梁宸，陳建洋，謝新華*，忤心軍，張波波，徐超，艾志錄

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州，450002)3(鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州，450002)

豌豆蛋白(pea protein isolate, PPI)是一種天然健康的植物蛋白，其氨基酸比例平衡，賴氨酸含量豐富，具有降低膽固醇、降血壓的功能，越來越受到人們的關(guān)注[1]。PPI在pH 7.0～10.0的水溶液中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，但PPI在等電點(diǎn)(約pH 4.6)附近時(shí)，因自身靜電荷被中和，發(fā)生聚集沉淀而不能起到乳化作用，限制了其在酸性飲料中的開發(fā)利用[2-3]。因此，提高PPI在等電點(diǎn)附近的穩(wěn)定性是很有必要的。

研究表明，陰離子多糖類聚電解質(zhì)可與蛋白靜電復(fù)合形成可溶性復(fù)合物，有利于提高蛋白在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。這是因?yàn)閹ж?fù)電荷的多糖與帶正電荷的蛋白發(fā)生靜電復(fù)合后，靜電斥力和空間位阻使體系保持均勻分散的狀態(tài)；多糖的加入也使連續(xù)相的黏度增大，阻礙了大分子間的聚集[4-5]。LAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)PPI和高甲氧基果膠發(fā)生靜電復(fù)合形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了PPI的熱穩(wěn)定性；LIU等[7]研究了PPI與阿拉伯膠的復(fù)合體系，發(fā)現(xiàn)靜電相互作用提高了PPI在酸性環(huán)境中的溶解度和乳化性；WAGONER等[8]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白在等電點(diǎn)附近與果膠形成了對熱穩(wěn)定的可溶性復(fù)合物，并應(yīng)用到飲料產(chǎn)品中。γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid, γ-PGA)是谷氨酸單體以α-胺基和γ-羧基之間經(jīng)酰胺鍵聯(lián)結(jié)所構(gòu)成的同型聚酰胺。具有無毒、可生物降解、增稠的特性以及降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力的生理活性，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療行業(yè)中[9-10]。本課題組前期的研究表明γ-PGA與大豆分離蛋白形成可溶性復(fù)合物，提高了大豆蛋白的熱穩(wěn)定性[11]。目前尚未有關(guān)于γ-PGA與PPI靜電相互作用對PPI在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性影響的相關(guān)研究，本文研究了pH、復(fù)合比例、蛋白濃度對復(fù)合物形成的影響，以找到形成可溶性復(fù)合物的條件，并對復(fù)合體系的溶解度、表面疏水性、乳化性進(jìn)行分析以篩選出酸性環(huán)境下穩(wěn)定效果最佳的復(fù)合比例。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆，市購；γ-PGA，西安四季生物科技有限公司；玉米油，中糧福臨門食品營銷有限公司；福林酚，北京博奧脫達(dá)科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid, ANS)，阿拉丁上海試劑有限公司；羅丹明B，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Virtis型凍干機(jī)，美國SP Scientific；5430R型離心機(jī)，德國艾本德公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；T18高速剪切分散器，德國IKA儀器設(shè)備有限公司；A1激光共聚焦顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；Lumia熒光分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豌豆分離蛋白的提取

參考STONE等[12]的方法，將去皮豌豆磨碎成粉后，以質(zhì)量比1∶15分散在去離子水中，用0.5 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至9.0，室溫下磁力攪拌2 h。4 ℃下以5 000 r/min離心20 min后收集上清液，用0.5 mol/L的HCl溶液將其pH調(diào)至4.5，4 500 r/min離心20 min后收集沉淀并分散在去離子水中，調(diào)pH至7.0，冷凍干燥后，經(jīng)凱氏定氮測得蛋白含量為83.60%。

