李 喬 尹可欣 孟 瑩 趙 聰 陳 靜 索朗平措 劉寶清

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京,100078; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京,100029; 3 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,拉薩,850000)

非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是以肝小葉為病變主體,以肝細(xì)胞脂肪變性、損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理特征,且無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床綜合征[1]。目前針對(duì)NAFLD的治療主要包括改善生活方式,改善代謝綜合征,修復(fù)肝損傷,減肥手術(shù),肝移植等[2-4]。減肥和運(yùn)動(dòng)療法屬于基礎(chǔ)治療,藥物治療仍然是主要治療方式。然而,目前仍缺乏特效藥物,治療措施包括降脂、降糖、改善糖耐量、護(hù)肝、減肥藥物等為主[5-6],臨床上仍缺乏相關(guān)證據(jù)驗(yàn)證其療效,且不良反應(yīng)多[7-9]。中醫(yī)藥已廣泛用于NAFLD、肝纖維化的治療,與中藥復(fù)方具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)減輕肝臟脂質(zhì)沉積、抗炎和抗纖維化的作用相關(guān)[10]。

七味鐵屑(Qiwei Tiexie,QWTX)屬于傳統(tǒng)藏藥,初始載于《集藥利樂(lè)庫(kù)》中,長(zhǎng)期用于治療各種急慢性肝病,表現(xiàn)出較好療效。目前針對(duì)QWTX治療NAFLD的研究提出[11],其主要是通過(guò)阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-脂質(zhì)代謝紊亂-凋亡及炎癥通路發(fā)揮作用,進(jìn)而減輕肝臟脂肪變性,改善肝臟炎癥程度。但對(duì)于治療NAFLD的具體機(jī)制及相關(guān)調(diào)控因子尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SD大鼠NAFLD模型,運(yùn)用藏藥QWTX對(duì)其進(jìn)行干預(yù),觀察血脂4項(xiàng)及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等指標(biāo)的影響,探索其對(duì)SD大鼠NAFLD脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取SD大鼠90只,雌性,體質(zhì)量200～250 g,4周齡,購(gòu)自維通利華公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012-0011,無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)SPF級(jí)動(dòng)物飼料,自由飲用無(wú)菌飲用水,環(huán)境溫度(20±2)℃,相對(duì)濕度45%～70%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理審批號(hào):201627)。

1.1.2 藥物 七位鐵屑膠囊(西藏金哈達(dá)藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090301),由鐵屑(訶子制)、北寒水石、藏木香、木香、甘青青藍(lán)、紅花、五靈脂膏等7味藥物組成,規(guī)格:0.5 g/粒。易善復(fù)膠囊(北方安萬(wàn)制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20059010),主要成分為多烯磷脂酰膽堿,規(guī)格:228 mg/粒。羧甲基纖維素鈉(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na)(上海三浦化工有限公司,批號(hào):20160911)。

1.1.3 試劑與儀器 SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20180712),游離脂肪酸測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20180726)，MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20180706),一氧化氮檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20180608);蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin Staining,HE)染色劑(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20171205);倒置顯微鏡(Olympus公司,日本,型號(hào):IX71);超薄切片機(jī)(Leica儀器有限公司,奧地利,型號(hào):UC6);臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(Heraeus公司,德國(guó),型號(hào)：5427R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 90只SD雌性大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按體質(zhì)量層次隨機(jī)選取15只作為正常組,予以普通飼料喂養(yǎng),余下75只以88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)造模,并將其分為模型組,西藥組，QWTX高劑量組,QWTX中劑量組,QWTX低劑量組，每組15只。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由飲水和進(jìn)食,喂養(yǎng)持續(xù)9周。

