劉永紅，毛維興，陳瑞蓮，馬耀杰，張樹武，徐秉良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室, 甘肅 蘭州 730070）

禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)自1908 年在英國首次發(fā)現(xiàn)后，目前已在印度、中國和澳大利亞等40 多個國家均有發(fā)生[1]。據(jù)估計，全世界每年因禾谷孢囊線蟲病造成的經(jīng)濟損失達數(shù)百億美元[2]。我國華北、華中、華東和西北地區(qū)16 個省(市)小麥(Triticum aestivum)產(chǎn)區(qū)均有禾谷孢囊線蟲病發(fā)生，危害小麥面積約400 萬hm2[3]。已有研究表明，禾谷孢囊線蟲除危害小麥、大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avena sativa)和青稞(Hordeum vulgare)外[4]，還對禾本科牧草黑麥草(Lolium perenne)、鵝觀草(Roegneria kanoji)、葦狀羊茅(Festuca elatior)、球莖草蘆(Phalaris tuberosa)和鴨茅(Dactylis glomerata)具有危害[5]。特別是禾本科牧草作為禾谷孢囊線蟲的中間寄主或橋梁寄主存在于麥類作物田間，使得在農(nóng)牧交錯帶對禾谷孢囊線蟲的防治提出了更高的要求[6]。目前，盡管化學殺線劑在防治禾谷孢囊線蟲方面取得了良好的效果，但存在對人畜有害、污染環(huán)境以及影響土壤中有益微生物等缺陷[7]。因此，生物防治禾谷孢囊線蟲受到了人們的廣泛關注[8]。

木霉菌(Trichodermaspp.) 作為重要的農(nóng)業(yè)微生物資源，不僅在植物病原菌和植物寄生線蟲的生物防治中發(fā)揮重要的作用，而且還在促進植物生長、誘導植物產(chǎn)生抗病性等方面具有顯著的效果[9]。古麗君等[10]研究發(fā)現(xiàn)，長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)孢子懸浮液對6 種牧草種子的發(fā)芽率，幼苗根長、芽長及干重均有明顯的促進作用且能夠誘導和提高其抗性。章武等[11]研究發(fā)現(xiàn)4 株木霉菌對14 種草坪草病原菌具有不同程度的抑制效果，最高抑制效果可達100%，表明木霉菌在牧草病害防治中具有重要作用。

植物寄生線蟲體壁是由真皮層分泌產(chǎn)生的非細胞結(jié)構(gòu)，由角蛋白、膠原蛋白和纖維類反向交聯(lián)組成，主要成分是蛋白質(zhì)；線蟲的卵殼由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)層組成，其主要成分是幾丁質(zhì)；體壁和卵殼是線蟲阻止生防真菌侵染的重要屏障。因此，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等水解酶類在真菌毒殺線蟲過程中發(fā)揮著重要作用[12]。有研究表明，深綠木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T. harzianum)發(fā)酵濾液均能顯著降低南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)卵孵化率，對2 齡幼蟲具有較高的致死作用，同時其發(fā)酵液對線蟲卵和幼蟲體壁有消解作用[13]。另外，木霉菌不僅可以寄生線蟲卵和幼蟲，而且可以產(chǎn)生大量具有殺線活性的胞外酶，主要有絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等，對植物寄生線蟲有較好毒殺效果[14]。Sharon 等[15]報道哈茨木霉菌高效表達絲氨酸蛋白酶基因prb1的轉(zhuǎn)化子對南方根結(jié)線蟲(M. incognita)毒殺效果有增強作用，表明蛋白酶是木霉菌防治植物線蟲過程中的毒力因子。Chen 等[16]從擬康氏木霉(T. pseudokoningii) SMF2中分離到1 個線蟲體壁降解絲氨酸蛋白酶SprT，該酶可以抑制根結(jié)線蟲卵的孵化并且對2 齡幼蟲也具有較高的致死率。目前關于蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等水解酶類對植物寄生性線蟲的防治機制及殺線活性已有相關研究。然而，有關木霉殺線蛋白穩(wěn)定性研究鮮有報道。

