毛美琴，藍(lán)楨宇，李 進(jìn)，郭錫燚，黃鳳萍，廖元龍，蔡小輝

（北部灣大學(xué)海洋學(xué)院/廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 536011）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)起始于20 世紀(jì)初，最初以未離散的組織小塊進(jìn)行培養(yǎng)，組織小塊呈放射狀遷移出細(xì)胞［1］。迄今為止，細(xì)胞培養(yǎng)已有100 多年的悠久歷史。1640 年荷蘭眼鏡商詹森首次制成了世界上第一臺(tái)放大倍數(shù)約10～30 倍的復(fù)式顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)的研究工作逐步展開(kāi)［2］。英國(guó)物理學(xué)家Hooke 利用顯微鏡觀察軟木片，由此人類(lèi)發(fā)現(xiàn)了世界上第一個(gè)植物細(xì)胞。隨后美國(guó)生物學(xué)家Harrison 利用淋巴液作為培養(yǎng)基，從蝌蚪脊索中成功分離出神經(jīng)組織，觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程，證明細(xì)胞在離體條件下可以存活，細(xì)胞培養(yǎng)在世界上逐漸揭開(kāi)序幕［3］。該技術(shù)激起了廣泛醫(yī)學(xué)科學(xué)研究人員的興趣，細(xì)胞體外培養(yǎng)具有形態(tài)一致、遺傳背景相似和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象?；诟鞣N動(dòng)物組織易獲性的優(yōu)點(diǎn)，更多組織被選用為研究對(duì)象，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雞胚組織的原代細(xì)胞可提供各種類(lèi)型的細(xì)胞，后來(lái)多采用哺乳動(dòng)物作為研究對(duì)象，尤其嚙齒動(dòng)物組織具有可形成連續(xù)細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)［4-5］。

起初，為避免正常體內(nèi)自體調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)可能產(chǎn)生的整體因素影響，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)相關(guān)研究（如抗病毒疫苗、腫瘤發(fā)生機(jī)制）。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系可作為研究病毒的發(fā)生器、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［6-7］。在低等脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出的特性（如再生功能、變態(tài)發(fā)育等），加之近年農(nóng)業(yè)病害防控需要，特殊種類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)吸引了許多研究人員的關(guān)注。已有大量研究證明，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、免疫學(xué)以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿Γ?］。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益逐年遞增，淡水和海水病害防控、環(huán)境等問(wèn)題使得魚(yú)類(lèi)健康發(fā)育和病理發(fā)生等研究受到了更多關(guān)注。近年來(lái)各類(lèi)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系不斷被建立，如金魚(yú)（Carassius auratus）、斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio var）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）和鮭魚(yú)（Oncorhynchus keta）等。新細(xì)胞系的建立對(duì)于基因組學(xué)研究、病毒與宿主互作以及細(xì)菌的鑒定和重金屬的毒性分析、干細(xì)胞功能研究等具有促進(jìn)作用。本綜述將圍繞魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)歷史、應(yīng)用和培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行介紹。

1 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)歷史

1962 年，Wolf 等［9］建立了第一個(gè)真骨魚(yú)類(lèi)永久細(xì)胞系虹鱒性腺細(xì)胞系（RTG-2）。1962—1980 年是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系建立的起步階段，Cravell等［10］建立了鳙魚(yú)（Hypophthalmichthys nobilis）肌肉細(xì)胞系（FHM）。20 世紀(jì)中期用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織也越來(lái)越豐富，將肝、脾、性腺、鰭條、皮膚等組織到魚(yú)體幾乎所有組織，以及魚(yú)類(lèi)細(xì)胞成功應(yīng)用到免疫系統(tǒng)、疫苗等研究領(lǐng)域。例如，Matsumoto 等［11］從金魚(yú)紅細(xì)胞腫瘤中建立了永生性細(xì)胞系（GEM-81），并利用該細(xì)胞系進(jìn)行注射免疫等研究；Noga 等［12］分別建立了胡子鯰(Clarias batrachus) 的腎臟細(xì)胞系（K1K）、鰓細(xì)胞系（G1B）、性腺細(xì)胞系（GD Ⅱ），并在K1K中進(jìn)行了鯰魚(yú)病毒（CCV）的滅活疫苗研究；Collodi 等［13］建立斑馬魚(yú)的胚胎細(xì)胞系，是體外分離與培養(yǎng)模式魚(yú)類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究的開(kāi)始。

