肖 輝 李俊敏

(1 湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院,十堰,442000; 2 湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市人民醫(yī)院,十堰,442000)

熱射病為中暑癥狀較為嚴重的一種，以高熱、昏迷為主要臨床表現(xiàn)，研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計，其早期死亡率高達70%[1]。引起熱射病因素較多，主要為高溫、大量體力勞動等，高溫條件下熱量易傳入人體，增加了機體代謝熱量，導致機體自身防御功能無法與熱應(yīng)激反應(yīng)對抗，繼而使得體溫升高，對心臟功能產(chǎn)生直接損害，誘發(fā)多器官功能衰竭，最終面臨死亡[2-3]。紅景天其主要成分為紅景天苷，發(fā)揮抗疲勞、抗缺氧、益氣活血功效，已有越來越多的研究證實，紅景天苷對降低心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮重要作用，可對心臟功能進行有效保護[4-5]。本研究以40只大鼠為對象,分作4組,予以不同干預(yù),旨在進一步探討紅景天苷對熱射病大鼠心功能損害的保護作用與機制,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級雄性SD大鼠共40只,體質(zhì)量190～210 g,平均體質(zhì)量(200±10)g,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可SCXK(滬)2021-0004,單位:上海亓上生物醫(yī)學科技有限公司。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)條件:設(shè)置40%～70%濕度，18～22 ℃溫度，黑暗、照明環(huán)境下分別放置12 h，自由飲水、進食(倫理審批號:JN.No20191030b0601231)

1.1.2 藥物 4、8、32 mg/kg紅景天苷(陜西森悅生物科技有限公司,批號:b1303)。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)劑盒(上海源葉科技有限公司,批號:S10115-15KU)、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)試劑盒(上海滬崢生物科技有限公司,批號:HS4639)、BCA蛋白試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司,批號:BI-WB005-200T)、二甲亞砜(廣州勤必發(fā)商貿(mào)有限公司,批號:PV6210000)、雙氯熒光黃乙酸乙酯(北京華威銳科化工有限公司,批號:C34725)、嵌段式聚醚F-127(Sigma公司,批號:9003-11-6)。線粒體分離試劑盒(武漢卡諾斯科技有限公司,批號:B30142)、細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒[凱基生物科技有限公司,批號:ImmunoChemistry(ICT)_97]。線粒體呼吸控制率定量檢測試劑(深圳子科生物科技有限公司,批號:GMS10097)。紅景天苷(中國食品藥品生物檢定研究院,批號：110818-201708)。離心機(海安亭科學儀器廠,型號:L3202),PCR儀(Advanced Bionics,美國,型號:ABI-7500),透射電鏡(日立公司,日本,型號:H-7500)，計算機控制大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機(上海欣軟信息科技有限公司,型號:YLS-15A),流式細胞儀(BD公司，美國,型號：FACS Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 依據(jù)干預(yù)方式不同將40只大鼠分為對照組,紅景天苷干預(yù)作低劑量、中劑量、高劑量組，每組10只。

在設(shè)定好的濕度與溫度下大鼠在跑步臺上跑步，設(shè)定跑步機坡度為0度，速度為15 m/min。若中途大鼠停止跑步，則以電壓100 V的電擊，直至大鼠力氣耗盡。之后，再次給予電刺激，致使大鼠癱軟在平面上不能自主翻身。判斷大鼠熱射病主要依據(jù)為：大鼠動脈收縮壓升高至頂點后呈降低趨勢，直至拐點，或內(nèi)核溫度升高至42.5 ℃。

1.2.2 干預(yù)方法 對照組建模后予以常規(guī)飲食飼養(yǎng);低劑量組予以4 mg/kg紅景天苷;中劑量組予以8 mg/kg紅景天苷;高劑量組予以32 mg/kg紅景天苷。3組給藥方式均為填喂法。

1.2.3 檢測指標與方法 1)取材。安樂處死大鼠,對其心臟組織進行摘除,通過緩沖液聚丁二酸丁二醇酯(Polybutylene Succinate，PBS)將血漬清洗干凈,置入離心管(2 mL)標記,1 500 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min。于液氮中進行冷凍,保存于-80 ℃冰箱中。2)電鏡標本制作與觀察。通過PBS液對大鼠心肌細胞進行沖洗,以1%戊二醛、1%多聚甲醛于室溫條件下進行1 h固定,通過鋨酸于4 ℃條件下固定1 h。以乙醇展開常規(guī)多級脫水處理,使細胞內(nèi)嵌于LX112。切片,通過1%的乙酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進行染色處理,于300萬倍電子顯微鏡下對大鼠心肌結(jié)構(gòu)、線粒體形態(tài)進行觀察。3)檢測氧自由基、線粒體膜電位、呼吸控制率。a.線粒體。選取大鼠心臟組織(0.1 g)作為實驗標本，PBS液洗滌，吸干,勻漿后研磨處理,600 r/min，離心半徑8 cm，離心10 s,離心2次,沉淀物即為線粒體,加入100 μL含1%牛血清白蛋白蔗糖溶液,獲取沉淀為線粒體，保存于4 ℃環(huán)境中。b.測量線粒體膜電位。應(yīng)用100 nmol/L的HEPES(含紅色熒光)對大鼠心肌細胞進行0.5 h孵育，分析儀器選擇流式細胞儀。c.檢測線粒體呼吸控制率。介質(zhì)液加入至反應(yīng)槽中，密封,并記錄氧濃度,將待測線粒體加入,對Ⅲ與Ⅳ態(tài)呼吸速率檢測，計算呼吸控制率。d.檢測線粒體氧自由基。線粒體懸液避光條件下放置15 min，灌洗選擇生理鹽水，時間控制在45 min作用，之后應(yīng)用流式細胞儀檢測熒光強度，并對結(jié)果記錄，并對相關(guān)數(shù)據(jù)計算。e.線粒體細胞膜通透性。心肌細胞重懸后,孵育15 min,對激發(fā)光波長進行調(diào)節(jié),使其為288 nm、543 nm,于40倍物理鏡下對成像情況進行觀察。4)MDA及SOD測定。檢測操作均按照說明書進行。5)過氧化物酶體增殖物激活受體輔助激活因子-1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor-gamma Co-activator-1α,PGC-1α)及MnSOD mRNA測定。提取總RNA后通過實時聚合酶鏈式反應(yīng)法測定,操作嚴格依照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 分類資料統(tǒng)計應(yīng)用表、PXC表χ2檢驗,計量資料采用t檢驗，低數(shù)量指標采用Fisher檢驗，多重比較采用S-N-K檢驗，多個因素比較采用F檢驗，隨后以SPSS 21.0統(tǒng)計軟件展開分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體膜電位、呼吸控制率及氧自由基 紅景天苷組大鼠心肌細胞膜電位、呼吸控制率與氧自由基強度均較對照組高(P<0.05)。見表1。

