周嵐，于鴻浩

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541199）

0 引言

惡性腫瘤是一種高死亡率疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著類(lèi)的生存[1]。盡管在惡性腫瘤治療領(lǐng)域取得了一系列令人振奮的成就包括手術(shù)治療、靶向生物治療、放療、化療、和新的聯(lián)合治療等，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率、藥物毒副作用、放/化療耐藥性仍嚴(yán)重影響著患者生存時(shí)間和生活質(zhì)量[2]。研究表明，所有惡性腫瘤都存在多種基因突變，主要涉及致癌基因的激活和抑癌基因的失活，從而改變了整個(gè)基因組的表觀遺傳學(xué)[3]。目前通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與癌癥發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的基因[4-5]。在此研究基礎(chǔ)上，基因編輯技術(shù)通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和糾正基因突變，為癌癥治療帶來(lái)了巨大的希望，導(dǎo)致精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步突破[6]。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡(jiǎn)介

2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予 Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna兩位博士，以表彰她們開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，該技術(shù)為精確的基因編輯提供了新的有力工具。第三代基因組編輯技術(shù)即CRISPR/Cas9技術(shù)，它是由細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的抵抗病毒入侵、清除病毒基因組的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成[7-8]。它包含Cas9蛋白，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）三個(gè)核心原件，為了使CRISPR/Cas9技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中更為簡(jiǎn)便，Jinek等科學(xué)家將crRNA與tracrRNA融合在一起改造為依然具有引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶點(diǎn)DNA序列功能的單鏈向?qū)NA（sgRNA）[9]。sgRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶序列相結(jié)合指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶切割目標(biāo)DNA序列，造成雙鍵斷裂（DSBs）[10]。切割位點(diǎn)在“NGG”前間隔相鄰基序（PAM）上游序列的第3個(gè)堿基對(duì)上，DNA雙鍵斷裂后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，即非同源重組末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）[11]。HDR修復(fù)需要同源模板鏈，可精確介導(dǎo)基因的修復(fù)和置換，NHEJ 修復(fù)途徑則隨機(jī)產(chǎn)生堿基插入或缺失突變[12]。與鋅指蛋白核酸酶（ZFN）或轉(zhuǎn)錄因子激活樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）等應(yīng)用較早的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)靈活、高效、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[13]，目前CRISPR/Cas9技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等操作，廣泛應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤治療中取得的研究成果進(jìn)行綜述，為腫瘤發(fā)病機(jī)制和臨床治療的相關(guān)研究提供參考。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腫瘤治療研究中的應(yīng)用

2.1 建立腫瘤研究模型

小鼠是惡性腫瘤研究中常用的動(dòng)物模型，傳統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞打靶技術(shù)雖然適合在內(nèi)源基因中產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳修飾，但其操作繁瑣且耗時(shí)[14]?？焖俣_的CRISPR/Cas9技術(shù)使研究人員能夠通過(guò)特定的基因修飾創(chuàng)建癌癥的小鼠模型，從而能夠更客觀地研究癌癥的發(fā)生機(jī)制。目前直接將 Cas9 mRNA和sgRNA通過(guò)顯微注射的方式注入小鼠受精卵中，在特定序列上產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂從而形成定向突變的方法大大加速了轉(zhuǎn)基因小鼠模型的生產(chǎn)[15]。比如通過(guò)流體動(dòng)力尾靜脈注射共表達(dá)Cas9蛋白和靶向抑癌基因Pten的sgRNA的pX330載體質(zhì)粒到成年小鼠的肝細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，獲得小鼠遲發(fā)型肝癌模型，并驗(yàn)證小鼠肝臟Pten基因被特異性敲除[16]。利用AAV病毒將針對(duì)Kras、p53和LKB1基因的sgRNA導(dǎo)入化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）小鼠的肺部，成功地建立了小鼠肺癌模型[17]。

