李 戈 姚夢瑋 李玉遷 李 勝 方小涵 魏 洪▲

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室 感染與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550000；

2.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，全球腫瘤發(fā)病率位居第三位[1]，多數(shù)結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期進(jìn)而發(fā)生結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[2]。目前結(jié)直腸癌的治療手段主要是手術(shù)切除、放療和化療[3]，雖然不斷有新的治療方案[4]，但其遠(yuǎn)期生存率仍較低。因此，迫切需要新的方式來治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和侵襲。水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）能夠選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞，但不影響正常細(xì)胞，是一種很有前途的治療癌癥的新型溶瘤病毒[5]。VSV 可治療小鼠結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[6]和抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移[7]。國內(nèi)外少有報(bào)道VSV 對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制。因此，本研究探討VSV 對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探究其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、綠猴腎上皮細(xì)胞Vero、VSV（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院感染與免疫學(xué)教研室）；抗MMP-2 抗體（Proteintech 公司）；抗MMP-9 抗體（SAB 公司）；抗GAPDH 抗體（Abcam公司）；二抗（兔抗，普美生物公司）；二甲基亞砜、胎牛血清（四季青公司）；高糖DMEM、青霉素鏈霉素、胰蛋白酶EDTA（美國Gibco 公司）；PCR 熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（同仁化學(xué)研究所）；Tanswell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠（美國Corning 公司）；4℃臺(tái)式離心機(jī)（丹麥LaboGene 公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；倒置顯微鏡、Real time PCR 儀、多功能凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、10×青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)按照VSV 濃度（MOI=0.01、0.1、1、10、100） 和 時(shí) 間（24、48 h）設(shè)置分組；其余實(shí)驗(yàn)分為3 組，即對照組、VSV（MOI=0.01、0.1）處理組。每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 VSV 增殖、濃縮 培養(yǎng)Vero 細(xì)胞，感染VSV 1 周后收集病毒。采用聚乙二醇法濃縮病毒，離心后棄上清，以無血清的DMEM 重懸沉淀，分裝后放入-80℃冰箱保存。滴度測定：按Reed-Muench 法計(jì)算TCID50。

1.2.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況 采用CCK-8法檢測VSV 對SW480 細(xì)胞的增殖抑制作用，SW480 細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，VSV 處理組加入不同濃度的VSV，對照組加入等量的培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48 h，每孔加入10μl CCK-8 檢測液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在490 nm 處檢測吸光度（A）值，每組6 個(gè)復(fù)孔計(jì)算平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 在6 孔板中接種2 ml SW480 細(xì)胞懸液（5×105個(gè)/孔），當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿孔底到90%，用槍頭垂直與細(xì)胞板底部劃線，PBS沖洗脫落細(xì)胞，用VSV 處理細(xì)胞，并設(shè)置陰性對照組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0、24、48 h 時(shí)在倒置顯微鏡下觀察并拍照，用Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 使用24 孔板和8μm 孔徑的聚對苯二甲酸乙二醇酯過濾膜插入物來測定細(xì)胞的侵襲能力。小室預(yù)先涂有Matrix，5×104個(gè)細(xì)胞加入上室，20%胎牛血清的DMEM 充入下室。下室的入侵細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后用甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)（qPCR） 總RNA 從VSV 處 理 的SW480 細(xì) 胞 中 按 照RNA提取試劑盒提取。采用cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn) 錄，以GAPDH 為 內(nèi) 參 對 照，采 用2-ΔΔCT計(jì)算相對mRNA 表達(dá)水平。MMP-2 引物序列上游5’-TTGACGGTAAGGACGGACTC-3’， 下 游5’-GGCGTTCCCATACTTCACAC-3’；MMP-9 引物序列上游5’-GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC-3’，下游5’-CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT-3’；GAPDH引物序列上游5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游5’-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。

1.2.8 Western blot 檢 測 蛋 白 表 達(dá) VSV 處 理SW480細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液混勻，在冰上裂解1 h，4℃、12 000 r/min 離心40 min，取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取等量蛋白上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDE）膜，5%脫脂奶粉封閉目的條帶PVDF 膜2 h，PBST洗膜3 次；加入一抗4℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次；加二抗室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次；ECL 試劑顯色。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，應(yīng)用Image J 對灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSV擴(kuò)增及滴度測定

VSV 感染Vero 細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落現(xiàn) 象。病 毒TCID50 約 為1×107.386，PFUs 約 為1.7×107pfu/ml。

2.2 VSV對SW480細(xì)胞增殖能力的影響

不 同 濃 度（MOI=100、10、1、0.1、0.01）的VSV在24、48 h 作用SW480，24、48 h 細(xì)胞增殖率見表1、圖1，VSV 處理組細(xì)胞增殖率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表1 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖率的檢測（%，x ± s）

圖1 VSV 對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 VSV對SW480細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，24 h SW480 細(xì)胞對照組遷移率為（15.813±0.368）%，MOI 為0.01 和0.1 的VSV處理SW480 細(xì)胞遷移率分別為（5.873±0.393）%和（2.530±0.345）%（t=7.912，P＜ 0.001）；48 h對照組遷移率為（21.000±0.380）%，MOI=0.01、0.1 的VSV 處 理SW480 細(xì) 胞 遷 移 率 分 別 為（8.950±0.552）% 和（7.772±0.290）%（t=20.180，P＜ 0.001），VSV 處理組細(xì)胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2。Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，對照組和VSV 處理組細(xì)胞遷移數(shù)分別為（375.000±13.233）和（61.560±2.520）個(gè)/HP，VSV處理組細(xì)胞遷移數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.060，P=0.001），見圖3。

