邊艷超 張傳領(lǐng) 張 浩 王萬倫 張 婷 劉桐佳 劉 爽 邢凱佳 肖 瑞▲

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；

2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059

肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kianse，MYLK）主要由平滑肌型肌球蛋白輕鏈激酶和非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶構(gòu)成，是生物過程重要參與者[1]。MYLK 是一種鈣調(diào)素依賴酶，使肌球蛋白得以激活肌球蛋白ATP 酶，通過內(nèi)皮細胞骨架重塑，促進肌球蛋白驅(qū)動收縮、應(yīng)力纖維形成、黏附、細胞遷移和細胞增殖[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，MYLK 蛋白與精子運動性有緊密的關(guān)系，Ashizawa[5]在脫膜精子內(nèi)加入MYLK 特異性抑制劑，脫膜精子在30℃下的運動性明顯被抑制；還有研究發(fā)現(xiàn)，MYLK1 對囊胚的形成及雌性生育力的維持是必不可少的[6-7]，由此可見，MYLK 在改善雄性生育力問題上可能起著重要的作用。鑒于MYLK 的重要作用，本研究借助生物信息學方法對MYLK 基因的結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等方面進行預測，為進一步研究MYLK 蛋白的功能調(diào)節(jié)機制奠定理論基礎(chǔ)，更有利于了解其影響人類生育力的生物學作用。

1 材料與方法

采用美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 查 找 小 鼠MYLK 基因序列，獲得MYLK 基因全長編碼區(qū)序列，對其基因編碼的產(chǎn)物及理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位、磷酸化位點及蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)等進行生物信息學分析與預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYLK基因編碼產(chǎn)物及理化性質(zhì)分析

MYLK 基因位于16 號染色體，含35 個外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物片段大小為7809 bp。將MYLK 基因編碼的氨基酸序列通過ExPASy 中的ProtParam 工具進行氨基酸理化性質(zhì)預測，MYLK 蛋白分子結(jié)構(gòu)式為C9310H14884N2642O2955S78，含1950 個氨基酸殘基，分子量為213 609.21 kD，理論等電點為5.92，原子總數(shù)為29 869；氨基酸組成中，Glu 含量最高，為8.8%；MYLK 的不穩(wěn)定系數(shù)為44.46，≥40，判定其為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪系數(shù)為71.57，親水性評估系數(shù)為-0.563。

使用ProtScale 數(shù)據(jù)庫對MYLK 蛋白的親疏水性進行預測[8]，結(jié)果表明，MYLK 蛋白親水性最大的氨基酸是Glu，分值為-3.167，疏水性最大的氨基酸是Cys，分值為2.944。從氨基酸序列親疏水性分布圖（圖1）可以看出，MYLK 蛋白的親水性氨基酸要明顯多于疏水性氨基酸，表明MYLK 為親水性蛋白。

圖1 MYLK 蛋白親水性/疏水性分析

2.2 MYLK信號肽分析

利用在線分析工具SignalP[9-10]，對MYLK 編碼的氨基酸序列進行信號肽預測。結(jié)果表明（圖2），MYLK 蛋白的1 ～70 個氨基酸可能是其信號肽序列，但未見其信號肽剪切位點，表明該蛋白為非分泌性蛋白。

圖2 MYLK 蛋白信號肽分析

2.3 MYLK蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測分析

選用TMHMM 2.0 對MYLK 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預測[11]，結(jié)果表明（圖3），MYLK 不存在跨膜區(qū)域，說明MYLK 蛋白質(zhì)不是跨膜蛋白質(zhì)，因此，推測MYLK 主要進入細胞核中參與RNA 的形成過程，主要作用區(qū)域分布于細胞核。

圖3 MYLK 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.4 MYLK蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

利用SMOPA 軟件預測MYLK 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[12]，結(jié)果表明（圖4），MYLK 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占49.85%，α 螺旋占22.82%，延伸鏈占20.10%，β 折疊占7.23%，提示MYLK 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α 螺旋構(gòu)成。

圖4 MYLK 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

2.5 MYLK蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

采用同源建模法Swiss-Model 進行建模[13-14]，基于唐氏綜合征細胞黏附分子（DSCAM）原子結(jié)構(gòu)進行同源建模，兩者的序列一致性可以達到44.31%，GMQE 值為0.12，QMEAN 值達到-3.93，以上評分說明建模質(zhì)量較好（圖5）。

圖5 MYLK 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.6 MYLK蛋白結(jié)構(gòu)域預測