我國(guó)研究魚(yú)類(lèi)細(xì)胞起始于20 世紀(jì)70 年代，張念慈等［14］為研究病毒性魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)首次建立了草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)吻端細(xì)胞系ZC-7901 及亞株ZC-7901S1。近年來(lái)，由于魚(yú)類(lèi)人工養(yǎng)殖特別是高密度集約化養(yǎng)殖條件與天然環(huán)境差別很大，導(dǎo)致病害大規(guī)模暴發(fā)，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸受到重視。應(yīng)用于病毒學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)等的細(xì)胞系不斷被建立，如鯽魚(yú)（Carassius auratus auratus）的囊胚細(xì)胞系（CAB-80）、草魚(yú)的腎臟細(xì)胞系（CIK）、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的尾鰭細(xì)胞系（TQ-8801）等［15-18］。特定的組織被用來(lái)研究病原體的特定功能和病理生理學(xué)，例如，魚(yú)類(lèi)肝臟細(xì)胞主要用于毒理學(xué)研究，頭腎和脾臟細(xì)胞用于免疫研究，而鰓細(xì)胞則用于致病性研究［19］。其中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于頭腎，用于研究病原體魚(yú)體宿主之間的關(guān)聯(lián)和清除能力［20-21］。另外，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系對(duì)于研究不同污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)遺傳毒性、魚(yú)類(lèi)生理學(xué)和遺傳學(xué)等具有重要作用。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，1994 年全世界共建立了159 個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，其中包含了125 株淡水魚(yú)類(lèi)和溯河洄游性鮭科魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞系，分別來(lái)源于21 科52 種魚(yú)類(lèi)的不同組織；34 株海水魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，分別來(lái)源于13 科22 種魚(yú)類(lèi)的不同組織［22］。截至2021 年，全世界共建立了1 128 株魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系［23］。

2 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的應(yīng)用

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞作為體外研究的重要工具，具有培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度適應(yīng)范圍較大、培養(yǎng)基選擇范圍較廣、易于分離培養(yǎng)等特點(diǎn)，因此受到水產(chǎn)動(dòng)物研究人員的關(guān)注。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)早前多應(yīng)用于鑒定新出現(xiàn)的病毒性研究，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)、免疫學(xué)、魚(yú)類(lèi)生理學(xué)和種質(zhì)資源保存等方面研究［24］。

2.1 魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)

在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，許多重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物易受傳染性病毒影響，常見(jiàn)病毒如石斑魚(yú)（Epinephelusspp）虹彩病毒（SGIV）、赤點(diǎn)石斑魚(yú)（Epinephelus akaara）神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）、鮭魚(yú)呼腸孤病毒（CSV）、錦鯉（Cyprinus carpio）皰疹病毒（KHV）、鰻鱺（Anguilla japonica）皰疹病毒（HVA）、羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）湖病毒（TiLV）和傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）等。病毒性疾病的暴發(fā)易引起水產(chǎn)動(dòng)物大規(guī)模死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，極大阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，解決了魚(yú)類(lèi)病毒分離鑒定的技術(shù)難題，并且利用細(xì)胞培養(yǎng)能夠使病毒在體外持續(xù)生長(zhǎng)分裂，培養(yǎng)條件易于控制，不受其他病毒的隱性干擾。如今細(xì)胞系已成功應(yīng)用于從病變組織中分離病原體，研究機(jī)制包括病毒在機(jī)體內(nèi)的感染、復(fù)制和釋放等［25］。例如，利用卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）腦細(xì)胞系TOGB 來(lái)測(cè)定病毒易感性，TOGB 在第45 代時(shí)轉(zhuǎn)染效率為64.8%，試驗(yàn)表明該細(xì)胞適合外源基因的表達(dá)［26］。對(duì)魚(yú)類(lèi)不同組織樣本進(jìn)行病毒敏感度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰭是病毒的主要發(fā)生位點(diǎn)，可作為檢測(cè)病毒的有利工具。Jun等［27-28］利用鯉魚(yú)鰭細(xì)胞系感染彈狀病毒（SVCV），研究其在彈狀病毒感染中免疫基因表達(dá)和抗病毒機(jī)制。魚(yú)類(lèi)疾病預(yù)防和疾病診斷在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位，通過(guò)建立魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系可從源頭了解病毒侵染途徑，有利于篩選抗病毒的疫苗開(kāi)發(fā)［29］。

