毛美琴，藍楨宇，李 進，郭錫燚，黃鳳萍，廖元龍，蔡小輝

（北部灣大學海洋學院/廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 536011）

細胞培養(yǎng)技術(shù)起始于20 世紀初，最初以未離散的組織小塊進行培養(yǎng)，組織小塊呈放射狀遷移出細胞［1］。迄今為止，細胞培養(yǎng)已有100 多年的悠久歷史。1640 年荷蘭眼鏡商詹森首次制成了世界上第一臺放大倍數(shù)約10～30 倍的復(fù)式顯微鏡，細胞培養(yǎng)的研究工作逐步展開［2］。英國物理學家Hooke 利用顯微鏡觀察軟木片，由此人類發(fā)現(xiàn)了世界上第一個植物細胞。隨后美國生物學家Harrison 利用淋巴液作為培養(yǎng)基，從蝌蚪脊索中成功分離出神經(jīng)組織，觀察到神經(jīng)細胞突起的生長過程，證明細胞在離體條件下可以存活，細胞培養(yǎng)在世界上逐漸揭開序幕［3］。該技術(shù)激起了廣泛醫(yī)學科學研究人員的興趣，細胞體外培養(yǎng)具有形態(tài)一致、遺傳背景相似和重復(fù)性好等優(yōu)點，可作為良好的實驗對象。基于各種動物組織易獲性的優(yōu)點，更多組織被選用為研究對象，研究過程中發(fā)現(xiàn)雞胚組織的原代細胞可提供各種類型的細胞，后來多采用哺乳動物作為研究對象，尤其嚙齒動物組織具有可形成連續(xù)細胞系的優(yōu)點［4-5］。

起初，為避免正常體內(nèi)自體調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)可能產(chǎn)生的整體因素影響，細胞培養(yǎng)技術(shù)多應(yīng)用于醫(yī)學相關(guān)研究（如抗病毒疫苗、腫瘤發(fā)生機制）。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)細胞系可作為研究病毒的發(fā)生器、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［6-7］。在低等脊椎動物和無脊椎動物的發(fā)育過程中表現(xiàn)出的特性（如再生功能、變態(tài)發(fā)育等），加之近年農(nóng)業(yè)病害防控需要，特殊種類細胞培養(yǎng)吸引了許多研究人員的關(guān)注。已有大量研究證明，細胞培養(yǎng)技術(shù)在現(xiàn)代生物化學、分子生物學、病毒學、環(huán)境毒理學、免疫學以及現(xiàn)代醫(yī)學領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿Γ?］。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟效益逐年遞增，淡水和海水病害防控、環(huán)境等問題使得魚類健康發(fā)育和病理發(fā)生等研究受到了更多關(guān)注。近年來各類魚類細胞系不斷被建立，如金魚（Carassius auratus）、斑馬魚（Brachydanio rerio var）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鯉魚（Cyprinus carpio）和鮭魚（Oncorhynchus keta）等。新細胞系的建立對于基因組學研究、病毒與宿主互作以及細菌的鑒定和重金屬的毒性分析、干細胞功能研究等具有促進作用。本綜述將圍繞魚類細胞培養(yǎng)歷史、應(yīng)用和培養(yǎng)技術(shù)進行介紹。

1 魚類細胞培養(yǎng)歷史

1962 年，Wolf 等［9］建立了第一個真骨魚類永久細胞系虹鱒性腺細胞系（RTG-2）。1962—1980 年是魚類細胞系建立的起步階段，Cravell等［10］建立了鳙魚（Hypophthalmichthys nobilis）肌肉細胞系（FHM）。20 世紀中期用于細胞培養(yǎng)的組織也越來越豐富，將肝、脾、性腺、鰭條、皮膚等組織到魚體幾乎所有組織，以及魚類細胞成功應(yīng)用到免疫系統(tǒng)、疫苗等研究領(lǐng)域。例如，Matsumoto 等［11］從金魚紅細胞腫瘤中建立了永生性細胞系（GEM-81），并利用該細胞系進行注射免疫等研究；Noga 等［12］分別建立了胡子鯰(Clarias batrachus) 的腎臟細胞系（K1K）、鰓細胞系（G1B）、性腺細胞系（GD Ⅱ），并在K1K中進行了鯰魚病毒（CCV）的滅活疫苗研究；Collodi 等［13］建立斑馬魚的胚胎細胞系，是體外分離與培養(yǎng)模式魚類胚胎干細胞研究的開始。