1.2.2 給藥方法 喂養(yǎng)3周后,各觀察組給予相應(yīng)藥物,用藥劑量按標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量動(dòng)物劑量折算表算出:QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組分別按180 mg/(kg·d)、90 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)灌胃,易善復(fù)為123 mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃,正常組和模型組予以CMC-Na進(jìn)行干預(yù),每次灌胃量10 mL,持續(xù)6周,每周稱(chēng)量體質(zhì)量2次,調(diào)整相應(yīng)灌胃劑量。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 第9周末,動(dòng)物禁食水12 h后,腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛0.30 mL/100 g予以麻醉,麻醉成功后開(kāi)腹,進(jìn)行下腔靜脈采血,取3 mL全血室溫靜置15 min,3 000 r/min,離心半徑10 cm,離心30 min分離血清,檢測(cè)總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、三酰甘油(Triglyceride,TG);低密度脂蛋白(Low-density Lipoprotein,LDL),高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL);游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO)。迅速取出肝臟并稱(chēng)重,取左葉距邊緣5 mm處取1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm組織,置于40 g/L甲醛固定3 h后,梯度乙醇逐級(jí)脫水,石蠟包埋,冷凍,切片厚5 μm,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色觀察肝細(xì)胞脂肪變程度和范圍,對(duì)肝臟脂肪變性程度及炎癥反應(yīng)程度進(jìn)行分級(jí)、評(píng)分,NAFLD的病理組織學(xué)診斷參考2010年中國(guó)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》。再取肝右葉,4 ℃條件下用生理鹽水制成100 g/L的肝組織勻漿,2 000 r/min,離心半徑13 cm,離心10 min后取上清液,分別采用相關(guān)試劑盒檢測(cè)SOD、MDA。

2 結(jié)果

2.1 9周各組大鼠肝臟外觀及組織病理學(xué)改變比較 正常組大鼠肝臟表面光滑,色澤鮮紅,邊緣銳利。模型組肝臟較正常組明顯腫大,成黃色,邊緣變鈍,切面油膩感;西藥組與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組大鼠肝臟色澤淺黃,質(zhì)地、體積均介于正常組與模型組之間,肉眼觀察差別不明顯。HE染色正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)脂肪變形及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),模型組大鼠肝臟的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為肝細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)以大泡型為主的混合型脂滴,同時(shí)肝組織可見(jiàn)散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生。西藥組和QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組大鼠肝組織病變較模型組有不同程度的改善,肝細(xì)胞內(nèi)脂滴減少,肝細(xì)胞脂肪變程度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見(jiàn)圖1。

2.2 各組9周時(shí)SD大鼠血清脂類(lèi)指標(biāo)的變化 9周時(shí)，與模型組比較,西藥組、QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組血清TC、TG、HDL、LDL的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),指標(biāo)變化與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組劑量存在相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 9周各組大鼠血脂指標(biāo)的變化

2.3 各組9周時(shí)SD大鼠SOD、MDA、NO、FFA比較 9周時(shí)，西藥組和QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MDA、SOD指標(biāo)變化與QWTX高劑量組、QWTX中劑量組、QWTX低劑量組存在劑量相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 9周各組SD大鼠SOD、MDA(肝臟),NO、FFA(血清)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為脂肪肝歸屬于“脅痛”“痰濁”“肝癖”等病癥范疇,而藏醫(yī)將脂肪肝即“脂肪過(guò)盛病”歸屬于“本位木布病”范疇,由于過(guò)食肥甘厚味或飲酒過(guò)度,體內(nèi)三因失衡,“培根”和“赤巴”功能紊亂,其中以“培根”為主導(dǎo)。治療應(yīng)以養(yǎng)血平肝、活血化瘀、清血化毒、調(diào)和三因?yàn)橹?。QWTX是根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)藥防治理論“培根捏及、赤巴覺(jué)及、龍酶年姆”而研制的藏藥復(fù)方制劑,其中鐵屑(訶子制,占97%)解肝毒、消浮腫,而訶子有降脂功效[12];紅花活血止痛[13];甘青青藍(lán)、北寒水石(奶制)解肝胃熱[14];木香、五靈脂膏行氣止痛,又配伍具有健脾和胃、調(diào)氣解郁、止痛的藏木香,達(dá)到行氣活血止痛的效果等功效。QWTX在防治脂肪肝方面有較為顯著的療效,其中包括NAFLD,但機(jī)制及其相關(guān)調(diào)控因子尚不明確。