2.2 環(huán)境毒理學(xué)

工農(nóng)業(yè)興起的同時(shí)大量污染物和有害重金屬進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)（如銅、汞、鎘、鉛和其他化學(xué)污染物），嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，水環(huán)境中聚積的有害物質(zhì)具有不可降解性和較長(zhǎng)的生物半衰期，魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期生活在該環(huán)境中直接給人類(lèi)帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)［30-31］。過(guò)去的毒理實(shí)驗(yàn)大多在活魚(yú)體內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要大量養(yǎng)殖設(shè)備，中途需要不斷充氣和換水，消耗巨大的人力和物力，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。另外，活體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在不可控因素，如試驗(yàn)活魚(yú)代謝、應(yīng)激反應(yīng)等難以控制導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差。過(guò)往的研究表明，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞具有高度敏感性和重現(xiàn)性，可用于廢水評(píng)估，尤其是水環(huán)境的整體毒性、毒性評(píng)估鑒定和基于有毒物質(zhì)對(duì)于水生動(dòng)物的相互作用研究［32-33］。

金屬、化學(xué)物質(zhì)及其衍生物廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，不同程度地暴露于人類(lèi)和動(dòng)物中，將斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞和人單核細(xì)胞系（THP-1）分別暴露于金屬納米顆粒，研究結(jié)果表明，金屬納米顆粒對(duì)斑馬魚(yú)和人類(lèi)的細(xì)胞形態(tài)和生理有顯著影響；采用不同濃度的1,2,4-三氯苯對(duì)體外培養(yǎng)的斑馬魚(yú)肝細(xì)胞進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，水中殘留的1,2,4-三氯苯可導(dǎo)致斑馬魚(yú)肝細(xì)胞DNA損傷作用。相關(guān)研究結(jié)果證明這些金屬納米顆粒、化學(xué)污染物對(duì)于人類(lèi)和環(huán)境可能造成毒理學(xué)的影響［34-37］。因此，建立魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系研究水生環(huán)境中農(nóng)藥、抗生素和重金屬等環(huán)境污染物具有重要意義［38-39］。近年微塑料生態(tài)毒性也激起了相關(guān)研究人員的興趣，可將魚(yú)類(lèi)細(xì)胞作為模型，評(píng)估微塑料對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的毒性［40］。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞作為檢測(cè)環(huán)境污染物的重要生物工具，有望發(fā)展為常見(jiàn)有毒污染物的生物指示物。

2.3 魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)