我國研究魚類細胞起始于20 世紀70 年代，張念慈等［14］為研究病毒性魚類，在我國首次建立了草魚(Ctenopharyngodon idellus)吻端細胞系ZC-7901 及亞株ZC-7901S1。近年來，由于魚類人工養(yǎng)殖特別是高密度集約化養(yǎng)殖條件與天然環(huán)境差別很大，導(dǎo)致病害大規(guī)模暴發(fā)，魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸受到重視。應(yīng)用于病毒學、毒理學、免疫學等的細胞系不斷被建立，如鯽魚（Carassius auratus auratus）的囊胚細胞系（CAB-80）、草魚的腎臟細胞系（CIK）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）的尾鰭細胞系（TQ-8801）等［15-18］。特定的組織被用來研究病原體的特定功能和病理生理學，例如，魚類肝臟細胞主要用于毒理學研究，頭腎和脾臟細胞用于免疫研究，而鰓細胞則用于致病性研究［19］。其中淋巴細胞和巨噬細胞主要來源于頭腎，用于研究病原體魚體宿主之間的關(guān)聯(lián)和清除能力［20-21］。另外，魚類細胞系對于研究不同污染物對魚類遺傳毒性、魚類生理學和遺傳學等具有重要作用。

據(jù)統(tǒng)計，1994 年全世界共建立了159 個魚類細胞系，其中包含了125 株淡水魚類和溯河洄游性鮭科魚類的細胞系，分別來源于21 科52 種魚類的不同組織；34 株海水魚類細胞系，分別來源于13 科22 種魚類的不同組織［22］。截至2021 年，全世界共建立了1 128 株魚類細胞系［23］。

2 魚類細胞的應(yīng)用

魚類細胞作為體外研究的重要工具，具有培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度適應(yīng)范圍較大、培養(yǎng)基選擇范圍較廣、易于分離培養(yǎng)等特點，因此受到水產(chǎn)動物研究人員的關(guān)注。魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)早前多應(yīng)用于鑒定新出現(xiàn)的病毒性研究，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學、免疫學、魚類生理學和種質(zhì)資源保存等方面研究［24］。

2.1 魚類病毒學

在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中，許多重要的經(jīng)濟水產(chǎn)動物易受傳染性病毒影響，常見病毒如石斑魚（Epinephelusspp）虹彩病毒（SGIV）、赤點石斑魚（Epinephelus akaara）神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）、鮭魚呼腸孤病毒（CSV）、錦鯉（Cyprinus carpio）皰疹病毒（KHV）、鰻鱺（Anguilla japonica）皰疹病毒（HVA）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）湖病毒（TiLV）和傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）等。病毒性疾病的暴發(fā)易引起水產(chǎn)動物大規(guī)模死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失，極大阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展。魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，解決了魚類病毒分離鑒定的技術(shù)難題，并且利用細胞培養(yǎng)能夠使病毒在體外持續(xù)生長分裂，培養(yǎng)條件易于控制，不受其他病毒的隱性干擾。如今細胞系已成功應(yīng)用于從病變組織中分離病原體，研究機制包括病毒在機體內(nèi)的感染、復(fù)制和釋放等［25］。例如，利用卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）腦細胞系TOGB 來測定病毒易感性，TOGB 在第45 代時轉(zhuǎn)染效率為64.8%，試驗表明該細胞適合外源基因的表達［26］。對魚類不同組織樣本進行病毒敏感度檢測，發(fā)現(xiàn)魚鰭是病毒的主要發(fā)生位點，可作為檢測病毒的有利工具。Jun等［27-28］利用鯉魚鰭細胞系感染彈狀病毒（SVCV），研究其在彈狀病毒感染中免疫基因表達和抗病毒機制。魚類疾病預(yù)防和疾病診斷在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位，通過建立魚類細胞系可從源頭了解病毒侵染途徑，有利于篩選抗病毒的疫苗開發(fā)［29］。

