葉惠煊 李 敏 黃 勝 冷建宏 顏冬蘭

九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410205

九芝堂股份有限公司生產(chǎn)的獨家中成藥品種“甲芪肝纖顆粒”[標(biāo)準(zhǔn)號：WS3-737（Z-203）-2006（Z）-2007]由黃芪、防己、茯苓等11 味中藥材組成，具有疏肝活血、健脾祛濕的功效。臨床上用于乙型肝炎肝纖維化透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白等血清學(xué)指標(biāo)異常屬肝郁血瘀兼脾虛濕滯者，癥見脅肋疼痛，肝脾腫大，脘腹脹滿，神疲乏力，納差，便溏，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑，舌苔膩等病癥的治療[1-2]。桃仁為本品處方中的臣藥，苦杏仁苷是其有效成分[3-5]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有神經(jīng)保護(hù)[6]、抗纖維化[7]、抗腫瘤[8]等作用。

本品現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，已有防己、延胡索、厚樸、牛膝、莪術(shù)和黃芪的質(zhì)控方法，同時也有學(xué)者建立了該品種黃芪甲苷的含量測定方法[9]，但未建立桃仁的相關(guān)質(zhì)控項目，臨床上存在一定的用藥安全隱患，十分有必要建立相應(yīng)的質(zhì)控方法。薄層色譜法和高效液相色譜法是目前較為常規(guī)的檢測方法，已廣泛運用于中藥、中成藥的質(zhì)量控制[10-13]。因此，本研究開展制劑中桃仁的定性定量方法研究，具體包括如下兩方面內(nèi)容：①以苦杏仁苷對照品和桃仁對照藥材作為對照，利用薄層色譜法建立桃仁的定性質(zhì)控方法；②以苦杏仁苷對照品作為對照，利用高效液相色譜法建立處方中桃仁的定量質(zhì)控方法，同時檢測了15 批次大生產(chǎn)樣品的數(shù)據(jù)，結(jié)合苦杏仁苷含量轉(zhuǎn)移率，擬訂制劑的含量限度。為該品種后續(xù)整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升以及其他含桃仁中藥制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（日本島津公司，型號：2030C）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DZKW）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-700DV）；十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司，型號：MS205DU）；電子分析天平（日本島津公司，型號：ATX224）；薄層層析板（德國默克公司，型號：硅膠G）。

1.2 試藥

桃仁（山桃仁）對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120953-200705），苦杏仁苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-201305，純度85.8%；中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-202109），甲芪肝纖顆粒（九芝堂股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030056），甲醇的級別為色譜純，水的級別為超純水，其他試劑的級別為分析純。本研究中所使用的飲片及輔料，均符合《中華人民共和國藥典》的質(zhì)量要求[14]。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別方法研究[15]

2.1.1 色譜條件 采用硅膠G 薄層板，以體積比為15 ∶40 ∶30 ∶10 的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液，于10℃以下放置12 h 后分取下層液作為展開溶劑，展開后取出薄層板，自然揮干溶液，然后用香草醛硫酸溶液（5 g →100 ml）噴灑均勻，放置烘箱中（溫度為105℃）加熱，直至目標(biāo)斑點顯色為止，取出進(jìn)行檢視。

2.1.2 苦杏仁苷對照品溶液的配制 取苦杏仁苷對照品，加適量甲醇溶解后，搖勻，制成苦杏仁苷對照品溶液（濃度為2 mg/ml），放置于冰箱備用。

2.1.3 桃仁對照藥材溶液的制備 稱取桃仁對照藥材約1 g，加50 ml 純化水加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣再加甲醇1 ml 復(fù)溶，作為對照藥材溶液，放置于冰箱備用。

2.1.4 供試品溶液的制備 取甲芪肝纖顆粒約5 g，稱定，粉碎，加甲醇15 ml 并超聲處理20 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加5 ml 溫水溶解后放置至室溫，采用大孔吸附樹脂柱（型號為D101 型，內(nèi)徑為1.5 cm，長度為8 cm），加20 ml水洗脫，棄去水液，用氨試液（4 →100）30 ml 洗脫，棄去氨液，再量取10 ml 純化水洗脫，水液棄去，再用濃度為20%的乙醇30 ml 進(jìn)行洗脫，回收洗脫液至干，殘渣再加l ml甲醇復(fù)溶，即得。