1.3.2 PPI與γ-PGA復(fù)合溶液的制備

參考LAN等[6]的方法，制備不同蛋白濃度的復(fù)合溶液。低蛋白濃度復(fù)合體系的制備：先制備PPI和γ-PGA的儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度均為1.0 g/L，置于4 ℃冰箱中水化24 h。將2種儲(chǔ)備液按一定比例混合，加入適當(dāng)體積的去離子水，配制成不同質(zhì)量復(fù)合比(r=1、2、5、10、15、20)PPI-γ-PGA復(fù)合溶液(PPI濃度固定為0.5 g/L)。使用濃度分別為1.0、0.5、0.1 mol/L NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)復(fù)合溶液的pH為2.0～7.0，以盡量減小NaOH和HCl溶液的稀釋作用。

高蛋白濃度復(fù)合體系的制備:取水化24 h后，質(zhì)量濃度均為20.0 g/L的PPI和γ-PGA儲(chǔ)備液，配制成PPI質(zhì)量濃度固定為10.0 g/L的不同質(zhì)量復(fù)合比(r=1、2、5、10、15、20)PPI-γ-PGA復(fù)合溶液，使用濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.1 mol/L 的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH為2.0～7.0。

1.3.3 濁度的測定

使用雙光束紫外分光光度計(jì)在波長600 nm處測定低蛋白濃度復(fù)合溶液的吸光度，以去離子水作為空白對照，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.3.4 相圖的繪制

使用NaOH和HCl溶液將高、低蛋白濃度復(fù)合溶液的pH調(diào)至2.0～7.0后，置于玻璃瓶中于室溫下放置24 h后，記錄體系的狀態(tài)。以復(fù)合比例r為橫軸，pH為縱軸，進(jìn)行相圖繪制。

1.3.5 Zeta電位的測定

使用電位儀測定高、低蛋白濃度復(fù)合溶液的Zeta電位。將復(fù)合溶液注入樣品池中，平衡時(shí)間為2 min，測定溫度25 ℃[8]。

1.3.6 蛋白溶解度的測定

采用MU等[13]的方法測定蛋白溶解度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取pH 4.5的高蛋白濃度復(fù)合溶液10 mL于離心管中，4 ℃下以 4 500 r/min離心20 min，吸取1 mL上清液將其與5 mL福林酚試劑甲混勻，室溫放置10 min后加入0.5 mL福林酚試劑乙，立即搖勻，反應(yīng)30 min后測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量，溶解度按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.7 蛋白乳化性的測定

參考ZHU等[14]的方法，略作修改。取pH 4.5的高蛋白濃度復(fù)合溶液85 mL，加入15 mL玉米油混合，使用高速剪切機(jī)于20 000 r/min下均質(zhì)2 min，分別在0和10 min后從瓶底吸取50 μL乳液，用0.1 g/L十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)稀釋100倍，以SDS溶液為空白，于波長500 nm處測OD值。乳化活性計(jì)算如公式(2)所示，乳化穩(wěn)定性計(jì)算如公式(3)所示：

(2)

(3)

式中：A0、A10，0、10 min測得的吸光度；DF，稀釋倍數(shù)；Φ，油相體積分?jǐn)?shù)，%；θ，光路長度，cm；ρ，蛋白質(zhì)量濃度，g/mL。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)

使用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀測樣品的微觀結(jié)構(gòu)。取1 mL pH 4.5的高蛋白濃度復(fù)合溶液，加入20 μL 2 g/L的羅丹明B，染色20 min后，吸取少量于載玻片上，物鏡倍數(shù)為20×。

1.3.9 表面疏水性的測定

使用ANS熒光探針法測定蛋白的表面疏水性[15]。通過1.3.6的方法測定pH 4.5的高蛋白濃度復(fù)合溶液的蛋白溶解度，隨后用pH 4.5的磷酸鹽緩沖液稀釋上清液，使其蛋白質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL。配制8 mmol/L的ANS，取稀釋后的樣品4 mL，加入20 μL ANS，避光放置10 min后，測定蛋白的熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長為370 nm、發(fā)射波長470 nm，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制曲線，曲線的斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖，SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行方差分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對PPI-γ-PGA復(fù)合物形成的影響