2.2 環(huán)境毒理學

工農(nóng)業(yè)興起的同時大量污染物和有害重金屬進入水生生態(tài)系統(tǒng)（如銅、汞、鎘、鉛和其他化學污染物），嚴重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，水環(huán)境中聚積的有害物質(zhì)具有不可降解性和較長的生物半衰期，魚類長期生活在該環(huán)境中直接給人類帶來健康風險［30-31］。過去的毒理實驗大多在活魚體內(nèi)進行，實驗過程需要大量養(yǎng)殖設(shè)備，中途需要不斷充氣和換水，消耗巨大的人力和物力，且實驗周期長。另外，活體實驗過程中存在不可控因素，如試驗活魚代謝、應(yīng)激反應(yīng)等難以控制導(dǎo)致實驗結(jié)果重復(fù)性較差。過往的研究表明，魚類細胞具有高度敏感性和重現(xiàn)性，可用于廢水評估，尤其是水環(huán)境的整體毒性、毒性評估鑒定和基于有毒物質(zhì)對于水生動物的相互作用研究［32-33］。

金屬、化學物質(zhì)及其衍生物廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，不同程度地暴露于人類和動物中，將斑馬魚胚胎細胞和人單核細胞系（THP-1）分別暴露于金屬納米顆粒，研究結(jié)果表明，金屬納米顆粒對斑馬魚和人類的細胞形態(tài)和生理有顯著影響；采用不同濃度的1,2,4-三氯苯對體外培養(yǎng)的斑馬魚肝細胞進行毒理實驗，結(jié)果表明，水中殘留的1,2,4-三氯苯可導(dǎo)致斑馬魚肝細胞DNA損傷作用。相關(guān)研究結(jié)果證明這些金屬納米顆粒、化學污染物對于人類和環(huán)境可能造成毒理學的影響［34-37］。因此，建立魚類細胞系研究水生環(huán)境中農(nóng)藥、抗生素和重金屬等環(huán)境污染物具有重要意義［38-39］。近年微塑料生態(tài)毒性也激起了相關(guān)研究人員的興趣，可將魚類細胞作為模型，評估微塑料對魚類細胞的毒性［40］。魚類細胞作為檢測環(huán)境污染物的重要生物工具，有望發(fā)展為常見有毒污染物的生物指示物。

2.3 魚類免疫學

魚類在水環(huán)境中與病原密切接觸，是研究動物免疫模型重要的角色之一，魚類細胞系的建立為天然免疫基因功能分析提供了可行工具。在魚類中參與免疫防御的器官主要有頭腎、鰓、脾、胸腺和皮膚，其中頭腎組織類似于哺乳動物的造血器官，由免疫細胞組成，可用于硬骨魚免疫的發(fā)育和功能［41］。魚類免疫系統(tǒng)中包含有許多細胞因子，主要行使非特異性和特異性免疫防御，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。利用細胞因子可作為標記物用于檢測魚類的先天性免疫反應(yīng)［42］。穩(wěn)定的細胞系建立有助于低等脊椎動物免疫功能的研究，當虹鱒單核細胞系（RTS11）受到外界刺激后促炎細胞因子（IL-1β、TNFα 和IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）等的表達發(fā)生顯著上調(diào)，產(chǎn)生的細胞因子可用于疾病治療［43］。斑馬魚胚胎細胞系（ZBE3）具有高轉(zhuǎn)染效率，可作為魚類免疫反應(yīng)有用的研究工具［44］。而通過研究冷水魚類細胞在不同溫度下的免疫調(diào)節(jié)，得出冷水魚依賴先天性免疫以抵抗感染［45］。因此，魚類新細胞系的建立有助于研究免疫調(diào)節(jié)基因，是疾病預(yù)防控制及疫苗開發(fā)的重要免疫模型。