2.1.5 陰性對照樣品溶液的制備 除桃仁外，取甲芪肝纖顆粒處方中其他藥味，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制成陰性對照樣品。取陰性對照樣品約5 g，稱定，研細(xì)，照2.1.4項下供試品溶液制備方法制成陰性對照樣品溶液。

2.1.6 實驗結(jié)果 取3 批樣品（批號分別為20201216、20201217 和20201218），按照2.1.4 項下方法，分別制備相應(yīng)的供試品溶液。依次精密吸取供試品溶液和陰性對照樣品溶液各5 μl、苦杏仁苷對照品溶液和桃仁對照藥材溶液各10 μl，按確定的色譜條件進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖1。在供試品的薄層色譜中，呈現(xiàn)出與苦杏仁苷對照品和桃仁對照藥材薄層色譜相同顏色的目標(biāo)斑點，且陰性對照樣品無干擾。

圖1 桃仁的TLC 鑒別

2.2 含量測定方法研究[14，16]

2.2.1 色譜條件 采用色譜柱SHIMADZU C18-120（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液（20 ∶80），等度洗脫；檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2.2 對照品溶液的配制 取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定后加適量甲醇溶解并搖勻，制成對照品儲備溶液（濃度為0.56 mg/ml）。精密吸取上述對照品儲備溶液10 ml，加甲醇稀釋5 倍后搖勻，制成的對照品溶液（濃度為0.11 mg/ml），放置于冰箱備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取批號為20201216 的樣品，粉碎，精密稱取約1.0 g，置于錐形瓶中，精密量取并加入25 ml 的50%甲醇，稱重，采用超聲波提取法（功率為700 W，頻率為40 kHz）提取45 min，取上清液，用微孔濾膜（規(guī)格為0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取陰性對照樣品約1.0 g，精密稱定，按照2.2.3 項下供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系、檢測限和定量限的考察 取2.2.2項下的對照品儲備溶液，得對照品溶液①。取溶液①30 ml 轉(zhuǎn)移至50 ml 的棕色量瓶中，加適量甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液②，取對照品溶液②40 ml 轉(zhuǎn)移至50 ml 的棕色量瓶中，加適量甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液③，取溶液③30 ml 轉(zhuǎn)移至50 ml的棕色量瓶中，加適量甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液④，取溶液④20 ml 轉(zhuǎn)移至50 ml 的棕色量瓶中，加適量甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液⑤，取溶液⑤10 ml 轉(zhuǎn)移至50 ml 的棕色量瓶中，加適量甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液⑥。精密吸取上述6 種對照品溶液各10 μl，依次測定，以苦杏仁苷對照品的峰面積y為縱坐標(biāo)、濃度x為橫坐標(biāo)，將檢測結(jié)果通過線性回歸計算后繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算得到回歸方程：y=7940x+19343，R2=1。結(jié)果表明，苦杏仁苷在6.46 ～560.45 μg/ml 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。按照3 倍和10 倍的信噪比分別考察檢測限和定量限，結(jié)果分別為1.29 μg 和4.48 μg。

2.2.6 專屬性考察 取供試品溶液、對照品溶液以及陰性對照溶液，按確定的色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖2）。將陰性對照溶液與供試品溶液的色譜圖相比較，結(jié)果在苦杏仁苷色譜峰的相應(yīng)保留時間上無色譜峰，表明該方法專屬性好。

圖2 HPLC 圖

2.2.7 精密度考察 精密吸取供試品溶液10 μl，進(jìn)樣6 次，測得的苦杏仁苷色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為0.62%，說明高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，精密吸取10 μl，分 別 在0、2、4、6、8、12 和24 h 依 次 進(jìn) 樣。結(jié)果供試品溶液中苦杏仁苷色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為2.30%，表明其在24 h 內(nèi)檢測穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性考察 取批號為20201216 的甲芪肝纖顆粒樣品，粉碎，平行制備6 份供試品溶液，依次進(jìn)樣，結(jié)果苦杏仁苷色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為1.94%，表明已建立的方法重復(fù)性較好。