患者來(lái)源的異種移植（PDX）動(dòng)物模型可以使人類(lèi)腫瘤外源性生長(zhǎng)，為腫瘤學(xué)研究提供不可或缺的臨床前工具[18]。小鼠是人類(lèi)PDX模型最廣泛使用的宿主；然而小鼠體積過(guò)小限制了異種移植腫瘤的生長(zhǎng)，這對(duì)樣本收集和藥物評(píng)價(jià)造成了影響。因此，研究人員使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了Spraogue Dawley（SD）大鼠的Rag1、Rag2和Il2rg基因，該SD-RG大鼠存在嚴(yán)重的免疫缺陷，免疫系統(tǒng)中缺乏成熟的T、B和NK細(xì)胞。利用該大鼠模型研究人員地建立了一種肺鱗狀細(xì)胞癌的PDX模型，且移植腫瘤包含了原發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)特征[19]。綜上所述，與小鼠相比，嚴(yán)重免疫缺陷的SD-RG大鼠支持PDX的快速生長(zhǎng)，因此具有作為腫瘤研究的新模型的巨大潛力。

2.2 靶向敲除致癌基因

細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制紊亂是腫瘤發(fā)生的主要原因。在致癌因素的影響下，原癌基因突變導(dǎo)致異常活化細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路被激活，幼稚細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞成熟和凋亡受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20]。體外研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)可以通過(guò)靶向敲除癌基因有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。CRISPR-Cas9敲除CD133基因可減弱黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力、降低基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9的表達(dá)水平[21]。用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-3064顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和致瘤能力[22]。此外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除癌基因EGFR的等位基因，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞系H1975、A549和H1650的生長(zhǎng)和增殖受到抑制，H1975或A549肺癌細(xì)胞的種瘤小鼠的腫瘤體積有所減小[23]。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除KRAS突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC）中的FAK基因?qū)е翹SCLC細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性增加[24]。這些研究表明CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可通過(guò)靶向敲除致癌基因，干擾相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

2.3 靶向修復(fù)抑癌基因

抑癌基因的沉默、缺失或突變會(huì)激活癌基因，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[25]。CRISPR/Cas9技術(shù)可以在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中快速驗(yàn)證抑癌基因，此外大量研究為通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)糾正抑癌基因突變和治療腫瘤提供了基礎(chǔ)。惡性胸膜間皮瘤（MPM）中發(fā)現(xiàn)了抑癌基因神經(jīng)纖維素2（NF2）的突變，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，NF2基因敲除的人間皮細(xì)胞系MET-5A顯示出更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[26]。且通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在肺癌線粒體融合蛋白2（MFN2）基因敲除細(xì)胞上觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象[27]。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)使小鼠腦內(nèi)多種腫瘤抑制基因（包括p53、Nf1、Pten和Ptch1）缺失，導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生[28]。這些研究表明，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)能夠快速識(shí)別抑癌基因。

此外CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)修復(fù)失活的抑癌基因在癌癥治療發(fā)揮作用。Moses等科學(xué)家使用CRISPR/dCas9聯(lián)合反式激活劑VP64p65-RTA（VPR）激活癌細(xì)胞中低表達(dá)的PTEN基因。結(jié)果表明，通過(guò)dCas9-VPR系統(tǒng)，PTEN在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，并且PTEN的激活明顯抑制了下游的致癌途徑[29]。Artegiani等人研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)使得正常人類(lèi)膽管細(xì)胞中的BAP1基因喪失功能后，細(xì)胞變得異?；钴S，并與其他器質(zhì)融合，這一特征類(lèi)似于腫瘤的轉(zhuǎn)移性侵襲。有趣的是，他們恢復(fù)了BRCA1關(guān)聯(lián)蛋白1（BAP1）在細(xì)胞核中的催化活性后，細(xì)胞恢復(fù)正常表型[30]。目前已使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究腫瘤抑制基因的癌癥包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌和宮頸癌、肝細(xì)胞癌等[31]。這些研究充分表明，使用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因修復(fù)或誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的過(guò)度表達(dá)顯示出癌癥治療的新潛力。

2.4 腫瘤的免疫治療

腫瘤免疫療法不是直接攻擊腫瘤細(xì)胞，而是通過(guò)各種策略使機(jī)體發(fā)生適應(yīng)性或先天性免疫應(yīng)答來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞。程序性細(xì)胞死亡分子1（PD-1）是一種存在于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的膜蛋白，表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1和PD-L2配體與PD1結(jié)合后可抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的清除，阻斷PD-1及其配體互作可恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答[32]。因此，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除包括PD-1基因和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）等，對(duì)于提高腫瘤免疫治療的療效至關(guān)重要。目前已有臨床實(shí)驗(yàn)將CRISPR介導(dǎo)的PD-1基因敲除用于對(duì)前列腺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的治療，旨在進(jìn)一步評(píng)估PD-1基因敲除在T細(xì)胞中的有效性和安全性[33]。

嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞治療開(kāi)啟了腫瘤治療的新紀(jì)元，尤其是FDA 批準(zhǔn)了Kymriah和Yescarta（B細(xì)胞白血病和淋巴瘤中CD19基因修飾的自體T細(xì)胞）為CAR-T細(xì)胞，分別用于急性淋巴細(xì)胞白血病和某些類(lèi)型的非霍奇金淋巴瘤患者[34,35]。盡管廣泛使用的自體CAR-T細(xì)胞在癌癥治療中具備良好療效，但仍存在一定局限性，與CRISPR/Cas9技術(shù)的結(jié)合將優(yōu)化CAR-T細(xì)胞療法。同種異體通用CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于異體移植需要克服兩個(gè)障礙即移植物抗宿主?。℅VHD）和改善生物安全性以獲得更強(qiáng)大的腫瘤靶向作用。為了解決這些障礙，研究人員使同種異體通用T細(xì)胞中的內(nèi)源性α、βT細(xì)胞受體（TCRs）和人類(lèi)固有白細(xì)胞抗原（HLA）分子沉默或破壞。在幾項(xiàng)研究中，CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的TCRβ鏈和β-2微球蛋白（B2M）的多重敲除已被用于生產(chǎn)通用CAR-T細(xì)胞，結(jié)果表明，這些通用細(xì)胞在體外和體內(nèi)都保持了功能，不會(huì)引起移植物抗宿主病[36-37]。在一項(xiàng)使用CRISPR/Cas9干擾粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的研究中，構(gòu)建了GM-CSF缺陷的CART19細(xì)胞，其細(xì)胞抗腫瘤活性增強(qiáng)，總存活率提高。此外，在使用抗GM-CSF人源化IgG1 Kappa輕鏈抗體lenzilumab中和GM-CSF后，白血病得到持久控制，患者來(lái)源的異種移植物中的細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)炎癥減少，研究者計(jì)劃使用Lenzilumab和CART19細(xì)胞療法的組合進(jìn)行二期臨床研究[38]。這些研究證實(shí)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用可行性。

2.5 修復(fù)表觀遺傳調(diào)控基因

在腫瘤細(xì)胞中表觀遺傳調(diào)控基因經(jīng)常發(fā)生突變，導(dǎo)致基因表達(dá)紊亂[39]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白修飾酶在惡性腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生突變，因此在基因水平上對(duì)表觀遺傳調(diào)控基因的編輯對(duì)糾正腫瘤表觀遺傳障礙尤為重要[40,41]。CRISPR/Cas9技術(shù)用于靶向特異性乙?；D(zhuǎn)移酶p300激活中心，催化組蛋白H3賴(lài)氨酸的乙?；?，激活基因啟動(dòng)子和近端、遠(yuǎn)端增強(qiáng)子。即CRISPR/Cas系統(tǒng)通過(guò)靶向乙酰化轉(zhuǎn)移酶活性的相關(guān)基因使其特異性激活從而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[42]。因此，靶向編輯基因乙?；笧檎{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄提供了有力的途徑，靶向修復(fù)表觀調(diào)控酶編碼基因是腫瘤治療的有力手段。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，如要充分實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，需要面臨許多挑戰(zhàn)，如編輯效率[43]、脫靶效應(yīng)[44]，及如何高效的將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成分導(dǎo)入目標(biāo)組織等[45]，這對(duì)腫瘤治療尤為重要，科研工作者正致力于對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性及遞送方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，但是目前大部分研究還處于初級(jí)階段，更深入的技術(shù)還有待開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在分子水平上仍存在許多與腫瘤治療相關(guān)的問(wèn)題尚未解決，這項(xiàng)技術(shù)必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的臨床測(cè)試，包括有效性、安全性和特異性測(cè)試，確認(rèn)其安全有效，然后才能投入臨床應(yīng)用。但不可否認(rèn)的是，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因?qū)用嫔蠈?duì)腫瘤治療具有極大的潛力，為腫瘤的治療帶來(lái)了希望，基于CRISPR/Cas9的個(gè)性化和靶向治療可能是腫瘤治療的發(fā)展趨勢(shì)。