2.4 干細胞研究

長期以來，以貿(mào)易為目的過度開發(fā)動物、引進非本土生物、生態(tài)污染、氣候變化和跨界疾病，使得水生生物多樣性受到嚴重威脅。魚類細胞系的建立對魚類種質(zhì)和基因資源具有有效保護［46］。其中胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell,ESC）是克隆性增殖、自我更新、功能上原始的細胞，具有分化為幾種或所有器官功能細胞類型的潛能，是發(fā)育生物學中強有力的實驗工具［47］。在胚胎和胎兒時期干細胞的目的是促進機體的初始發(fā)育和生長，而在成體中承擔著機體所有組織的自然修復(fù)作用。目前，已在各類低等脊椎動物發(fā)現(xiàn)其擁有這些能力，包括魚類。

斑馬魚因固有的透明度和具有高度遺傳保守性，現(xiàn)已成為研究造血發(fā)育的一個熱門模型動物，近年建立了穩(wěn)定斑馬魚干細胞系，包括斑馬魚胚胎干細胞系（Z428）、斑馬魚胚胎機制干細胞系（ZEST）、斑馬魚胚胎祖細胞系（HSPC）［48-49］。另外，尼羅羅非魚胚胎干細胞（TES1）在體外和體內(nèi)都具有多功能性和分化潛能，為后續(xù)再生功能性的生物醫(yī)學研究工作奠定了基礎(chǔ)［50］。

3 魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)

3.1 培養(yǎng)方法

細胞培養(yǎng)技術(shù)的標準化促使許多適用于生物化學和分子分析的細胞系被建立。相較于哺乳動物，魚類細胞代謝率較低，更容易在體外條件下生存。目前，魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)主要以哺乳動物為參考，一般分為原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)。其中原代細胞培養(yǎng)是指在無菌、麻醉條件下從魚體取出組織分離出單個細胞，人工模擬機體內(nèi)環(huán)境，使其在體外生長發(fā)育，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，長到一定密度后即可進行傳代操作，傳代后的細胞就是細胞系［2］。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點是細胞離體時間短，生物學特性尚未發(fā)生明顯改變，為二倍體核型，能夠更加真實反映出體內(nèi)的生長特性，適合應(yīng)用于毒性測試、免疫學等研究實驗［51］。常用于分離單個細胞的方法有組織貼壁法、酶消化法和機械消化法，產(chǎn)生的原代細胞用于后續(xù)傳代培養(yǎng)。

3.1.1 組織塊貼壁法 組織塊貼壁法最早應(yīng)用于Harrison 蝌蚪脊索神經(jīng)細胞培養(yǎng)，組織細胞浸沒于淋巴液中獲得營養(yǎng)生長發(fā)育。該法適用于組織量較少或生長較致密的組織，如鰭條、皮膚、肌肉和性腺等組織，因為機械或酶解作用可能造成細胞損傷。而組織塊貼壁法的不足之處在于部分組織缺乏粘附性，向外遷移生長具有選擇性。盡管如此，組織塊貼壁法仍是常見且簡單可行的原代細胞培養(yǎng)方法之一。組織塊貼壁法是在無菌條件下分離出目的組織，用緩沖液清洗被膜、脂肪以及血液等雜質(zhì)，用無菌解剖工具將組織塊分離成1 mm3大小，接種在細胞瓶底部。加入培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并根據(jù)細胞生長情況及時更換細胞培養(yǎng)液，直至細胞從組織塊周圍遷出。組織塊貼壁法需要較長時間才能使組織貼壁，掌握好貼壁時間尤為重要，可避免組織細胞缺少營養(yǎng)而死亡。

以往研究表明，組織塊貼壁法培養(yǎng)的細胞具有細胞形態(tài)完整、增殖能力強等優(yōu)點。Githa 等［52］對淡黑雀鯛（Pomacentrus caeruleus）的各部位組織細胞進行細胞培養(yǎng)條件探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用組織塊貼壁法對不同組織原代細胞培養(yǎng)，只有鰓、胸鰭和尾鰭組織細胞獲得良好的融合細胞單層。利用組織塊培養(yǎng)大進行團頭魴骨組織細胞系（MBCs）的建立，可大量培養(yǎng)出以輻射狀的形式生長穩(wěn)定的貼壁細胞［53］。