魚(yú)類(lèi)在水環(huán)境中與病原密切接觸，是研究動(dòng)物免疫模型重要的角色之一，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的建立為天然免疫基因功能分析提供了可行工具。在魚(yú)類(lèi)中參與免疫防御的器官主要有頭腎、鰓、脾、胸腺和皮膚，其中頭腎組織類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的造血器官，由免疫細(xì)胞組成，可用于硬骨魚(yú)免疫的發(fā)育和功能［41］。魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)中包含有許多細(xì)胞因子，主要行使非特異性和特異性免疫防御，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。利用細(xì)胞因子可作為標(biāo)記物用于檢測(cè)魚(yú)類(lèi)的先天性免疫反應(yīng)［42］。穩(wěn)定的細(xì)胞系建立有助于低等脊椎動(dòng)物免疫功能的研究，當(dāng)虹鱒單核細(xì)胞系（RTS11）受到外界刺激后促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNFα 和IL-6）和抗炎細(xì)胞因子（IL-10）等的表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)，產(chǎn)生的細(xì)胞因子可用于疾病治療［43］。斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞系（ZBE3）具有高轉(zhuǎn)染效率，可作為魚(yú)類(lèi)免疫反應(yīng)有用的研究工具［44］。而通過(guò)研究冷水魚(yú)類(lèi)細(xì)胞在不同溫度下的免疫調(diào)節(jié)，得出冷水魚(yú)依賴(lài)先天性免疫以抵抗感染［45］。因此，魚(yú)類(lèi)新細(xì)胞系的建立有助于研究免疫調(diào)節(jié)基因，是疾病預(yù)防控制及疫苗開(kāi)發(fā)的重要免疫模型。

2.4 干細(xì)胞研究

長(zhǎng)期以來(lái)，以貿(mào)易為目的過(guò)度開(kāi)發(fā)動(dòng)物、引進(jìn)非本土生物、生態(tài)污染、氣候變化和跨界疾病，使得水生生物多樣性受到嚴(yán)重威脅。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的建立對(duì)魚(yú)類(lèi)種質(zhì)和基因資源具有有效保護(hù)［46］。其中胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell,ESC）是克隆性增殖、自我更新、功能上原始的細(xì)胞，具有分化為幾種或所有器官功能細(xì)胞類(lèi)型的潛能，是發(fā)育生物學(xué)中強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)工具［47］。在胚胎和胎兒時(shí)期干細(xì)胞的目的是促進(jìn)機(jī)體的初始發(fā)育和生長(zhǎng)，而在成體中承擔(dān)著機(jī)體所有組織的自然修復(fù)作用。目前，已在各類(lèi)低等脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)其擁有這些能力，包括魚(yú)類(lèi)。

斑馬魚(yú)因固有的透明度和具有高度遺傳保守性，現(xiàn)已成為研究造血發(fā)育的一個(gè)熱門(mén)模型動(dòng)物，近年建立了穩(wěn)定斑馬魚(yú)干細(xì)胞系，包括斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞系（Z428）、斑馬魚(yú)胚胎機(jī)制干細(xì)胞系（ZEST）、斑馬魚(yú)胚胎祖細(xì)胞系（HSPC）［48-49］。另外，尼羅羅非魚(yú)胚胎干細(xì)胞（TES1）在體外和體內(nèi)都具有多功能性和分化潛能，為后續(xù)再生功能性的生物醫(yī)學(xué)研究工作奠定了基礎(chǔ)［50］。

3 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

3.1 培養(yǎng)方法

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化促使許多適用于生物化學(xué)和分子分析的細(xì)胞系被建立。相較于哺乳動(dòng)物，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞代謝率較低，更容易在體外條件下生存。目前，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要以哺乳動(dòng)物為參考，一般分為原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)。其中原代細(xì)胞培養(yǎng)是指在無(wú)菌、麻醉?xiàng)l件下從魚(yú)體取出組織分離出單個(gè)細(xì)胞，人工模擬機(jī)體內(nèi)環(huán)境，使其在體外生長(zhǎng)發(fā)育，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，長(zhǎng)到一定密度后即可進(jìn)行傳代操作，傳代后的細(xì)胞就是細(xì)胞系［2］。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞離體時(shí)間短，生物學(xué)特性尚未發(fā)生明顯改變，為二倍體核型，能夠更加真實(shí)反映出體內(nèi)的生長(zhǎng)特性，適合應(yīng)用于毒性測(cè)試、免疫學(xué)等研究實(shí)驗(yàn)［51］。常用于分離單個(gè)細(xì)胞的方法有組織貼壁法、酶消化法和機(jī)械消化法，產(chǎn)生的原代細(xì)胞用于后續(xù)傳代培養(yǎng)。