圖2 VSV 對SW480 細(xì)胞遷移能力的影響（100×）

圖3 VSV 對SW480 細(xì)胞遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色200×）

2.4 VSV對SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，對照組和VSV 處理組（MOI=0.1）侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（71.650±0.584）和（16.651±0.580）個(gè)/HP，VSV 處理組（MOI=0.1）細(xì)胞侵襲數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.330，P＜ 0.0001），見圖4。

圖4 VSV 對SW480 細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色200×）

2.5 VSV對SW480細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響

qPCR 結(jié) 果 顯 示，SW480 細(xì) 胞 對 照 組MMP-2 mRNA 表達(dá)量為（1.000±0.090），MOI=0.01 的VSV 處理組細(xì)胞的MMP-2 mRNA 表達(dá)量為（1.055±0.119），與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），MOI=0.1的VSV 處理組細(xì)胞的MMP-2 mRNA 表達(dá)量為（1.880±0.100），VSV處理組MMP-2表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；對照組MMP-9 mRNA 表達(dá) 量 為（1.020±0.154），MOI=0.01 的VSV 處 理 組細(xì)胞的MMP-9 mRNA 表達(dá)量為（0.832±0.153），與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），MOI=0.1的VSV 處理組細(xì)胞的MMP-9 mRNA 表達(dá)量為（0.610±0.090），VSV 處理組MMP-9 表達(dá)量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖5。

Western blot 結(jié) 果 顯 示，SW480 細(xì) 胞 對 照組MMP-2 蛋 白 表 達(dá) 水 平 為（0.847±0.022），MOI=0.01 的VSV 處理組MMP-2 蛋白表達(dá)水平為（0.980±0.025），MOI=0.1 的VSV 處理組MMP-2 蛋白表達(dá)水平為（1.338±0.034），VSV 處理組MMP-2表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖5；SW480 細(xì)胞對照組MMP-9 蛋白表達(dá)水平為（0.777±0.020），MOI=0.01 的VSV 處理組MMP-9蛋白表達(dá)水平為（0.473±0.012），MOI=0.1 的VSV處理組MMP-9 蛋白表達(dá)水平為（0.497±0.013），VSV 處理組MMP-9 表達(dá)量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖6。

圖5 VSV 對SW480 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白mRNA 表達(dá)的影響

圖6 VSV 對SW480 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白的蛋白表達(dá)的影響

3 討論

CRC 是一種全球發(fā)病率較高的疾病，在癌癥病死中排名第五[8-9]。隨著腫瘤階段的進(jìn)展，轉(zhuǎn)移的發(fā)生使CRC 的病死率增加[10]。一種新型的生物治療方法溶瘤病毒現(xiàn)已進(jìn)入臨床研究[11-12]。已有研究表明VSV 可逆轉(zhuǎn)卵巢癌VEGF-D 的過表達(dá)，抑制MMP-2 表達(dá)來抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移[7]，還可治療小鼠肝結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[6]。rVSV-NDV/F（L289A）能夠治療多病灶的肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移CRC 的老鼠模型[13]，但VSV 對結(jié)直腸癌遷移和侵襲影響的作用機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。本研究對不同濃度VSV 的抗腫瘤作用進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明VSV 具有抑制結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。

基質(zhì)金屬蛋白是鋅依賴的內(nèi)肽酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞癌細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障[14]。在目前發(fā)現(xiàn)的所有MMP 蛋白中，MMP-2和MMP-9 被認(rèn)為是參與腫瘤遷移和侵襲的最重要成員[15]。MMP-2 和MMP-9 的高表達(dá)在結(jié)直腸癌中較為常見[16]，預(yù)示著結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良[17]。PI3K/Akt 信 號 通 路 是MMP-2 和MMP-9的重要上游調(diào)控因子[18]。激活PI3K/Akt 通過上調(diào)MMP-2 或MMP-9 表達(dá)促進(jìn)CRC 侵襲轉(zhuǎn)移[19]。研究證明NDV D90 通過抑制MMP-2 和MMP-9的表達(dá)和活性，顯著抑制了口腔鱗狀癌細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。但研究VSV 作用結(jié)直腸癌細(xì)胞后MMP-2 和MMP-9 表達(dá)的報(bào)道較少。為評估VSV對結(jié)直腸癌細(xì)胞的抑制作用與MMP-2、MMP-9 的關(guān)系，本研究采用qPCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測VSV對SW480 細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示VSV 上調(diào)SW480 細(xì)胞中MMP-2 的表達(dá)和下調(diào)MMP-9 的表達(dá)。已有研究報(bào)道VSV 的基質(zhì)蛋白可逆轉(zhuǎn)VEGF-D 增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成，抑制腫瘤生長，進(jìn)而抑制MMP-2 的表達(dá)[7]。溶瘤病毒（VSV-M51R）結(jié)合MMP-3 抑制劑可治療小鼠結(jié)腸癌[21]。本研究SW480 細(xì)胞中MMP-2 的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道的VSV 在卵巢癌細(xì)胞中結(jié)果相反[7]，因此，VSV 可能通過上調(diào)MMP-2 和下調(diào)MMP-9 的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上，VSV 能夠抑制結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞的遷移和侵襲，其內(nèi)部分子機(jī)制可能是VSV 通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白的表達(dá)和活性來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，猜想可能是通過PI3K/Akt 通路來下調(diào)MMP-9 的表達(dá)的，之后再進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來研究其具體機(jī)制。VSV 可能是一種有前途的策略，為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療提供了一個(gè)新的思路。