3.1.2 酶消化法 利用酶消化法可以避免細胞因遷移率而選擇性生長的問題，在短時間內(nèi)能夠快速獲得大量具有代表性的細胞，適用于培養(yǎng)大量組織。酶消化法是指將妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維）去除，細胞分散成細胞懸液，使細胞更易汲取外界養(yǎng)分并排除代謝廢物。用于體外分離細胞的蛋白消化酶主要有胰蛋白酶（trypsin）、膠原酶（collagenase）、溶菌酶（lysozyme）、胃蛋白酶（pepsin）、中性蛋白酶（Sarre peptidase）等，細胞消化過程中胰蛋白酶和膠原酶較為常見。例如，大口黑鱸（Micropterus salmoides）性腺細胞系（LMBG）建立時將組織懸浮在0.25%的胰蛋白酶進行消化，所分離出的單細胞生長狀態(tài)佳并傳代超過118 代［54］；利用同樣的方法，Gao等［55］建立了大菱鲆（Scophthalmusmaximus）肌肉連續(xù)成纖維樣細胞系（TMF），后續(xù)的傳代培養(yǎng)成功培養(yǎng)超過60 多代。另有研究運用不完全消化法進行原代細胞培養(yǎng)，即采用組織塊貼壁法和酶消化法結(jié)合，既可提高細胞產(chǎn)率又可保持細胞間的相互聯(lián)系［56-57］。

3.1.3 機械破碎法 采用組織貼壁法培養(yǎng)原代細胞時，細胞遷出速度較慢，僅適用于少量組織，而利用酶消化法對細胞消化過程中存在損害細胞的風險，因此機械破碎法也受到了許多研究人員的青睞。機械破碎法適用于電解質(zhì)較軟、內(nèi)含纖維性成分較少且對機械分離具有耐受性的組織，如胚胎、脾、肝、成年魚體的腦或軟質(zhì)腫瘤等。通常機械破碎法是指通過各種物理手段將組織塊破碎分離成單個細胞，常利用尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)研磨過濾或反復(fù)吹打組織，離心重懸得到單細胞懸液，這種方法可較快地獲取大量細胞，但是易產(chǎn)生機械損傷。如草魚腸道上皮細胞（IECs）的培養(yǎng)采用不同的消化方法，經(jīng)對比檢驗可知，采用機械破碎法進行消化分離出的細胞效果較好，但是該方法在分離單細胞的同時易產(chǎn)生機械損傷［58］。

以上培養(yǎng)方法中，細胞需要依賴于錨定的固體基質(zhì)來附著、擴散和生長，同時細胞培養(yǎng)需要提供營養(yǎng)的培養(yǎng)基和所需的生長因子作為細胞生長補充劑。

3.2 細胞培養(yǎng)條件

3.2.1 細胞培養(yǎng)基 早期細胞培養(yǎng)多采用天然培養(yǎng)液，一般為組織提取物和體液，常見的有淋巴液、血漿、血清。隨著隨著細胞培養(yǎng)的深入研究，細胞培養(yǎng)液的化學成分逐漸明確。Eagle 等成功研制的合成培養(yǎng)基進一步推動了細胞培養(yǎng)的研究進程。Eagle’s 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分簡單，僅含有必需氨基酸、維生素和無機鹽［59-62］。后來根據(jù)不同細胞的特性設(shè)計了成分更加多樣化的培養(yǎng)基，如DMEM 培養(yǎng)基是為了小鼠成纖維細胞而設(shè)計。迄今為止用于魚類細胞的特殊培養(yǎng)基種類有限，主要參考已建立細胞系的培養(yǎng)程序進行。根據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，DMEM、M199、F12、L15 以及DMEM/F12 近年來被廣泛應(yīng)用［63-65］。

3.2.2 血清 除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，血清是魚類細胞培養(yǎng)基中重要的補充劑之一，含有多種生物活性物質(zhì)［66］。常用于細胞培養(yǎng)的血清主要有胎牛血清、小牛血清、成年馬血清及本體血清（如魚血清），其中胎牛血清和小牛血清應(yīng)用最為廣泛，尤其是胎牛血清的培養(yǎng)效果最佳。胎牛血清為懷孕5～8 個月的母牛胎盤中未發(fā)育完全的胎牛血清。胎牛血清未曾接觸過外界，含有抗體、補體等對細胞有害成分少，并含有特殊的生長因子，有利于細胞的貼壁和鋪展，同時提供載體蛋白以中和毒性物質(zhì)減少細胞損傷，提供蛋白抑制劑以保護細胞免受凋亡細胞釋放的蛋白酶損害。魚類細胞培養(yǎng)過程中也可添加一定量的本體血清作為促生長劑，如尼羅羅非魚胚胎干細胞原代培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中添加羅非魚血清，研究發(fā)現(xiàn)本體血清具有促進胚胎干細胞分裂的作用［67］。