3.1.1 組織塊貼壁法 組織塊貼壁法最早應(yīng)用于Harrison 蝌蚪脊索神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，組織細(xì)胞浸沒(méi)于淋巴液中獲得營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育。該法適用于組織量較少或生長(zhǎng)較致密的組織，如鰭條、皮膚、肌肉和性腺等組織，因?yàn)闄C(jī)械或酶解作用可能造成細(xì)胞損傷。而組織塊貼壁法的不足之處在于部分組織缺乏粘附性，向外遷移生長(zhǎng)具有選擇性。盡管如此，組織塊貼壁法仍是常見(jiàn)且簡(jiǎn)單可行的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法之一。組織塊貼壁法是在無(wú)菌條件下分離出目的組織，用緩沖液清洗被膜、脂肪以及血液等雜質(zhì)，用無(wú)菌解剖工具將組織塊分離成1 mm3大小，接種在細(xì)胞瓶底部。加入培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，直至細(xì)胞從組織塊周?chē)w出。組織塊貼壁法需要較長(zhǎng)時(shí)間才能使組織貼壁，掌握好貼壁時(shí)間尤為重要，可避免組織細(xì)胞缺少營(yíng)養(yǎng)而死亡。

以往研究表明，組織塊貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞具有細(xì)胞形態(tài)完整、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Githa 等［52］對(duì)淡黑雀鯛（Pomacentrus caeruleus）的各部位組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)條件探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用組織塊貼壁法對(duì)不同組織原代細(xì)胞培養(yǎng)，只有鰓、胸鰭和尾鰭組織細(xì)胞獲得良好的融合細(xì)胞單層。利用組織塊培養(yǎng)大進(jìn)行團(tuán)頭魴骨組織細(xì)胞系（MBCs）的建立，可大量培養(yǎng)出以輻射狀的形式生長(zhǎng)穩(wěn)定的貼壁細(xì)胞［53］。

3.1.2 酶消化法 利用酶消化法可以避免細(xì)胞因遷移率而選擇性生長(zhǎng)的問(wèn)題，在短時(shí)間內(nèi)能夠快速獲得大量具有代表性的細(xì)胞，適用于培養(yǎng)大量組織。酶消化法是指將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維）去除，細(xì)胞分散成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞更易汲取外界養(yǎng)分并排除代謝廢物。用于體外分離細(xì)胞的蛋白消化酶主要有胰蛋白酶（trypsin）、膠原酶（collagenase）、溶菌酶（lysozyme）、胃蛋白酶（pepsin）、中性蛋白酶（Sarre peptidase）等，細(xì)胞消化過(guò)程中胰蛋白酶和膠原酶較為常見(jiàn)。例如，大口黑鱸（Micropterus salmoides）性腺細(xì)胞系（LMBG）建立時(shí)將組織懸浮在0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，所分離出的單細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)佳并傳代超過(guò)118 代［54］；利用同樣的方法，Gao等［55］建立了大菱鲆（Scophthalmusmaximus）肌肉連續(xù)成纖維樣細(xì)胞系（TMF），后續(xù)的傳代培養(yǎng)成功培養(yǎng)超過(guò)60 多代。另有研究運(yùn)用不完全消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，即采用組織塊貼壁法和酶消化法結(jié)合，既可提高細(xì)胞產(chǎn)率又可保持細(xì)胞間的相互聯(lián)系［56-57］。

