI的發(fā)生發(fā)展過程非常復雜，損傷性和保護性信號通路的作用機制都集中在對HIRI中炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激等方面的調節(jié)，部分通路有損傷和保護雙向調節(jié)作用。

JAK2/STAT3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3）通路介導炎癥的發(fā)展，與心肌、腦、腎等組織的缺血再灌注有關[37-39]。在小鼠HIRI中Kupffer細胞產(chǎn)生多種炎癥介質，如IL-1β、IL-6和TNF-α，在與肝細胞表面受體結合后，促進JAK2 的激活，STAT3 在收到JAK2 的信號后，磷酸化形成二聚體，當二聚體入核后會再結合輔助因子和協(xié)作轉錄因子啟動轉錄，進而調控HIRI中細胞凋亡及自噬等過程[40]。Sima等[41]發(fā)現(xiàn)七氟醚可以通過激活JAK2/STAT3 通路抑制HIRI中線粒體通透性轉換孔的過度開放，降低肝臟免疫性炎癥相關反應，進而使大鼠HIRI減輕。由于在該信號通路中STAT3α和STAT3β的表達水平為4∶1，因此許多研究都忽略了STAT3β的作用，將STAT3α視為STAT3的研究[42-43]。Cheng等[40]報道，培馬貝特通過調節(jié)JAK2/STAT3β/PPARα通路，使p-STAT3β水平升高激活PPARα，抑制炎癥因子的釋放，并抑制細胞死亡，減輕小鼠HIRI損傷。因此JKA2/STAT3信號通路在HIRI過程中通過STAT3 表現(xiàn)出了雙向調節(jié)的作用，這可能與p-STAT3β：p-STAT3α異源二聚體和p-STAT3α：p-STAT3α這兩種不同形式的入核二聚體有關。

越來越多的研究表明不同的通路中存在相互聯(lián)系的作用過程及病理生理機制。比如在HIRI的損傷性相關通路中激活的TLR4、NF-κB、NLRP3，可以在HIRI的保護相關通路中抑制它們的激活，甚至在同一通路中不同的作用過程擁有著截然相反的作用。因此，在調節(jié)HIRI過程中，在抑制損傷性相關信號通路、激活保護性相關信號通路的同時，應該將多種不同方向的通路聯(lián)系起來，為減輕HIRI提供更多的研究方向以及為臨床轉化提供更多的思路。

4 HIRI中信號通路間的相互作用

信號通路間的交叉調控已在慢性炎癥、腫瘤、免疫之間中有研究，不同通路信號間可能存在大量關聯(lián)和交叉的信號分子。最近有研究表明在HIRI中同樣有來自損傷性相關通路與保護性相關通路兩條通路間的交叉調控的作用。

4.1 髓系FoxO1-β-catenin軸和Hedgehog/Gli1信號

FoxO1（forkhead transcription factors of the O class 1）轉錄因子是一種進化保守的細胞代謝、氧化應激、炎癥和凋亡調節(jié)因子[44]。Hedgehog/Gli信號的激活可以調節(jié)細胞的生長、分化和免疫功能。有研究表明，F(xiàn)oxO1 與β-catenin信號協(xié)同調控肝缺血再灌注損傷中小鼠肝臟中的Hedgehog/Gli1/Snail通路，肝缺血再灌注可誘導JNK磷酸化，使核FoxO1增加[45]。此外，肝缺血再灌注激活了AKT，促進了β-catenin的核轉位。在肝缺血再灌注損傷的炎癥反應中，F(xiàn)oxO1與T細胞因子競爭與β-catenin相互作用，使β-catenin信號轉導受到抑制，進而起到抑制刺猬信號通路的表達。實驗證明小鼠HIRI中髓系FoxO1缺乏消除了FoxO1 與β-catenin的相互作用，增強了β-catenin的活性，促進了Hedgehog/Gli1/Snail信號轉導，從而減輕了NEK7/NLRP3（NIMA-related kinase 7/NLRP3）介導的肝臟炎癥和RIPK3（reduced receptorinteracting protein kinase 3）介導的壞死性凋亡[45]。

