劉蔚雯 張學(xué)強(qiáng) 戴燕真 黃 群▲

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.國(guó)藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司，廣東 汕頭 363509

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種腸道功能紊亂疾病，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉，伴有排便頻率改變和大便性狀異常[1]。根據(jù)羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)[2]分為4 種亞型：腹瀉型、便秘型、混合型和不定型，在我國(guó)以腹瀉型腸易激綜合征（diarrheal irritable bowel syndrome，IBS-D）最為多見(jiàn)。該病慢性進(jìn)展，持續(xù)或間歇發(fā)作，給患者日常生活和心理健康帶來(lái)極大困擾。現(xiàn)有治療手段局限于改善癥狀，緩解病情，卻難以根治。IBS-D 在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“泄瀉”“腹痛”等范疇，臨床辨證分型為脾虛濕盛型、肝郁脾虛型、脾腎陽(yáng)虛型、脾胃濕熱型等[3]，IBS-D 患者脾虛濕盛型比例高達(dá)40%[4]，提示健脾燥濕止瀉法在治療中具有積極意義。前期研究表明[5]，以健脾燥濕法為指導(dǎo)組成的術(shù)連飲方，能夠改善功能性消化不良大鼠腸運(yùn)動(dòng)障礙。本研究通過(guò)觀察術(shù)連飲對(duì)IBS-D 大鼠體重、進(jìn)食量、Bristol 評(píng)分、P 物質(zhì)（substance P，SP）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide，NPY）的影響，探討術(shù)連飲調(diào)節(jié)腦腸肽的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體重（210±20）g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（閩）2016-0002。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見(jiàn)》的原則和要求[6]。根據(jù)體重均衡原則，按照隨機(jī)數(shù)表法分為空白組、模型組、匹維溴銨組和術(shù)連飲組，每組各10 只。

1.2 藥品與試劑

番瀉葉（江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：1908006），術(shù)連飲，即生白術(shù)與黃連（黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：D9080101），匹維溴銨片（法國(guó)Abbott Laboratories Limited，批號(hào)：708624）。SP 抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)：DF6541），NPY 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：PB9296）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

7300 熒 光 定 量PCR 儀（美 國(guó)ABI 公 司），Tamon-5200 超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.4 造模與模型評(píng)價(jià)

番瀉葉灌胃結(jié)合束縛法復(fù)制IBS-D 模型大鼠[7]：空白組灌胃20 ml/kg 生理鹽水，不做束縛刺激，其余大鼠均灌胃番瀉葉水煎液20 ml/kg，2 次/d，灌服1 h 后，用軟毛發(fā)圈束縛大鼠前肢，并將透明膠帶纏繞其肩部與胸部，束縛1 h，連續(xù)14 d。

造模后大鼠體形消瘦，束縛時(shí)暴躁，易激惹，解除束縛后精神萎靡，喜扎堆倦臥懶動(dòng)，大便稀溏，肛周及尾部沾染稀便，污濁臭穢。模型組大鼠體重、進(jìn)食量均減少，Bristol 評(píng)分升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），表明模型復(fù)制成功。造模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

1.5 給藥方法

造模成功后于第15 天開(kāi)始給藥，除空白組外，其余各組繼續(xù)灌服番瀉葉煎液20 ml/kg，1 h后灌胃給藥，空白組與模型組均灌胃等體積生理鹽水，匹維溴銨組生藥18.5 mg/kg，術(shù)連飲組生藥4.6 g/kg。給藥1 h 后，束縛1 h，1 次/d，連續(xù)14 d。

1.6 樣本采集

于實(shí)驗(yàn)第28 天，禁食（不禁水、藥）24 h，第29 天以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹腔采血后，快速斷頭取腦，在冰臺(tái)上分離下丘腦，截取距離大鼠肛緣約6 cm處結(jié)腸樣本，置于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.7 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

體重的測(cè)定：每周固定時(shí)間對(duì)各組大鼠稱重，觀察體重的變化。

進(jìn)食量的測(cè)定：測(cè)定各組單只大鼠日平均進(jìn)食量。每天固定時(shí)間添加定量飼料（500 g），24 h 后稱取剩余飼料重量。日平均進(jìn)食量（g）=（加料量-剩余量）/每組大鼠只數(shù)。