前期植物病毒學和分子生物學課題組研究發(fā)現(xiàn)，長枝木霉T6 菌株孢子懸浮液不僅對小麥[17]和多種禾本科牧草具有促生作用[10]，而且還可使禾谷孢囊線蟲孢囊、卵和2 齡幼蟲體壁降解，嚴重抑制孢囊和卵的孵化，導致2 齡幼蟲死亡[8]，但有關其胞外蛋白酶對2 齡幼蟲致死活性，以及其胞外蛋白酶在運輸、儲藏、保存和施用過程中是否會受到外界環(huán)境條件(高溫、過酸過堿、金屬離子和氧化還原劑等)的干擾等方面仍尚不清楚。鑒于此，本試驗以提取的PT6 蛋白培養(yǎng)濾液和禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲作為研究對象，通過評價不同條件處理下PT6 蛋白培養(yǎng)濾液對禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲的致死活性，以期明確PT6 蛋白培養(yǎng)濾液的殺線穩(wěn)定性，為殺線蛋白制劑能夠應用于生產(chǎn)實踐提供一定的理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蛋白濾液：PT6 蛋白培養(yǎng)濾液提取和保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病毒學和分子生物學實驗室。

供試線蟲：由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病毒學和分子生物學實驗室提供。

供試藥品：酪蛋白、幾丁質(zhì)、葡萄糖、甘露醇和卵黃蛋白等為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲分離

參考張樹武等[8]方法。采用“漂浮法”分離孢囊。將孢囊收集后消毒處理置于線蟲分離器內(nèi)，低溫(4 ℃) 刺激1 個月，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 周左右(15 ℃) 獲得禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲。最后收集2 齡線蟲經(jīng)無菌水配制成200 條·mL-1的線蟲懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pH 對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性影響

pH 用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)，分別將PT6 蛋白培養(yǎng)濾液pH 調(diào)為2、4、6、8、10 和12，并置于4 ℃下靜置24 h 后重新調(diào)至中性。然后測定其殺線活性，并以原始PT6 蛋白培養(yǎng)濾液(pH 為7)作為對照，每個處理和對照均重復3 次。殺線活性測定參考張樹武等[8]方法。利用96 孔細胞培養(yǎng)板進行試驗，在處理和對照孔加入10 μL 線蟲懸浮液和90 μL PT6 蛋白培養(yǎng)濾液，每個處理和對照均為16 個重復。然后，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，統(tǒng)計24、48、72 h 處理后線蟲死亡數(shù)并計算其死亡率。

1.2.3 溫度對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性影響

將提取保存的PT6 蛋白培養(yǎng)濾液分別置于30、40、50、60、70、80、90 和100 ℃恒溫水浴鍋處理30 min，然后置于冰上使其迅速冷卻，試驗以未經(jīng)處理的PT6 蛋白培養(yǎng)濾液為對照，3 次重復。室溫冷卻后參考 1.2.2 方法測定其殺線活性。

1.2.4 金屬離子對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性影響

利 用 無 菌 水 配 制0.1 mol·L-1的K+、Na+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+離子溶液，并分別與PT6 蛋白培養(yǎng)濾液按1 ∶ 9 的體積比混合，以單一PT6 培養(yǎng)濾液作為對照，每個處理和對照均重復3 次。待充分混合后，分別置于4 ℃下放置24 h 后參考1.2.2 方法測定其殺線活性。

1.2.5 氧化還原劑對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性影響

氧化劑和還原劑溶液使用雙氧水與亞硫酸鈉配置，氧化劑和還原劑濃度配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.1 mol·L-1。然后將不同濃度氧化劑和還原劑分別與PT6 蛋白培養(yǎng)濾液按1 ∶ 9 體積比混合。待充分混合后，4 ℃靜置24 h 后參考1.2.2 方法測定其殺線活性。以未添加氧化劑和還原劑的培養(yǎng)濾液作為對照，每個處理和對照均重復3 次。

1.2.6 PT6 蛋白培養(yǎng)濾液儲藏穩(wěn)定性測定

將提取的PT6 蛋白培養(yǎng)濾液 (50 mL) 置于無菌三角瓶并室溫下避光保存，并分別于保存10、30、60、90 d 后參照1.2.2 方法測定其殺線活性。試驗以新制備的PT6 蛋白培養(yǎng)濾液作為對照，每個對照和處理均重復3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并作圖，SPSS 19.0 軟件進行方差分析和Duncan 新復極差法用以多重比較(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 和溫度對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響

在pH 4～10 時，72 h 線蟲死亡率均在80%以上，與對照相比無顯著差異(P＞ 0.05)。pH 超過10時，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性開始降低。pH 為2時，72 h 線蟲死亡率為69.10%；pH 為12 時，72 h 線蟲死亡率僅為66.55%，均顯著低于對照(P＜ 0.05) (圖1)。

圖1 pH 對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 1 Effect of pH on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

溫度在30～60 ℃時，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液對禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲毒殺作用和對照相比無顯著差異(P＞ 0.05)。當溫度超過60 ℃，其對線蟲殺線活性開始降低。與對照相比，70～100 ℃溫度下線蟲死亡率顯著降低(P＜ 0.05)。溫度為100 ℃時，24、48、72 h 線蟲死亡率僅為17.50%、24.64%和28.51% (圖2)。