4.2 髓系HSF1-β-catenin軸和XBP1

熱休克轉錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）是熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的轉錄因子，可促進細胞的增殖和存活，減輕應激損傷[46]。X框結合蛋白1（X-box-binding protein 1，XBP1）是內質網(wǎng)應激的關鍵組成部分，是炎癥反應中促炎細胞因子持續(xù)產(chǎn)生所必需的[47]。最近有研究證明HSF1-β-catenin軸通過調控XBP1 信號通路在小鼠HIRI中的激活來調節(jié)NLRP3 的功能。HSF1在HIRI中從含有HSP40/70 或HSP90 的多聚體蛋白質復合物中釋放出來并轉移到細胞核，誘導增加β-catenin轉位和活性，從而抑制巨噬細胞對TLR/TRAF6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）刺激反應中XBP1的激活。抑制XBP1的活性會降低NLRP3的功能，導致Caspase-1的活性降低，使小鼠HIRI的IL-1β的成熟和分泌受到抑制，減輕HIRI中炎癥反應[48]。

隨著研究的不斷深入，越來越多的信號通路被發(fā)現(xiàn)存在于HIRI中。而目前大多數(shù)的研究并沒有詳細闡述各通路之間的相互作用以及相互之間如何發(fā)揮調控作用。上述在HIRI中相關的損傷通路與保護通路的串擾表明不同通路之間可能存在交叉，而要了解不同通路之間的交叉調控就需要發(fā)現(xiàn)其中的關鍵靶點，比如HIRI中損傷性相關通路FoxO1-βcatenin和保護性相關通路Hedgehog/Gli1 通路之間的關鍵靶點β-catenin；以及HIRI中保護性相關信號通路HSF1-β-catenin和損傷性信號通路XBP1通路之間的關鍵靶點XBP1。因此為了進一步了解及調控HIRI，需要對不同通路間的相互聯(lián)系及關鍵靶點進行更加深入和全面的研究，通過激活或者抑制關鍵靶點，更加精準的減輕HIRI。

5 小結與展望

綜上所述，HIRI機制復雜，涉及多分子多通路的參與，不同的信號通路通過調控不同的HIRI機制發(fā)揮著不同的作用。其中起到促損傷效應的有HIPPO/YAP信號、HMGB1/TLR4信號、ALOX2信號、mTOR/S6K/HIF-1α信號轉導通路；起到保護效應的包括HO-1-SIRT1-p53信號、WNT信號、刺猬信號、NOTCH信號轉導的通路；起到雙向調節(jié)效應的有JAK2/STAT3信號。不僅如此，不同信號通路之間可存在著大量信號分子交叉和關聯(lián)，使這些連接不同通路間的關鍵因子成為當下研究的熱點。即便是已知的信號通路中還包含著許多的未知相互作用因子，需要我們去深入研究。不論是HIRI的保護性相關信號通路或者損傷性相關信號通路都主要集中于調控HIRI中的炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激等方面，因此為了更加有效的實現(xiàn)減輕HIRI我們應該重點關注能夠調控上述病理機制的信號通路。同時越來越多的實驗證明在HIRI中存在焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡等多種損傷機制，我們下一步研究也可以嘗試聯(lián)合多種機制去減輕HIRI。然而目前HIRI的研究多局限于動物體內外實驗階段，在臨床效果還有待進一步的研究驗證。隨著生物標記技術，蛋白組學，納米技術等多學科發(fā)展及相互應用，對HIRI通路的研究逐漸深入，通過抑制相關促損傷通路的靶點阻斷劑或通過激活相關保護效應通路的激動劑的研發(fā)即將開拓出新領域。加強多學科的研究合作，我們期盼著減輕HIRI的新療法，并盡快應用到臨床當中，提高HIRI相關患者的預后。