Bristol 評(píng)分：分別于造模前（第1 天）、給藥前（第14 天）、給藥后（第28 天）進(jìn)行評(píng)分，大鼠分籠單只飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水，收集2 h 內(nèi)糞便，根據(jù)Bristol 分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評(píng)分。見(jiàn)表1。

表1 Bristol分級(jí)及評(píng)分

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)SP、NPY mRNA 表達(dá)：稱取下丘腦和結(jié)腸組織各50 mg，充分研磨，用Trizol 試劑提取總RNA，取1 μg的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA 產(chǎn)物配置qPCR 反應(yīng)體系，引物序列由福州鉑尚生物有限公司合成。見(jiàn)表2。

表2 引物序列

Western blot 法檢測(cè)SP、NPY 蛋白表達(dá)：采用預(yù)冷RIPA 蛋白抽提試劑提取蛋白，按0.1 g 組織加入1 ml 含PMSF 的RIPA 裂解液，充分勻漿，冰浴30 min，4℃離心，12 000 rpm，5 min，吸取上清液，移至預(yù)冷離心管中。加入BSA 標(biāo)準(zhǔn)液，檢測(cè)樣品蛋白含量，按1 ∶4 比例加入5×SDS-PAGE loading buffer，水浴加熱5 min，以充分變性蛋白。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量，配制5%濃縮膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育，曝光顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，行t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，使用秩和檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠體重變化比較

造模前各組大鼠體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。造模14 d 后（給藥前），模型組、匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠體重均低于空白組（P＜ 0.01）；治療14 d 后（給藥后），匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠體重均高于模型組（P＜ 0.01）。見(jiàn)表3。

表3 四組大鼠體重變化比較（g，x ± s）

2.2 四組大鼠日平均進(jìn)食量比較

造模前各組大鼠進(jìn)食量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。造模期（14 d）模型組、匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠進(jìn)食量均低于空白組（P＜ 0.01）；治療期（14 d）匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠進(jìn)食量均高于模型組（P＜ 0.01）。見(jiàn)表4。

表4 四組大鼠日平均進(jìn)食量比較（g，x ± s）

2.3 四組大鼠Bristol評(píng)分比較

造模前各組大鼠Bristol 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。給藥前模型組、匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠Bristol 評(píng)分均高于空白組（P＜ 0.01）；給藥后匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠Bristol 評(píng)分均低于模型組（P＜ 0.05）。見(jiàn)表5。

表5 四組大鼠Bristol評(píng)分比較（分，x ± s）

2.4 四組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP、NPYmRNA表達(dá)比較

模型組大鼠下丘腦及結(jié)腸SP mRNA 表達(dá)高于空白組，NPY mRNA 表達(dá)低于空白組（P＜ 0.01）。匹維溴銨組、術(shù)連飲組大鼠SP mRNA 表達(dá)均低于模型組，NPY mRNA 表達(dá)均高于模型組（P＜ 0.01）。見(jiàn)表6。

表6 四組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP、NPY mRNA表達(dá)比較（x ± s）

2.5 四組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP、NPY蛋白表達(dá)比較

模型組大鼠下丘腦及結(jié)腸SP 蛋白表達(dá)高于空白組，NPY 蛋白表達(dá)低于空白組（P＜ 0.01）。匹維溴銨組、術(shù)連飲組SP 蛋白表達(dá)均低于模型組，NPY蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1、表7。