通過濁度分析來研究低濃度下蛋白與多糖的相互作用[16]。隨著pH從7.0降至2.2，PPI的濁度曲線表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(圖1)，在等電點(diǎn)pH 4.6時(shí)，蛋白發(fā)生聚集，濁度達(dá)到最大，隨后pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，蛋白分子間靜電斥力增大，濁度逐漸降低。PPI-γ-PGA的濁度曲線被分為3個(gè)相區(qū)。當(dāng)pH>pHc為共溶區(qū)，此時(shí)體系的濁度沒有發(fā)生明顯變化，PPI與γ-PGA為共溶狀態(tài)。當(dāng)pHφ1

由圖2可知，PPI的電位隨pH的增大不斷降低，在pH 4.58時(shí)其電勢為0，達(dá)到了PPI等電點(diǎn)。PPI-γ-PGA的電位也隨pH的增大而不斷降低，在pH 3.85時(shí)電勢為0，此時(shí)復(fù)合物分子間的靜電斥力最小，分子發(fā)生聚集沉淀，體系的濁度達(dá)到最大，在圖1中pHopt出現(xiàn)在3.8附近，也是與此對應(yīng)。與PPI相比，PPI-γ-PGA體系的等電點(diǎn)往酸性的方向移動(dòng)，可能是γ-PGA上的陰離子羧基與PPI表面的陽離子氨基通過靜電結(jié)合形成了復(fù)合物，γ-PGA 攜帶的負(fù)電荷使復(fù)合物的等電點(diǎn)發(fā)生了改變[16]。

圖2 pH對復(fù)合溶液ζ-電位的影響Fig.2 Effect of pH on zeta potential of mixed solution

2.2 復(fù)合比例對PPI-γ-PGA復(fù)合物形成的影響

研究了低蛋白濃度時(shí)復(fù)合比例對復(fù)合物形成的影響。參考LAN等[6]和LIU等[18]的方法確定了臨界轉(zhuǎn)變點(diǎn)(pHs)，當(dāng)pH>pHs時(shí)，有可溶性復(fù)合物生成，體系狀態(tài)為可溶相，當(dāng)pH

圖3 復(fù)合比例對pHs的影響Fig.3 Influence of mixing ratio on pHs

2.3 不同蛋白濃度對復(fù)合物形成的影響

由于濁度分析只適合研究低濃度下蛋白與多糖的相互作用，通過相圖分析來研究濃度對復(fù)合物形成的影響。PPI與γ-PGA復(fù)合水溶液在不同的pH條件下表現(xiàn)為清晰、渾濁、部分相分離以及完全相分離4種狀態(tài)。清晰和渾濁表明體系都為可溶相，部分相分離及完全相分離表明體系為不溶相。與LAN等[6]的研究相似，在相圖中存在可溶相與不溶相的邊界線。在低蛋白濃度下，上方的白色可溶相區(qū)域隨復(fù)合比例的減小而增大(圖4-a)，表明與相轉(zhuǎn)變相關(guān)的臨界轉(zhuǎn)變點(diǎn)也向酸性方向移動(dòng)，這與pHs隨復(fù)合比例變化的結(jié)果相一致。與圖4-a相似，圖4-b也觀察到可溶相區(qū)域隨復(fù)合比例的減小而增大的現(xiàn)象，表明高濃度下pHs也隨復(fù)合比例的減小而減?。坏珗D4-b中黑色不溶相的區(qū)域更大，可溶相與不溶相的邊界線向上方移動(dòng)，說明pHs較低蛋白濃度復(fù)合體系有所增大。

a-低蛋白質(zhì)量濃度(0.5 g/L)；b-高蛋白質(zhì)量濃度(10.0 g/L)圖4 復(fù)合體系的相圖Fig.4 Phase diagram of the mixed system