3.1.3 機(jī)械破碎法 采用組織貼壁法培養(yǎng)原代細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞遷出速度較慢，僅適用于少量組織，而利用酶消化法對(duì)細(xì)胞消化過(guò)程中存在損害細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，因此機(jī)械破碎法也受到了許多研究人員的青睞。機(jī)械破碎法適用于電解質(zhì)較軟、內(nèi)含纖維性成分較少且對(duì)機(jī)械分離具有耐受性的組織，如胚胎、脾、肝、成年魚(yú)體的腦或軟質(zhì)腫瘤等。通常機(jī)械破碎法是指通過(guò)各種物理手段將組織塊破碎分離成單個(gè)細(xì)胞，常利用尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)研磨過(guò)濾或反復(fù)吹打組織，離心重懸得到單細(xì)胞懸液，這種方法可較快地獲取大量細(xì)胞，但是易產(chǎn)生機(jī)械損傷。如草魚(yú)腸道上皮細(xì)胞（IECs）的培養(yǎng)采用不同的消化方法，經(jīng)對(duì)比檢驗(yàn)可知，采用機(jī)械破碎法進(jìn)行消化分離出的細(xì)胞效果較好，但是該方法在分離單細(xì)胞的同時(shí)易產(chǎn)生機(jī)械損傷［58］。

以上培養(yǎng)方法中，細(xì)胞需要依賴(lài)于錨定的固體基質(zhì)來(lái)附著、擴(kuò)散和生長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)需要提供營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基和所需的生長(zhǎng)因子作為細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)條件

3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)基 早期細(xì)胞培養(yǎng)多采用天然培養(yǎng)液，一般為組織提取物和體液，常見(jiàn)的有淋巴液、血漿、血清。隨著隨著細(xì)胞培養(yǎng)的深入研究，細(xì)胞培養(yǎng)液的化學(xué)成分逐漸明確。Eagle 等成功研制的合成培養(yǎng)基進(jìn)一步推動(dòng)了細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)程。Eagle’s 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，僅含有必需氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽［59-62］。后來(lái)根據(jù)不同細(xì)胞的特性設(shè)計(jì)了成分更加多樣化的培養(yǎng)基，如DMEM 培養(yǎng)基是為了小鼠成纖維細(xì)胞而設(shè)計(jì)。迄今為止用于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的特殊培養(yǎng)基種類(lèi)有限，主要參考已建立細(xì)胞系的培養(yǎng)程序進(jìn)行。根據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，DMEM、M199、F12、L15 以及DMEM/F12 近年來(lái)被廣泛應(yīng)用［63-65］。

3.2.2 血清 除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，血清是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的補(bǔ)充劑之一，含有多種生物活性物質(zhì)［66］。常用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清主要有胎牛血清、小牛血清、成年馬血清及本體血清（如魚(yú)血清），其中胎牛血清和小牛血清應(yīng)用最為廣泛，尤其是胎牛血清的培養(yǎng)效果最佳。胎牛血清為懷孕5～8 個(gè)月的母牛胎盤(pán)中未發(fā)育完全的胎牛血清。胎牛血清未曾接觸過(guò)外界，含有抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害成分少，并含有特殊的生長(zhǎng)因子，有利于細(xì)胞的貼壁和鋪展，同時(shí)提供載體蛋白以中和毒性物質(zhì)減少細(xì)胞損傷，提供蛋白抑制劑以保護(hù)細(xì)胞免受凋亡細(xì)胞釋放的蛋白酶損害。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中也可添加一定量的本體血清作為促生長(zhǎng)劑，如尼羅羅非魚(yú)胚胎干細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中添加羅非魚(yú)血清，研究發(fā)現(xiàn)本體血清具有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分裂的作用［67］。

