李宇赫，裴 悅，沈怡彤，張 銳，王宜宜，王劭學(xué)，姚莉琦，李力涵，康明明，李登耀，陳玉輝

（蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000）

CRISPR-Cas9 是近幾年發(fā)展起來的一類基因編輯技術(shù)，它能對(duì)基因組中特定的位點(diǎn)進(jìn)行編輯，技術(shù)門檻低、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短且成本低廉[1-2]。隨著CRISPR-Cas9 技術(shù)的不斷完善和成熟，該技術(shù)已經(jīng)在微生物[3]、動(dòng)物[4-6]和植物[7-9]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。利用CRISPR-Cas9 技術(shù)，科研工作者已經(jīng)在水稻(Oryza sativa)[8-10]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11]、 煙 草(Nicotiana tabacum)[11-12]、 玉 米(Zea mays)[13]、小 麥(Triticum aestivum)[9,14]、高粱(Sorghum bicolor)[7]、大豆(Glycine max)[15-16]等植物上成功的實(shí)現(xiàn)了基因編輯。2013 年Shan 等[9]利用CRISPR-Cas9 技術(shù)成功編輯了水稻OsPDS-P1和OsBADH2基因，首次實(shí)現(xiàn)了CRISPR-Cas9 在水稻基因組中的編輯。2015 年，Michno 等[17]研究實(shí)現(xiàn)了CRISPR-Cas9 系統(tǒng)通過毛根轉(zhuǎn)化，編輯大豆和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)體細(xì)胞基因，表明CRISPR-Cas9 技術(shù)在豆科植物基因功能研究中具有很大的應(yīng)用潛力。2016 年，Meng 等[18]開發(fā)了一種優(yōu)化的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium) 介導(dǎo)成功地誘導(dǎo)了蒺藜苜蓿MtPDS基因的編輯，并利獲得了純合突變體，基因編輯效率達(dá)到10.35%，證明了CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在蒺藜苜蓿中的可行性，開創(chuàng)了CRISPR-Cas9 技術(shù)在蒺藜苜?；蚓庉嫷南壤?。2017 年Curtin 等[19]同樣利用開發(fā)的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)成功的對(duì)蒺藜苜蓿Medtr4g020620和Medtr2g013650基因進(jìn)行了編輯。如今CRISPR-Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蒺藜苜蓿的基因功能研究，極大地推進(jìn)了共生固氮、植物發(fā)育和植物抗逆等方面的研究。進(jìn)一步研究將使CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在紫花苜蓿(Medicago sativa)等基因組更復(fù)雜、更龐大的栽培豆科牧草中的應(yīng)用范圍擴(kuò)大，有利于加快豆科牧草的遺傳改良。

串聯(lián)重復(fù)基因是植物基因組的重要組成部分，為植物基因組增加了基因拷貝數(shù)和同源基因變異，對(duì)植物基因家族的擴(kuò)展貢獻(xiàn)顯著，在植物進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境變化中起著重要作用[20-21]。蒺藜苜蓿是豆科模式植物，其基因組中 33% 的基因以串聯(lián)重復(fù)形式存在[22]，這些基因在功能上冗余，是研究豆科植物基因功能的一大瓶頸。

DWF7基因編碼Δ7甾醇C5去飽和酶，參與植物油菜素甾醇的合成。在模式植物擬南芥中該基因只有一個(gè)拷貝(AT3G02580)，AtDWF7 蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)顆粒，在植物油菜素內(nèi)酯和甾醇合成途徑發(fā)揮作用。atdwf7表現(xiàn)出明顯的矮化、育性降低或喪失的表型[23]。在蒺藜苜?；蚪M中，DWF7基因定位于6 號(hào)染色體，有3 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的拷貝：Medtr6g018820.1(GENE1)、Medtr6g018860.1(GENE2)、Medtr6g018900.1(GENE3) (圖1)。由于基因功能的冗余，在豆科植物中對(duì)于DWF7基因的研究沒有相關(guān)報(bào)道。為了研究DWF7基因在豆科植物發(fā)育中的功能，本研究利用CRISPR-Cas9 技術(shù)，針對(duì)蒺藜苜蓿DWF7基因的3 個(gè)拷貝，通過序列比對(duì)在3 個(gè)基因外顯子的同源區(qū)段設(shè)計(jì)了兩個(gè)靶點(diǎn)，構(gòu)建基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型蒺藜苜蓿產(chǎn)生毛根，提取轉(zhuǎn)基因毛根DNA 進(jìn)行基因編輯的分析鑒定。本研究在毛根中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)蒺藜苜蓿DWF7基因3 個(gè)拷貝的同時(shí)編輯，證明CRISPR-Cas9 系統(tǒng)同時(shí)編輯含有同源區(qū)段的串聯(lián)重復(fù)基因的可能性，為進(jìn)一步通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得dwf7突變體植株提供理論依據(jù)，有利于進(jìn)一步研究豆科植物中DWF7的基因功能。同時(shí)該方法也為今后通過CRISPR-Cas9 技術(shù)對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因的編輯提供參考。