表7 四組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP、NPY蛋白表達(dá)比較（x ± s）

圖1 大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP、NPY 蛋白電泳圖

3 討論

隨著神經(jīng)胃腸病學(xué)研究的深入，腦-腸互動(dòng)異常與IBS 發(fā)病的相關(guān)性日益受到重視。研究表明[9]，IBS 患者給予直腸擴(kuò)張后，其大腦邊緣系統(tǒng)明顯活躍，而邊緣系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)處理疼痛應(yīng)激與情緒反應(yīng)等。由此可見(jiàn)，持續(xù)的腸道刺激可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）異常反饋，出現(xiàn)腦-腸互動(dòng)異常，而腦腸肽作為腦-腸互動(dòng)的中介，發(fā)揮著重要的作用。腦腸肽是一種小分子多肽，在CNS、腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）及胃腸道均有分布，既可作為神經(jīng)遞質(zhì)傳遞信息，亦可作為激素發(fā)揮雙重作用，與IBS 發(fā)病相關(guān)的腦腸肽主要有SP、NPY 等。SP 是一種興奮性腦腸肽，廣泛分布于CNS 與ENS 中，許向前[10]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IBS-D 模型大鼠的十二指腸及下丘腦組織中SP 含量明顯升高，SP 的升高能夠促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，刺激腸黏膜分泌水和電解質(zhì)，從而引起腹瀉。NPY 是一種抑制性腦腸肽，主要存在于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞中，在腸神經(jīng)叢可與周圍性乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶相結(jié)合，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)和水、電解質(zhì)的分泌等；在下丘腦和海馬，NPY 可發(fā)揮中樞拮抗應(yīng)激與穩(wěn)定情緒等作用。研究顯示[11]，IBS 患者結(jié)腸及下丘腦組織中NPY 的含量低于正常人。馬軍等[12]研究表明，IBS-D 大鼠結(jié)腸組織NPY 蛋白表達(dá)顯著降低。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織中SP 蛋白及其mRNA 表達(dá)升高，NPY 蛋白及其mRNA 表達(dá)降低，Bristol 評(píng)分明顯升高，大便稀軟或不成形。經(jīng)術(shù)連飲治療后，Bristol評(píng)分明顯降低，稀水便減少或成形。提示術(shù)連飲可能通過(guò)影響興奮性和抑制性腦腸肽的分泌，下調(diào)SP、上調(diào)NPY 表達(dá)，使腹瀉癥狀得以好轉(zhuǎn)，達(dá)到治療IBS-D 目的。關(guān)于SP 與NPY 之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路研究，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入探討。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)“腦腸互動(dòng)”這一概念，但腦腸相通的整體觀早已貫穿于經(jīng)絡(luò)與藏象學(xué)說(shuō)之中。腦為奇恒之腑，位居頭部，而頭為“諸陽(yáng)之會(huì)”，例如足陽(yáng)明胃經(jīng)與手陽(yáng)明大腸經(jīng)于鼻旁相接，說(shuō)明頭面（腦）與胃腸經(jīng)絡(luò)相連，存在著信息交互傳遞的通道?！夺t(yī)林改錯(cuò)》曰[13]：“靈機(jī)記性在腦者，因飲食生氣血，長(zhǎng)肌肉，精汁之清者，化而為髓，由脊髓上行入腦，名曰腦髓”，王清任明確指出腦主神明，為髓之海，其生理功能的正常發(fā)揮有賴于后天之精的充養(yǎng)，而后天之精主要來(lái)源于脾胃腸共同作用所化生之水谷精微。若脾失健運(yùn)，氣血生化乏源，以致髓海不充，腦府失養(yǎng)，與腸腑之互動(dòng)失衡；且脾虛易于生濕，濕郁化熱，下注大腸，腸腑傳化失司，升降失常，則見(jiàn)泄瀉。上述所論可知，脾虛與濕盛是IBS-D 病機(jī)的兩個(gè)主要方面，治當(dāng)以健脾燥濕，清腸止利立法。術(shù)連飲由白術(shù)、黃連組方而成，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曾謂[14]：“白術(shù)，性溫而燥，氣不香竄，味苦微甘微辛，善健脾胃，消痰水，止泄瀉”。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載黃連“主腸澼腹痛下痢”[15]，《本草正義》亦云：“黃連大苦大寒，苦燥濕，寒勝熱，能泄降一切有余之濕火”[16]。方中生白術(shù)、黃連之比為4 ∶1，重用白術(shù)為君，功擅健脾燥濕止瀉；輔以黃連，善清脾胃大腸濕熱，一則助君藥燥濕止痢；二則清濕郁所生之熱；三則苦寒以制白術(shù)之溫，而無(wú)助熱之虞，且黃連之降泄與白術(shù)之升清，可調(diào)氣機(jī)之升降，是臣藥而兼佐藥之能。合而用之，共成補(bǔ)清兼顧，升降同調(diào)之劑，使脾虛得健，濕去熱清，而泄利自止。