根據(jù)培養(yǎng)細胞不同，培養(yǎng)基中含有的血清量有所差異，原代細胞培養(yǎng)時，對營養(yǎng)成分需求量較大。如Liu 等［59］在石斑魚腦細胞原代培養(yǎng)研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)液中含有15%和20%FBS 培養(yǎng)的細胞生長率顯著高于FBS 含量為5%和10%的培養(yǎng)液，而15%和20% FBS 培養(yǎng)液間無顯著差異。眼斑雙鋸魚（Amphiprion ocellaris）尾鰭細胞系（OCF）在5%、10% FBS 條件下生長狀態(tài)較差，而在15% FBS 條件下生長相對較好，而20% FBS 條件下細胞生長狀態(tài)最佳，隨著傳代次數(shù)的增加至34 次時可將FBS 濃度逐漸降至15%［68］。另有研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚（Larimichthys crocea）性腺細胞采用20% FBS 進行培養(yǎng)效果較好［69］。

3.2.3 生長因子和抗生素 細胞培養(yǎng)液除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清外，還可添加少量生長因子以促進細胞生長增殖。常用的生長因子主要有表皮細胞生長因子（EGF）和成纖維生長因子（FGFs）。EGF 是動物體內(nèi)一種重要的細胞因子，對形成細胞、成纖維細胞核癌前病變細胞等具有促進作用［70］。而FGFs 則可協(xié)同神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有較強的促有絲分裂活性作用，促進感覺神經(jīng)和神經(jīng)系統(tǒng)的生長［71-72］。例如，堿性成纖維生長因子（bFGF）被用于刺激斑馬魚和牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎細胞的增殖［73-74］；藍鰭金槍魚（Thunnus thynnus）細胞系（SBR-E1）在傳代培養(yǎng)1～12 代的培養(yǎng)液中加入bFGF，一定程度上可抑制細胞分化［75］；在金魚和銀鯽（Caras sius auratus gibelio）腦細胞系建立過程中被證明EGF和bFGF 可用作腦細胞前10 代增殖的有效促有絲分裂因子［18］。另外，濃度不同的生長因子對細胞增殖的促進作用不同，低濃度時隨生長因子濃度增加而增加，達到峰值后濃度上升甚至會發(fā)生抑制細胞生長的現(xiàn)象。

細胞對微生物的防御能力較弱，培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為微生物提供了游離的生長環(huán)境，快速增殖的微生物分泌的毒素易導(dǎo)致細胞大量死亡，在細胞培養(yǎng)初期為防止微生物污染，通常會向培養(yǎng)液中添加適量抗生素。常用于組織培養(yǎng)的抗生素有青霉素、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素等。盡管如此，在研究過程中發(fā)現(xiàn)用于組織培養(yǎng)的抗生素對于控制細菌污染有一定效果，但依然存在許多菌株產(chǎn)生抗藥性，因此抗生素的選擇和應(yīng)用上需要謹慎處理［52,76］。

3.2.4 pH 和溫度 在確保細胞充足的營養(yǎng)來源和防止污染微生物外，適宜的pH 和溫度對于細胞生長同樣至關(guān)重要。細胞培養(yǎng)環(huán)境pH 值一般保持在7.0～7.4，培養(yǎng)基pH 值過高或過低都會影響細胞的生長增殖。將其放置在含有5%CO2培養(yǎng)箱中可一定程度上維持pH 值穩(wěn)定。L15 培養(yǎng)基配方中不含碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，不需要CO2平衡環(huán)境，因此受到許多研究人員青睞，廣泛應(yīng)用于魚類細胞的培養(yǎng)［77］。