圖1 MtDWF7 在6 號(hào)染色體上位置示意圖Figure 1 Schematic of MtDWF7 position on chromosome 6 in Medicago truncatula

1 材料與方法

1.1 植物材料、載體和菌株

根毛轉(zhuǎn)化受體材料為本試驗(yàn)保存的蒺藜苜蓿野生型‘Jemalong A17’。

本研究所用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)載體：pAH595、pNJB184-4 Cas9、pSC218GG 均由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Nevin D.Young 實(shí)驗(yàn)室提供。

本研究所用菌株：大腸桿菌DH5α、DB3.1和發(fā)根農(nóng)桿菌Arqual1 均由細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Esp3Ⅰ、BsaⅠ及T4 DNA 連接酶購(gòu)自New England BioLabs (NEB) 公司；LR Clonase購(gòu)自賽默飛公司；DNA 抽提試劑盒、壯觀霉素、卡那霉素等購(gòu)自天根生化科技公司；氯化錳、硼酸、氫氧化鉀等化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工和國(guó)藥公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 MtDWF7 基因的序列比對(duì)和靶點(diǎn)選擇

從https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html網(wǎng)站下載MtDWF7基因序列，通過生物信息學(xué)的方法對(duì)基因序列分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)：GENE1和GENE2的基因組序列含有3 個(gè)外顯子區(qū)段，而GENE3只含有2 個(gè)外顯子區(qū)段。本研究進(jìn)一步對(duì)3 個(gè)基因的外顯子區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)：GENE1的第2 個(gè)外顯子區(qū)與GENE2的第2 個(gè)外顯子區(qū)、GENE3的第1 個(gè)外顯子區(qū)序列高度同源；GENE1的第3 個(gè)外顯子區(qū)與GENE2的第3 個(gè)外顯子區(qū)、GENE3的第2 個(gè)外顯子區(qū)序列高度同源(圖2)。因此，擬在3 個(gè)基因同源的兩個(gè)外顯子區(qū)段設(shè)計(jì)CRISPR-Cas9 的編輯靶點(diǎn)，達(dá)到同時(shí)編輯3 個(gè)基因的目的。

利用http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRI SPR 網(wǎng)站設(shè)計(jì)CRISPR-Cas9 編輯靶點(diǎn)。在3 個(gè)基因同源的兩個(gè)外顯子區(qū)分別設(shè)計(jì)能夠同時(shí)敲除3 個(gè)基因的兩個(gè)靶位點(diǎn)Target1 和Target2 (圖2)。

圖2 MtDWF7 串聯(lián)重復(fù)基因結(jié)構(gòu)及所選靶點(diǎn)位置Figure 2 Structure of MtDWF7 tandem repeat genes and the location of targets

1.4 表達(dá)載體構(gòu)建

1.4.1 靶點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

對(duì)選擇的兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在引物序列上添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，末尾加G，最終引物序列如下：

T1-F-Esp3Ⅰ：GATTGGCTTGAAGTATTCCATC AAGG

T1-R：AAAACCTTGATGGAATACTTCAAGCC

T2-F-BsaⅠ：GTACGGCATGAAGATATTTGTAA AGG

T2-R：AAAACCTTTACAAATATCTTCATGCCC

1.4.2 引物退火反應(yīng)合成雙鏈DNA

分別將合成的兩對(duì)引物通過退火反應(yīng)形成雙鏈DNA，反 應(yīng) 體 系 如 下：Primer-F (100 μmol·L-1)3 μL，Primer-R (100 μmol·L-1) 3 μL，10 × T4 Buffer 3 μL，T4 PNK 2 μL，ddH2O 19 μL。將PCR 管置于37 ℃下孵育90 min 后，加入4 μL 0.5 mol·L-1NaCl，煮沸 5 min，冷卻至室溫，用ddH2O 按照1 ∶ 500 稀釋。