表1 線粒體膜電位、呼吸控制率及氧自由基比較

2.2 細胞膜通透性 對照組細胞膜通透性低于紅景天苷組，且藥物劑量與細胞膜通透性呈正相關(guān)性，細胞膜通透性隨藥物劑量增加而升高。見圖1。

2.3 MDA及SOD水平比較 紅景天苷組MDA較對照組低,同時SOD較對照組高(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心肌MDA及SOD活性比較

2.4 心肌細胞線粒體的變化情況 對照組大鼠心肌細胞顯著腫脹,可見細胞膜破裂、細胞器散落存在,線粒體出現(xiàn)腫脹狀態(tài),且可見空泡改變,內(nèi)部基質(zhì)可見不均勻密度,內(nèi)腔有明顯的擴張。隨著紅景天苷劑量的增加,大鼠心肌細胞線粒體損傷減輕。見圖2。

2.5 PGC-1α及MnSOD mRNA 紅景天苷組PGC-1α及MnSOD mRNA均較對照組高,且紅景天苷劑量越高,PGC-1α及MnSOD mRNA越高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA活性比較

3 討論

越來越多的資料中闡明，熱射病大鼠線粒體功能及結(jié)構(gòu)會嚴重受損，這是其出現(xiàn)多器官衰竭重要因素[6-7]。另外，在高熱條件下也會損害線粒體膜，由于蓄積較多氧自由基會對其產(chǎn)生嚴重損害[8]。所以，清除氧自由基是對熱射病患者治療的關(guān)鍵，旨在最大程度保護線粒體膜不受損害，進一步改善患者心臟功能。

紅景天是一種抗疲勞、抗氧化的傳統(tǒng)中藥，目前被廣泛用于抗衰老、抗缺氧、抗高原反應(yīng)中，同時也被臨床用于高血脂及心力衰竭等多種老年疾病預(yù)防中[9-10]。從現(xiàn)代醫(yī)學角度講，有效成分紅景天苷用于心腦血管疾病中，心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)指標得到明顯改善，最大限度避免損傷心臟功能[11]?；诋敶幚韺W分析，紅景天苷會很好地保護受損線粒體，SOD活性得到提升基礎(chǔ)上能夠清除氧自由基，進一步減輕氧自由基對細胞結(jié)構(gòu)的損傷程度[12]。

線粒體在不受損情況下會有氧化磷酸化產(chǎn)生，但若細胞膜凋亡則會降低線粒體膜電位[13]。通常情況下，若線粒體呼吸控制率下降也表示線粒體功能降低[14]。部分學者指出，產(chǎn)生大量氧自由基標志著脂質(zhì)抗氧化及過氧化系統(tǒng)失衡，會增加器官功能障礙程度[15-16]。MDA為受損后氧自由基產(chǎn)物，SOD為清除氧自由基主要酶，因此可通過MDA、SOD指標變化情況判斷機體受損程度[17-18]。PGC-1α是糖代謝的主要因子，可促進線粒體合成，對氧化蛋白進行拮抗[19]。MnSOD mRNA會拮抗氧自由基損傷過程，為線粒體主要酶[20-21]。熱射病發(fā)生后,大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA均下調(diào),提示熱射病大鼠存在PGC-1α、MnSOD mRNA功能受損。

本研究表明:紅景天苷劑量越大,大鼠心肌細胞膜電位、呼吸控制率與細胞膜通透性越高、大鼠心肌氧自由基越低,MDA低表達,SOD與PGC-1αmRNA、MnSOD mRNA呈高表達，對熱射病大鼠來說，紅景天苷會有效降低組織受損程度，提高呼吸控制率、線粒體膜電位,同時對MDA進行抑制,提升SOD及PGC-1α、MnSOD mRNA表達,達到保護大鼠心肌的效果。

綜上所述，紅景天苷用于熱射病大鼠干預(yù)中，有助于降低其心功能損傷程度，對心功能改善和呼吸控制率提升均具有重要意義。且劑量越高,效果越明顯,其機制可能為上調(diào)PGC-1α、MnSOD mRNA表達有關(guān)。但因本研究未開展臨床研究，所以之后需要擴展研究范圍，為疾病治療提供基礎(chǔ)和依據(jù)。