研究了2種蛋白濃度下復(fù)合體系電位隨pH變化的情況，見圖5。

a-低蛋白質(zhì)量濃度(0.5 g/L)；b-高蛋白質(zhì)量濃度(10.0 g/L)圖5 pH對復(fù)合溶液的ζ-電位的影響Fig.5 Effect of pH on zeta potential of mixed solution

圖5中電位曲線的變化表明復(fù)合比例與體系的電位表現(xiàn)出一定的依賴性。復(fù)合比例影響著形成復(fù)合體系整體的電荷數(shù)量，當(dāng)復(fù)合比例r由20減小到1時(shí)，體系中的γ-PGA數(shù)量增大，此時(shí)有更多的γ-PGA提供負(fù)電荷，當(dāng)其與PPI攜帶的正電荷發(fā)生中和后，體系的電荷量發(fā)生改變，復(fù)合溶液的電位曲線整體向下移動(dòng)。在圖5中也觀察到PPI的等電點(diǎn)向酸性方向移動(dòng)，表明靜電相互作用提高了PPI在酸性條件下的穩(wěn)定性。注意到2種蛋白濃度下復(fù)合體系的電位較為接近，但在相圖中高蛋白濃度體系卻更不穩(wěn)定，如pH 4.5時(shí)，高蛋白濃度體系僅有復(fù)合比r=1與r=2中無相分離出現(xiàn)，而低蛋白濃度體系在復(fù)合比例為r=5時(shí)，體系中便未出現(xiàn)相分離。這可能是因?yàn)楦叩鞍诐舛认?，體系中的大分子數(shù)量較多，此時(shí)需要更多的γ-PGA來提供陰離子羧基與PPI上的氨基結(jié)合，以提供更強(qiáng)的靜電斥力來阻止分子間的聚集[19]。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

對pH 4.5時(shí)高蛋白濃度的復(fù)合體系進(jìn)行了微觀結(jié)構(gòu)分析。圖中綠色區(qū)域?yàn)榈鞍祝谏珔^(qū)域?yàn)樗嗷蚨嗵窍?。圖6-d～圖6-g中可以看到蛋白發(fā)生了大范圍的聚集，而在圖6-c中蛋白僅發(fā)生了小范圍的聚集，表明γ-PGA開始起到了一定的阻止聚集的作用。圖6-a、圖6-b中可以看到大分子均勻分散的狀態(tài)，表明PPI與γ-PGA形成了可溶性復(fù)合物，體系保持穩(wěn)定。樊雪靜等[20]通過激光共聚焦也發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的大豆分離蛋白在pH 6.0時(shí)出現(xiàn)小范圍聚集，而大豆分離蛋白和寡糖形成的可溶性靜電復(fù)合物卻能保持分散。

2.5 PPI與γ-PGA相互作用對蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)的溶解度影響著蛋白質(zhì)的乳化性，通常溶解度高的蛋白質(zhì)具有較高的界面遷移率[21]。圖7為高蛋白濃度復(fù)合體系在pH 4.5時(shí)的溶解度。隨著復(fù)合比例由大變小，溶解度先降低后升高。當(dāng)復(fù)合比例r=10、15、20時(shí)，蛋白溶解度比PPI略低，這可能是因?yàn)楫?dāng)γ-PGA分子數(shù)量較少時(shí)，PPI與γ-PGA發(fā)生橋聯(lián)絮凝，在龐淑婕等[22]的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。當(dāng)r≤5時(shí)，復(fù)合體系的溶解度顯著升高(P<0.05)，在r=1時(shí)達(dá)到了最大值52.46%，這與MOLINA等[23]在大豆分離蛋白和卡拉膠復(fù)合體系的研究結(jié)果相似。隨著復(fù)合比例的減小，體系中γ-PGA的數(shù)量增大，其與PPI形成復(fù)合物后，復(fù)合物表面的電荷數(shù)量增多，分子間的靜電斥力增大，蛋白溶解度增大。

a-r=1；b-r=2；c-r=5；d-r=10;e-r=15；f-r=20；g-PPI圖6 pH 4.5時(shí)不同復(fù)合比例下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of different mixing ratios at pH 4.5