1.4.3 pAH595/Target 1 入門載體的構(gòu)建

通過Golden Gate 技術(shù)將靶點(diǎn)1 (Target1)退火后的引物雙鏈DNA 產(chǎn)物插入載體pAH595 中的BsmBⅠ(Esp3Ⅰ)位點(diǎn)(圖3)，反應(yīng)體系如下：10 × T4 Buffer 2 μL，pAH595 Construct 1 μL，Primer/Target1 Annealing sequence 1 μL，Esp3I 1 μL，T4 Ligase 1 μL，ddH2O 14 μL。Golden Gate 循 環(huán) 反 應(yīng) 程 序：37 ℃下 反 應(yīng)5 min， 再于16 ℃條件下反應(yīng)10 min，經(jīng)過10 個(gè)循環(huán)后，在37 ℃條件下反應(yīng)15 min，之后在80 ℃條件下反應(yīng)5 min。 將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，壯觀霉素篩選。對(duì)插入靶點(diǎn)1 后的載體進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定引物U6-F1：AGAACAATAGTA TTTCTTATATAGG。

圖3 Target1 插入載體pAH595 中BsmBⅠ位點(diǎn)示意圖Figure 3 Schematic of Target1 BsmBⅠ site insertion vector pAH595

1.4.4 構(gòu)建pAH595/Target1/Target2 入門載體

將靶點(diǎn)2 (Target2)引物雙鏈DNA 插入pAH595/Target1 的BsaⅠ位點(diǎn)(圖4)。反應(yīng)體系如下：10 × T4 Buffer 2 μL，pAH595/Target1 Construct 1 μL，Primer/Target2 Annealing sequence 1 μL，BsaⅠ 1 μL，T4 Ligase 1 μL，ddH2O 14 μL。Golden Gate 循環(huán)反應(yīng)體系同上。對(duì)插入靶點(diǎn)2 后的載體進(jìn)行PCR 鑒定并測(cè)序，鑒定引物At7SL F1：CTATAATGGGACTCAAAATAAGG。

圖4 Target2 插入載體pAH595/Target 1 中的BsaⅠ位點(diǎn)示意圖Figure 4 Schematic of BsaⅠ site of Target2 inserted into vector pAH595/Target 1

1.4.5 pSC218GG-Cas9/Target1/Target2 目的表達(dá)載體的構(gòu)建

通過Gateway 多位點(diǎn)LR 克隆技術(shù)，將pAH595/Target 1/Target 2 載體和pNJB184-4 Cas9 載體重組到目的載體pSC218GG 中，LR 克隆反應(yīng)體系如下：

pNJB184-4-Cas9-Intron 1 μL，pAH595/Target1/Target2 Target 1 μL，pSC218GG 1 μL，LR recombinase 2 μL，TE buffer (pH 8.0) 5 μL。將反應(yīng)體系在室溫條件下孵育1 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞, Kana 抗生素篩選，PCR 鑒定并測(cè)序，構(gòu)建好的載體中同時(shí)含有靶點(diǎn)1 和靶點(diǎn)2 及Cas9 表達(dá)元件(圖5)。

圖5 目的載體pSC218GG-Cas9-Target1/Target2 的構(gòu)建示意圖Figure 5 Schematic of construction of target vector pSC218GG-Cas9- Target1/Target2

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌Arqual 1 中，保存轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的菌種用于毛根轉(zhuǎn)化。

1.5 蒺藜苜蓿毛根轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因毛根鑒定

1.5.1 蒺藜苜蓿種子的消毒處理和發(fā)芽

挑選飽滿的蒺藜苜蓿野生型A17 種子50 粒左右，用刀片在種皮表面輕輕劃一下產(chǎn)生劃痕后，放入50 mL 離心管中；在無(wú)菌超凈臺(tái)中加入30 mL 左右的30% 的次氯酸鈉(加0.1% Tween-20)溶液，水平搖床上輕輕晃動(dòng)5 min；倒掉溶液，用滅菌蒸餾水清洗種子5 次；離心管中加入無(wú)菌的去離子水30 mL，用錫箔紙包住避光，放在水平搖床上搖動(dòng)過夜；將種子放到帶有潤(rùn)濕滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上，放到冰箱中2～3 d 進(jìn)行發(fā)芽處理。