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞不同，培養(yǎng)基中含有的血清量有所差異，原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分需求量較大。如Liu 等［59］在石斑魚(yú)腦細(xì)胞原代培養(yǎng)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)液中含有15%和20%FBS 培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著高于FBS 含量為5%和10%的培養(yǎng)液，而15%和20% FBS 培養(yǎng)液間無(wú)顯著差異。眼斑雙鋸魚(yú)（Amphiprion ocellaris）尾鰭細(xì)胞系（OCF）在5%、10% FBS 條件下生長(zhǎng)狀態(tài)較差，而在15% FBS 條件下生長(zhǎng)相對(duì)較好，而20% FBS 條件下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，隨著傳代次數(shù)的增加至34 次時(shí)可將FBS 濃度逐漸降至15%［68］。另有研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）性腺細(xì)胞采用20% FBS 進(jìn)行培養(yǎng)效果較好［69］。

3.2.3 生長(zhǎng)因子和抗生素 細(xì)胞培養(yǎng)液除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清外，還可添加少量生長(zhǎng)因子以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。常用的生長(zhǎng)因子主要有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）和成纖維生長(zhǎng)因子（FGFs）。EGF 是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子，對(duì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞核癌前病變細(xì)胞等具有促進(jìn)作用［70］。而FGFs 則可協(xié)同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有較強(qiáng)的促有絲分裂活性作用，促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)和神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)［71-72］。例如，堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）被用于刺激斑馬魚(yú)和牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎細(xì)胞的增殖［73-74］；藍(lán)鰭金槍魚(yú)（Thunnus thynnus）細(xì)胞系（SBR-E1）在傳代培養(yǎng)1～12 代的培養(yǎng)液中加入bFGF，一定程度上可抑制細(xì)胞分化［75］；在金魚(yú)和銀鯽（Caras sius auratus gibelio）腦細(xì)胞系建立過(guò)程中被證明EGF和bFGF 可用作腦細(xì)胞前10 代增殖的有效促有絲分裂因子［18］。另外，濃度不同的生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不同，低濃度時(shí)隨生長(zhǎng)因子濃度增加而增加，達(dá)到峰值后濃度上升甚至?xí)l(fā)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

細(xì)胞對(duì)微生物的防御能力較弱，培養(yǎng)基中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為微生物提供了游離的生長(zhǎng)環(huán)境，快速增殖的微生物分泌的毒素易導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，在細(xì)胞培養(yǎng)初期為防止微生物污染，通常會(huì)向培養(yǎng)液中添加適量抗生素。常用于組織培養(yǎng)的抗生素有青霉素、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素等。盡管如此，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)用于組織培養(yǎng)的抗生素對(duì)于控制細(xì)菌污染有一定效果，但依然存在許多菌株產(chǎn)生抗藥性，因此抗生素的選擇和應(yīng)用上需要謹(jǐn)慎處理［52,76］。

3.2.4 pH 和溫度 在確保細(xì)胞充足的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源和防止污染微生物外，適宜的pH 和溫度對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)同樣至關(guān)重要。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境pH 值一般保持在7.0～7.4，培養(yǎng)基pH 值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。將其放置在含有5%CO2培養(yǎng)箱中可一定程度上維持pH 值穩(wěn)定。L15 培養(yǎng)基配方中不含碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，不需要CO2平衡環(huán)境，因此受到許多研究人員青睞，廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)［77］。

細(xì)胞培養(yǎng)溫度與其生存的環(huán)境溫度緊密相關(guān)，魚(yú)類(lèi)屬于變溫動(dòng)物，因此魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)的溫度范圍比哺乳動(dòng)物更加廣。根據(jù)Fryecr 等［22］的觀點(diǎn)，冷水性魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)的適溫范圍為4～24 ℃，最適溫度為15～21 ℃；溫水性魚(yú)類(lèi)的適溫范圍為15～37 ℃，最適溫度為25～35 ℃。例如，虹鱒腎臟和眼睛細(xì)胞系低溫下生長(zhǎng)良好，8～20 ℃細(xì)胞達(dá)到較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，16 ℃下生長(zhǎng)最快，2～3 d 內(nèi)即可形成單層細(xì)胞；羅非魚(yú)肝細(xì)胞系在28 ℃和37 ℃條件下生長(zhǎng)良好，可存活2～3 周，39 ℃高溫下也可存活5～7 d，這證明了羅非魚(yú)肝細(xì)胞的相對(duì)耐高溫性［78］。即使同一種物種不同細(xì)胞的體外培養(yǎng)溫度和適應(yīng)性也具有特異性，羅非魚(yú)腎臟細(xì)胞系(TiK)在15 ℃時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，而在34℃時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速率在前2 d 較為迅速，隨后變慢趨于穩(wěn)定，速率約為最適溫度28 ℃的50%［79］。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)條件優(yōu)化過(guò)程中提高了大黃魚(yú)卵巢細(xì)胞系（LYCO）和大黃魚(yú)睪丸細(xì)胞系（LYCT）在27℃時(shí)的生長(zhǎng)速度和增殖能力［80］。