圖7 pH 4.5時(shí)不同復(fù)合比例下的蛋白溶解度Fig.7 Protein solubility at different mixing ratio at pH 4.5注：小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 PPI與γ-PGA相互作用對乳化性和表面疏水性的影響

研究表明，蛋白的乳化能力與蛋白質(zhì)自身的溶解特性、蛋白組成、分子大小、柔韌性以及表面疏水性有關(guān)，通常疏水性越強(qiáng)，蛋白吸附在界面上的能力越強(qiáng)，乳化能力越好[24]。圖8為不同復(fù)合比例下蛋白的表面疏水性。

圖8 pH 4.5時(shí)不同復(fù)合比例下PPI的表面疏水性Fig.8 Surface hydrophobicity of PPI at different mixing ratio at pH 4.5

隨著復(fù)合比例由大變小，蛋白的表面疏水性顯著增大(P<0.05)，表明靜電相互作用使PPI內(nèi)部的一些疏水基團(tuán)暴露出來，提高了蛋白的表面疏水性，同時(shí)這也說明蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[25]。觀察到r=5的表面疏水性最大，但在圖9中并未表現(xiàn)出最佳的乳化性能，這是因?yàn)榇藭r(shí)蛋白溶解度較低的原因，盡管蛋白能較快吸附在界面上，但參與乳化的蛋白的數(shù)量遠(yuǎn)小于r=1和r=2的體系[26]。

圖9為pH 4.5時(shí)不同復(fù)合比例下PPI的乳化活性與乳化穩(wěn)定性。隨著復(fù)合比例由大變小，乳化活性與乳化穩(wěn)定性先降低后增大。

圖9 pH 4.5時(shí)不同復(fù)合比例下PPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.9 Emulsification activity and emulsification stability of PPI at different mixing ratio at pH 4.5

這是因?yàn)楫?dāng)復(fù)合比較高時(shí)(r=10、15、20)，蛋白溶解度與表面疏水性都較低。圖5-b的電位數(shù)據(jù)也表明此時(shí)體系整體的靜電斥力較低，無法阻止大分子間的聚集。當(dāng)體系中的大多數(shù)蛋白發(fā)生沉淀，參與乳化的蛋白數(shù)量太少不足以包裹油滴時(shí)，小油滴便逐漸聚集成大油滴，體系發(fā)生乳析分層[27]。隨著復(fù)合比例的降低，γ-PGA與PPI通過靜電相互作用形成了可溶性復(fù)合物，溶解度與表面疏水性的增大使參與乳化的蛋白分子數(shù)量增多，界面吸附能力增強(qiáng)，因此乳化活性得到改善。此外可溶性復(fù)合物的形成也增大了體系的靜電斥力和空間位阻，PPI-γ-PGA復(fù)合物包裹油滴后，液滴之間彼此排斥，乳液穩(wěn)定性增強(qiáng)[22]。

3 結(jié)論

通過研究pH、復(fù)合比例、蛋白濃度對PPI與γ-PGA靜電復(fù)合的影響，發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下低蛋白濃度與高蛋白濃度的復(fù)合體系都表現(xiàn)出pHs隨復(fù)合比例減小而減小的現(xiàn)象。在高蛋白濃度(10.0 g/L)，當(dāng)pH<4.5時(shí)，γ-PGA沒有起到足夠強(qiáng)的穩(wěn)定作用，各個(gè)復(fù)合體系中都有沉淀出現(xiàn)。而在pH 4.5時(shí)，復(fù)合比r≤2的體系因具有較大靜電斥力在微觀和宏觀上都能保持穩(wěn)定；靜電相互作用使蛋白的溶解度和表面疏水性增大，改善了蛋白的乳化能力。當(dāng)r=1時(shí)，蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性最好。綜上，通過PPI與γ-PGA的靜電復(fù)合可以提高PPI在酸性條件下的穩(wěn)定性。