1.5.2 生根農(nóng)桿菌的侵染

取-80 ℃凍存的菌株pSC218GG-Cas9/Target1/Target2，接種到5 mL 含有MES 和乙酰丁香酮及相應(yīng)的抗生素(卡那霉素和鏈霉素，各100 mg·L-1)的液體培養(yǎng)基里，28 ℃振蕩培養(yǎng)2 d 后，取400 μL 菌液，均勻涂抹在含有MES 和乙酰丁香酮及相應(yīng)抗生素的固體平板培養(yǎng)基上；將平板放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2 天可以進(jìn)行侵染，一個(gè)平板可以接種100 棵植物左右；將發(fā)芽的種子取出，放在盛有去離子水的培養(yǎng)皿里(避免植物失水)，從距離根尖3 mm 的地方，用刀片輕輕切一刀，斜切出一個(gè)角度；將植物的傷口在培養(yǎng)好的生根農(nóng)桿菌上輕輕地裹一下，使農(nóng)桿菌均勻地布滿整個(gè)傷口處；將植物擺放在滅菌的低氮固體培養(yǎng)基上，低氮培養(yǎng)基配方如表1 所列，用封口膜將培養(yǎng)皿封好；將培養(yǎng)皿傾斜45°放置在培養(yǎng)架上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d 左右，可以清晰地看到毛根從傷口處長(zhǎng)出來；對(duì)長(zhǎng)出的毛根拍照，并取樣提取基因組DNA。

表1 低氮培養(yǎng)基配方表Table 1 Formula table of low nitrogen medium

1.5.3 轉(zhuǎn)基因毛根DNA 的提取

轉(zhuǎn)基因毛根DNA 的提取按照天根公司DNA 抽提試劑盒的說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作。DNA 提取后利用Nanodrop 檢測(cè)DNA 純度和濃度。

1.5.4 測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)和基因編輯效率

根據(jù)載體所帶Cas9 序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于檢測(cè)載體是否轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；在3 個(gè)基因的靶點(diǎn)附近分別設(shè)計(jì)引物，用于檢測(cè)是否發(fā)生基因編輯，引物序列如表2 所列。以提取到的毛根DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，若能夠擴(kuò)增出Cas9 序列即為轉(zhuǎn)基因毛根，將轉(zhuǎn)基因毛根靶位點(diǎn)引物的擴(kuò)增條帶切膠回收后送公司測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)基因編輯效率。

表2 轉(zhuǎn)基因毛根檢測(cè)所用引物Table 2 Primer sequences for transgenic hair roots detection

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及根毛轉(zhuǎn)化

采用1.4.2-1.4.5 的方法構(gòu)建表達(dá)載體，構(gòu)建成功的最終載體pSC218GG-Cas9/Target1/Target2 結(jié)構(gòu)示意圖(圖5)，Targrt1-gRNA 由AtU6 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，Target2-gRNA 由At7SL 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，將經(jīng)過PCR 檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證正確的載體轉(zhuǎn)入生根農(nóng)桿菌Arqual 1 中。用Target2-F 和Target1-R 作為引物，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株，電泳結(jié)果如圖6 所示，5 個(gè)單克隆均有明顯條帶，說明轉(zhuǎn)化成功。

圖6 pSC218GG-Cas9/target1/target2 在Arqual 1 菌株Figure 6 pSC218GG-Cas9/target1/target2 in Arqual 1 strains

以陽(yáng)性Arqual 1 農(nóng)桿菌為介體轉(zhuǎn)化蒺藜苜蓿野生型A17 毛根(圖7、圖8)。接種3 周后植物的根生長(zhǎng)明顯，可見植物生長(zhǎng)出的具有向地性的側(cè)根之間，生長(zhǎng)出了不具有向地性的毛根。

圖7 發(fā)芽種子于低氮培養(yǎng)基擺放圖Figure 7 Placement of germinated seeds in low nitrogen medium

圖8 接種后植物生根狀況Figure 8 Rooting status of plants after inoculation

2.2 基因編輯效率檢測(cè)

為了檢測(cè)生長(zhǎng)出的毛根是否為轉(zhuǎn)基因毛根以及轉(zhuǎn)基因毛根的基因編輯效率，首先以1.5.6 的方法提取毛根的DNA。本研究共提取得到了35 份毛根的DNA 樣本，編號(hào)為1～20、37～51，用Nanodrop 檢測(cè)DNA 純度和濃度。

選擇Cas9 基因引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，得到的35 份轉(zhuǎn)基因毛根，編號(hào)為1～20、37～51。電泳結(jié)果表明，除了4 號(hào)由于操作問題沒有明顯條帶以外，其余樣品均檢測(cè)出Cas9 基因的轉(zhuǎn)入(圖9)。4 號(hào)后又重新電泳檢測(cè)，得到結(jié)果也有明顯條帶。