使用SMART 在線工具對MYLK 蛋白功能結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果表明（圖6），MYLK 蛋白有四種結(jié)構(gòu)域，在整個蛋白序列上共有八處免疫球蛋白C-2型（IGc2）功能結(jié)構(gòu)域，IG 功能結(jié)構(gòu)域、FN3 結(jié)構(gòu)域、S_TKc 結(jié)構(gòu)域各一處。在FN3 結(jié)構(gòu)域中存在Arg-Gly-Asp（RGD）序列；S_TKc 屬于催化結(jié)構(gòu)域，為絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶亞家族。

圖6 MYLK 蛋白結(jié)構(gòu)域預測

2.7 MYLK蛋白亞細胞定位和磷酸化分析

經(jīng)過亞細胞定位分析顯示，該序列主要在細 胞 核（30.40%）、細 胞 質(zhì)（26.10%）、高 爾 基 體（13.00%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（13.00%）、線粒體（8.70%）、分泌小泡（4.30%）等結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)揮其生物學作用。該蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸化分析表明（圖7），小鼠MYLK 蛋白質(zhì)有較多的Thr、Ser 磷酸化位點，Tyr 磷酸化位點相對較少。

圖7 小鼠MYLK 蛋白磷酸化位點預測

2.8 MYLK相互作用蛋白分析

運用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建MYLK 的蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）[15]，從PPI 中發(fā)現(xiàn)（圖8），相互作用蛋白包括肌球蛋白家族和鈣調(diào)蛋白家族蛋白成員。

圖8 小鼠MYLK PPI

3 討論

MYLK 是一種依賴于鈣調(diào)蛋白激活肌球蛋白輕鏈磷酸化的重要激酶，其在多種細胞中都有表達，在細胞黏附、遷移、凋亡等生理活動中發(fā)揮重要作用[16]。

本研究應(yīng)用生物信息學方法，對MYLK 基因的結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等方面進行預測，發(fā)現(xiàn)MYLK 由1950 個氨基酸構(gòu)成，為理論等電點為5.92、評估系數(shù)為-0.563 的親水性不穩(wěn)定蛋白，MYLK 的親水性結(jié)構(gòu)有利于MYLK 蛋白在細胞質(zhì)或細胞核中游離，當其發(fā)揮功能時，可迅速與RNA/DNA 結(jié)合，使其內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)被外部的親水結(jié)構(gòu)保護[13]。此外，經(jīng)預測分析，MYLK 為非分泌型、非跨膜蛋白質(zhì)，因此，推測MYLK 主要進入細胞核中參與RNA 的形成過程，主要作用區(qū)域分布在細胞核，不經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體修飾運輸，通過核孔復合體直接進入細胞核，參與RNA 的形成。

對MYLK 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，其49.85%的氨基酸組成無規(guī)則卷曲。因此，小鼠MYLK 蛋白的功能可能與其中較多的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過MYLK 功能結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其有四種結(jié)構(gòu)域，其中IGc2 功能結(jié)構(gòu)域參與多種功能，包括細胞-細胞識別、細胞-表面受體、肌肉結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)。此外還有IG 功能結(jié)構(gòu)域以及FN3 結(jié)構(gòu)域，在各種FN3 結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)存在RGD 序列，含有RGD 序列的小肽可以調(diào)節(jié)與血栓形成、炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的各種細胞黏附發(fā)生。S_TKc 屬于磷酸轉(zhuǎn)移酶或蘇氨酸特異性激酶亞家族，其在多種細胞過程中發(fā)揮作用，包括分裂、增殖、凋亡和分化。小鼠MYLK 蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸化分析表明，其有較多的Thr 以及Ser 磷酸化位點，Tyr 磷酸化位點相對較少。而Thr 和Ser 磷酸化的主要作用是激活蛋白質(zhì)的活力，提示小鼠MYLK 蛋白質(zhì)酶活力較強。通過STRING 數(shù)據(jù)庫建立PPI，得到十個互作蛋白，主要由肌球蛋白和鈣調(diào)蛋白兩種蛋白構(gòu)成。

綜上所述，通過對小鼠MYLK 基因結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)MYLK 是具有核定位、無跨膜結(jié)構(gòu)、非分泌型、親水性不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，MYLK 無需跨膜轉(zhuǎn)運的過程，通過核孔復合體直接進入細胞核，參與RNA 的形成，其酶活力較強，在細胞黏附、遷移、凋亡等生理活動中具有極為重要的意義。