2.2.10 加樣回收率考察 取批號為20201216 的甲芪肝纖顆粒樣品（苦杏仁苷含量5.8185 mg/g），粉碎，精密稱取0.5 g，分別加入苦杏仁苷對照品2.94 mg，平行制備6 份供試品溶液，依次進(jìn)樣測定，通過計算得苦杏仁苷的平均回收率為97.91%，RSD值為1.04%。見表1。

表1 苦杏仁苷加樣回收結(jié)果（n=6）

2.2.11 耐用性考察 為確定已建立的含量測定方法的耐用程度是否良好，故選擇3 個型號的色譜柱進(jìn)行考察。結(jié)果在使用不同型號色譜柱的條件下，樣品均能夠準(zhǔn)確定量，表明方法耐用性較好。見表2。

表2 方法耐用性考察結(jié)果表（n=2）

2.2.12 含量測定 取15 批次甲芪肝纖顆粒樣品，分別制備供試品溶液，每批次樣品分別平行制備2 份，依次進(jìn)樣測定，同時采用外標(biāo)法計算本品中桃仁的苦杏仁苷含量，具體結(jié)果見表3。

表3 15批次甲芪肝纖顆粒的含量測定結(jié)果表（n=2）

根據(jù)表3 結(jié)果可知，15 批甲芪肝纖顆粒中苦杏仁苷含量平均值為6.77 mg/g，藥材→成品的平均轉(zhuǎn)移率為50.87%。根據(jù)2020 年版《中華人民共和國藥典》一部[14]桃仁項下苦杏仁苷含量的最低限度為2.0%，同時考慮到苦杏仁苷在大生產(chǎn)過程中的損失的情況，按苦杏仁苷在本品中的轉(zhuǎn)移率以不低于40%計算，故暫定本品中含桃仁以苦杏仁苷（C20H27NO11）含量計算為3.36 mg/g。

3 討論

3.1 TLC前處理優(yōu)化

TLC 前處理方法參考了2020 年版《中華人民共和國藥典》一部[14]桃仁項下的鑒別方法，但目標(biāo)斑點拖尾不清晰，影響結(jié)果判斷。而采用D101 型大孔吸附樹脂柱進(jìn)行除雜，則斑點明顯，重復(fù)性良好，故采用其作為TLC 前處理的方法。

3.2 TLC展開劑考察

采用三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水系統(tǒng) 進(jìn) 行 展 開，分 別 考 察（15 ∶40 ∶22 ∶10）和（15 ∶40 ∶30 ∶10）比 例 在10 ℃以 下放置12 h 的下層溶液為展開劑，結(jié)果表明（15 ∶40 ∶30 ∶10）的比例較優(yōu)，目標(biāo)斑點Rf 值適中，方法重復(fù)性良好，故采用其作為TLC 展開系統(tǒng)。

3.3 HPLC前處理條件優(yōu)化

在建立桃仁中苦杏仁苷的HPLC 含量測定方法時，對樣品前處理條件開展了單因素考察實驗，結(jié)果在采用超聲法提取45 min、使用50%的甲醇作為提取溶劑的條件下，樣品中的苦杏仁苷色譜峰響應(yīng)值較好，定量準(zhǔn)確，作為HPLC 前處理條件較為合適。

本研究較為系統(tǒng)的開展了甲芪肝纖顆粒中桃仁的定性定量質(zhì)控方法研究，結(jié)果顯示該方法重復(fù)性好、重現(xiàn)性佳，為甲芪肝纖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的全面提升奠定了一定的基礎(chǔ)。同時，該質(zhì)控方法的建立，對處方中含有桃仁的中藥、中成藥的質(zhì)量研究也提供了一定的參考依據(jù)。