圖9 Cas9 基因PCR 產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果圖Figure 9 Gel electrophoresis of Cas9 gene PCR products

對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的毛根樣品，分別用3 個(gè)基因的兩個(gè)靶點(diǎn)附近的引物(共6 對(duì))檢測(cè)是否發(fā)生基因編輯。以GENE1為例，GENE1的兩個(gè)靶點(diǎn)附近片段擴(kuò)增結(jié)果表明(圖10)，幾乎所有的樣品都檢測(cè)出了靶點(diǎn)附近片段。

圖10 GENE1 的靶點(diǎn)電泳鑒定結(jié)果Figure 10 Electrophoretic identification results of Gene1 targets

將PCR 產(chǎn)物送公司測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果確定是否發(fā)生基因編輯。在3 個(gè)基因的Target1 附近均檢測(cè)到若干份轉(zhuǎn)基因毛根樣品的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)重疊峰，即發(fā)生了基因編輯。其中轉(zhuǎn)基因毛根1、2、3、4 樣品的GENE1-Target1 處發(fā)生編輯；轉(zhuǎn)基因毛根1、2 在GENE3-Target1 處發(fā)生編輯。轉(zhuǎn)基因毛根1、2 樣品在3 個(gè)基因的Target1 處同時(shí)發(fā)生編輯。但是在3 個(gè)基因的Target2 附近，所有轉(zhuǎn)基因毛根樣品的測(cè)序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)類似Target1 處的重疊峰，即沒有基因編輯發(fā)生(圖11、圖12)。

圖11 Target1 測(cè)序結(jié)果Figure 11 Target1 sequencing results

圖12 Target2 測(cè)序結(jié)果Figure 12 Target2 sequencing results

3 討論與展望

CRISPR-Cas9 技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)，目前已經(jīng)在微生物、動(dòng)物和植物中獲得了廣泛應(yīng)用。本研究利用CRISPR-Cas9 技術(shù)，針對(duì)蒺藜苜?；蚪M中3 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因DWF7設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)化的毛根中實(shí)現(xiàn)了對(duì)3 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因的同時(shí)編輯。

根據(jù)串聯(lián)重復(fù)基因高度同源的特點(diǎn)，尤其是外顯子編碼區(qū)含有堿基序列相同的片段。本研究通過序列比對(duì)在3 個(gè)基因同源的兩個(gè)外顯子中選取了兩處靶位點(diǎn)。雖然本研究設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)是針對(duì)相同基因，但是兩個(gè)靶點(diǎn)的基因編輯效率存在差異。在對(duì)得到的35 份轉(zhuǎn)基因毛根樣品的測(cè)序分析中，有4 份樣品的GENE1-Target1 處發(fā)生編輯，有2 份樣品的GENE2-Target1 處發(fā)生編輯，有12 份樣品的GENE3-Target1 處發(fā)生編輯，3 個(gè)基因在靶點(diǎn)1 (Target1)處的編輯率分別為44.43%、5.71%和34.29%，3 個(gè)基因在靶點(diǎn)1 (Target1)處同時(shí)發(fā)生編輯的概率為5.71%。然而所有樣品都未檢測(cè)到在靶點(diǎn)2 (Target2)處發(fā)生基因編輯，分析其原因可能是因?yàn)闃颖玖坎粔虼螅以赥arget2 處編輯效率較低。

在PCR 擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近片段時(shí)，出現(xiàn)個(gè)別樣品未擴(kuò)增出片段的情況。因?yàn)镃RISPR-Cas9 系統(tǒng)基因編輯后產(chǎn)生的突變情況較為復(fù)雜，導(dǎo)致PCR 反應(yīng)不成功，這其中可能也有發(fā)生了基因編輯的樣品，所以實(shí)際發(fā)生基因編輯的概率可能更高。

本研究針對(duì)蒺藜苜蓿DWF7基因，通過CRISPRCas9 系統(tǒng)，利用串聯(lián)重復(fù)基因高度同源的特點(diǎn)，在3 個(gè)基因外顯子中的同源區(qū)段設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，在毛根中實(shí)現(xiàn)了對(duì)3 個(gè)基因的同時(shí)編輯，證明了本研究設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)可同時(shí)編輯3 個(gè)基因，為串聯(lián)重復(fù)基因的功能研究提供了新的思路。通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化獲得的蒺藜苜蓿dwf7突變體植株是否具有擬南芥突變體的相似表型，以及DWF7串聯(lián)重復(fù)基因在蒺藜苜蓿中的基因功能與擬南芥中的單基因是否保守，還有待進(jìn)一步研究。