4 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)展望

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系大多從重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中建立，細(xì)胞體外培養(yǎng)可以很好地保留組織內(nèi)的同質(zhì)性，獲得并維持細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖，而硬骨魚(yú)體內(nèi)免疫刺激后各種免疫基因表達(dá)水平快速反應(yīng)已被多方證實(shí)，但是對(duì)于誘導(dǎo)的免疫機(jī)制尚不明確，因此建立新魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系在后期水產(chǎn)動(dòng)物研究中發(fā)揮著重要作用［81］。

工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展以及人們生活水平的提高產(chǎn)生了大量化學(xué)、重金屬等污染物，由于其在水中不易降解，這些污染物如何影響水生動(dòng)物的健康生長(zhǎng)促使我們更多地關(guān)注魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的反應(yīng)機(jī)制。在哺乳動(dòng)物中，小鼠多功能干細(xì)胞（iPSC）具有無(wú)限的增殖能力，被用于研究高等動(dòng)物多功能的模型，而魚(yú)類(lèi)iPSC 的研究較少，魚(yú)類(lèi)多功能干細(xì)胞也可作為潛在的低等脊椎動(dòng)物多功能機(jī)制的重要模型，以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖需求［82-83］。不僅如此，魚(yú)類(lèi)iPSC 也可作用于再生醫(yī)學(xué)、疾病建模、基于iPSC 的藥物發(fā)現(xiàn)以及毒性評(píng)估等，因此對(duì)于魚(yú)類(lèi)iPSC 的深入研究非常必要。目前已建立了家畜生物庫(kù)，除了胚胎細(xì)胞外，許多體細(xì)胞也可用于日后的生產(chǎn)或克隆動(dòng)物，建立一個(gè)類(lèi)似的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞生物庫(kù)，保存有價(jià)值的瀕危魚(yú)類(lèi)，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看是一種有效、經(jīng)濟(jì)、方便并且值得大力推廣的魚(yú)類(lèi)瀕危物種保護(hù)手段［84］。

一直以來(lái)，最常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法是二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)方法，然而由于2D 細(xì)胞培養(yǎng)法具有一定的局限性，比如2D 細(xì)胞培養(yǎng)條件下細(xì)胞不能模擬組織或腫瘤的自然結(jié)構(gòu)［85］。而三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)具有通過(guò)類(lèi)器官的方式來(lái)代替器官的潛力，有望能彌補(bǔ)2D 細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷，盡管目前3D 細(xì)胞培養(yǎng)還存在著難以還原細(xì)胞微環(huán)境等問(wèn)題［86-87］。因此，未來(lái)實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞分離技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的應(yīng)用尤為重要。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的研究雖晚于哺乳動(dòng)物，但發(fā)展十分迅速，據(jù)統(tǒng)計(jì)現(xiàn)有1 128 株魚(yú)類(lèi)細(xì)胞從不同組織中被建立，仍有許多魚(yú)類(lèi)細(xì)胞有待進(jìn)一步深入研究。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)早已滲透至生命科學(xué)的各個(gè)學(xué)科，有著廣闊的發(fā)展前景。