隨著肥胖癥和糖尿病發(fā)病率的增加,NAFLD的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[2],為普通人群的24%[15]。NAFLD的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)呈多樣性,包含單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-Alcoholic Steatohepalitis,NASH)、NASH肝纖維化和NASH肝硬化和NASH相關(guān)性肝細(xì)胞癌[16],其中NASH相關(guān)性死亡率更高,成為肝移植的最主要原因[17]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制未完全明確。目前多認(rèn)為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)引起FFA產(chǎn)生增多,導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)度累積,脂肪酸β氧化超載,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)大量產(chǎn)生,誘發(fā)氧化應(yīng)激以及氧反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)生,引起肝臟脂毒性;同時(shí),脂肪變性也促進(jìn)IR的發(fā)生,形成惡性循環(huán),加重肝損傷,促進(jìn)纖維化的生成[18]。

經(jīng)過(guò)9周造模后觀察到大鼠肝臟外觀形態(tài)、病理組織學(xué)、血脂、FFA等指標(biāo)證明大鼠NAFLD已形成。尤其模型組病理觀察到典型的脂肪變性和炎癥細(xì)胞,未見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生,表明該模型屬于NASH。QWTX可降低肝臟組織脂肪含量,抑制NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積,并且隨著藥物劑量的提高,作用越明顯;大鼠血清血脂較模型組有不同程度改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)對(duì)組方藥物的藥理研究,其中訶子的主要有效藥物成分是三萜類(lèi)化合物、酚酸類(lèi)[19];藏木香、木香為黃酮類(lèi)、木香內(nèi)酯[20-21];甘青青藍(lán)為黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)化合物[22]。QWTX有效成分的藥理作用是以抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化應(yīng)激、降脂及抗炎為主,其中三萜類(lèi)化合物對(duì)阻止氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)揮主要作用[23]。

FFA的增加被認(rèn)為是NAFLD重要起始因子,過(guò)量的FFA通過(guò)誘導(dǎo)ROS釋放導(dǎo)致脂肪毒性,發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和肝損傷,促進(jìn)肝纖維化形成[24-26]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠TG、TC、LDL-C和FFA含量均顯著增高,而HDL-C顯著降低,表明脂質(zhì)代謝紊亂存在。QWTX能降低TG、TC、LDL-C和FFA含量,升高血清HDL-C,提示有調(diào)整脂質(zhì)代謝紊亂的治療作用。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一,其數(shù)值高低可反映脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度[27],可以間接地反映肝臟自由基損傷的程度。SOD是人體重要的抗氧化酶,是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子,可以抑制NAFLD發(fā)病過(guò)程中的過(guò)氧化反應(yīng)[28]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠肝臟SOD活性降低,而MDA含量增加,說(shuō)明在NAFLD大鼠中抗氧化及對(duì)自由基清除能力下降,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷增強(qiáng)。QWTX可升高肝臟SOD活性,降低MDA含量,提示其通過(guò)調(diào)節(jié)自由基代謝平衡防護(hù)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化。NO是在一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的作用下形成,其在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中的作用好壞與其濃度及肝臟的微環(huán)境關(guān)系密切[29]。短暫產(chǎn)生少量的NO有保護(hù)肝臟細(xì)胞免受氧化損傷及代謝炎癥應(yīng)激作用。長(zhǎng)期產(chǎn)生大量的NO與氧自由基生成活性氮氧化合物(Reactive Nitrogen Oxide Species,RNOS)，破壞線粒體結(jié)構(gòu),啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化[29-32],同時(shí)又可促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的產(chǎn)生,加重肝損傷。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清NO水平低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示NO可能抑制參與NAFLD早期發(fā)病機(jī)制的所有關(guān)鍵過(guò)程,脂肪乳劑可降低血清NO水平。QWTX與多烯磷脂酰膽堿一樣能顯著提高血清NO水平,進(jìn)而與脂質(zhì)過(guò)氧化物相結(jié)合,發(fā)揮抗氧化作用,減輕肝細(xì)胞的損傷和壞死程度,降低炎癥介質(zhì)的水平,并改善大多數(shù)肝功能指標(biāo)[33]。

綜上所述,QWTX作用于NAFLD大鼠,通過(guò)其有效藥物成分發(fā)揮作用,增強(qiáng)肝臟SOD活性,減少肝臟MDA含量,提高大鼠血清NO含量,有效地抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),從而改善脂代謝水平降低FFA,進(jìn)而減輕肝損傷,延緩肝臟纖維化進(jìn)程,最終發(fā)揮治療NAFLD的作用。