細胞培養(yǎng)溫度與其生存的環(huán)境溫度緊密相關(guān)，魚類屬于變溫動物，因此魚類細胞培養(yǎng)的溫度范圍比哺乳動物更加廣。根據(jù)Fryecr 等［22］的觀點，冷水性魚類細胞培養(yǎng)的適溫范圍為4～24 ℃，最適溫度為15～21 ℃；溫水性魚類的適溫范圍為15～37 ℃，最適溫度為25～35 ℃。例如，虹鱒腎臟和眼睛細胞系低溫下生長良好，8～20 ℃細胞達到較好的生長狀態(tài)，16 ℃下生長最快，2～3 d 內(nèi)即可形成單層細胞；羅非魚肝細胞系在28 ℃和37 ℃條件下生長良好，可存活2～3 周，39 ℃高溫下也可存活5～7 d，這證明了羅非魚肝細胞的相對耐高溫性［78］。即使同一種物種不同細胞的體外培養(yǎng)溫度和適應(yīng)性也具有特異性，羅非魚腎臟細胞系(TiK)在15 ℃時細胞增長緩慢，而在34℃時細胞生長速率在前2 d 較為迅速，隨后變慢趨于穩(wěn)定，速率約為最適溫度28 ℃的50%［79］。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)條件優(yōu)化過程中提高了大黃魚卵巢細胞系（LYCO）和大黃魚睪丸細胞系（LYCT）在27℃時的生長速度和增殖能力［80］。

4 魚類細胞培養(yǎng)展望

魚類細胞系大多從重要經(jīng)濟魚類中建立，細胞體外培養(yǎng)可以很好地保留組織內(nèi)的同質(zhì)性，獲得并維持細胞在體內(nèi)外的增殖，而硬骨魚體內(nèi)免疫刺激后各種免疫基因表達水平快速反應(yīng)已被多方證實，但是對于誘導(dǎo)的免疫機制尚不明確，因此建立新魚類細胞系在后期水產(chǎn)動物研究中發(fā)揮著重要作用［81］。

工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展以及人們生活水平的提高產(chǎn)生了大量化學、重金屬等污染物，由于其在水中不易降解，這些污染物如何影響水生動物的健康生長促使我們更多地關(guān)注魚類細胞的反應(yīng)機制。在哺乳動物中，小鼠多功能干細胞（iPSC）具有無限的增殖能力，被用于研究高等動物多功能的模型，而魚類iPSC 的研究較少，魚類多功能干細胞也可作為潛在的低等脊椎動物多功能機制的重要模型，以滿足日益增長的水產(chǎn)養(yǎng)殖需求［82-83］。不僅如此，魚類iPSC 也可作用于再生醫(yī)學、疾病建模、基于iPSC 的藥物發(fā)現(xiàn)以及毒性評估等，因此對于魚類iPSC 的深入研究非常必要。目前已建立了家畜生物庫，除了胚胎細胞外，許多體細胞也可用于日后的生產(chǎn)或克隆動物，建立一個類似的魚類細胞生物庫，保存有價值的瀕危魚類，從長遠來看是一種有效、經(jīng)濟、方便并且值得大力推廣的魚類瀕危物種保護手段［84］。

一直以來，最常見的細胞培養(yǎng)方法是二維（2D）細胞培養(yǎng)方法，然而由于2D 細胞培養(yǎng)法具有一定的局限性，比如2D 細胞培養(yǎng)條件下細胞不能模擬組織或腫瘤的自然結(jié)構(gòu)［85］。而三維（3D）細胞培養(yǎng)具有通過類器官的方式來代替器官的潛力，有望能彌補2D 細胞培養(yǎng)的缺陷，盡管目前3D 細胞培養(yǎng)還存在著難以還原細胞微環(huán)境等問題［86-87］。因此，未來實現(xiàn)魚類細胞分離技術(shù)和細胞培養(yǎng)條件的標準化，對于魚類細胞的應(yīng)用尤為重要。魚類細胞的研究雖晚于哺乳動物，但發(fā)展十分迅速，據(jù)統(tǒng)計現(xiàn)有1 128 株魚類細胞從不同組織中被建立，仍有許多魚類細胞有待進一步深入研究。細胞培養(yǎng)技術(shù)早已滲透至生命科學的各個學科，有著廣闊的發(fā)展前景。