圖2 溫度對 PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 2 Effect of temperature on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

2.2 金屬離子和氧化還原劑對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響

不同金屬離子對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性影響不同，Zn2+和K+對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性具有明顯的增強作用(圖3)。與對照相比，Zn2+和K+處理線蟲48、72 h 后線蟲死亡率顯著提高(P＜ 0.05)，72 h其處理線蟲死亡率高達91.45%和91.28%，而Cu2+對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性具有顯著抑制作用(P＜0.05)，處理72 h 時線蟲死亡率僅49.36%；Fe3+、Mg2+、Mn2+和Na+處理48 h 和72 h 對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性與對照比無顯著影響(P＞ 0.05)，處理72 h后線蟲死亡率分別為80.62%、82.03%、81.26%和82.68%，具有良好穩(wěn)定性。

圖3 金屬離子對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 3 Effect of metal ions on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

較高濃度氧化劑可使PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性降低，而較低濃度氧化劑對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性無顯著影響(P＞ 0.05) (圖4)。氧化劑濃度低于0.10 mol·L-1時，線蟲死亡率與對照相比差異不顯著(P＞ 0.05)；氧化劑濃度為0.10 mol·L-1時，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性顯著降低(P＜ 0.05)，24、48 和72 h處理后，線蟲死亡率分別為41.37%、53.42%和64.29%。

圖4 氧化劑對 PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 4 Effect of oxidant on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

與對照相比，當還原劑濃度較低時對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性無顯著影響(P＞ 0.05)，而還原劑濃度較高時會使PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性顯著降低(P＜ 0.05) (圖5)。當還原劑濃度低于0.08 mol·L-1時，線蟲死亡率與對照均無顯著差異(P＞ 0.05)；當還原劑濃度為0.08 和0.10 mol·L-1時，線蟲72 h 死亡率顯著低于對照(P＜ 0.05)，72 h 后死亡率分別為74.62%和72.96%。

圖5 還原劑對 PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 5 Effect of reducing agent on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

2.3 儲藏時期對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響

與對照相比，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液儲藏時期為10～60 d 時，對蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性無顯著影響(P＞ 0.05)，72 h 死亡率都在80%以上。但在處理90 d時，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液處理線蟲48 和72 h 死亡率均顯著低于對照(P＜ 0.05)，分別為64.81% 和77.24%(圖6)。

圖6 儲藏時期對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性的影響Figure 6 Effect of storage time on the nematicidal activity of PT6 protein culture filtrate

3 討論與結(jié)論

Hran 等[18]發(fā)現(xiàn)木霉菌的殺線活性蛋白易受外界環(huán)境條件的干擾，常具有不穩(wěn)定性。本研究表明長枝木霉PT6 蛋白培養(yǎng)濾液對禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲具有較強的致死作用，當pH 4～10，溫度30～60 ℃，0.1 mol·L-1的Fe3+、Mg2+、Mn2+和Na+，氧化劑濃度低于0.1 mol·L-1、還 原 劑 低 于0.08 mol·L-1時，PT6 蛋白培養(yǎng)濾液對其殺線活性無顯著影響，并且儲藏0～60 d 均具有良好的穩(wěn)定性，Zn2+和K+對其殺線活性還具有一定的增效作用。同時，本研究也表明，長枝木霉PT6 蛋白培養(yǎng)濾液pH 8、溫度30 ℃、0.1 mol·L-1Zn2+處理后對禾谷孢囊線蟲的毒殺效果最好。

胞外蛋白的溫度和酸堿穩(wěn)定性對于其商業(yè)應用有重要的作用[19]。張曉云等[20]研究表明，枯草芽孢桿菌CAB-1 抑菌蛋白在100 ℃下處理30 min 活性變化差異不顯著，而121 ℃處理30 min 對番茄灰霉病菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)抑菌活性與對照相比下降了72%，在pH 3～12 時抑菌活性均大于75%。本研究結(jié)果表明，長枝木霉PT6 蛋白培養(yǎng)濾液在pH 4～10、溫度30～60 ℃時對禾谷孢囊線蟲2 齡幼蟲均有較高的毒殺作用，但過酸過堿和高溫條件會使其殺線活性降低，這可能是因為蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，導致蛋白變性、鈍化失活。Dunaevsky 等[21]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉分泌的胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶在pH 6.0～11.0、溫度45～50 ℃保持初始酶活性不變；Aissaoui 等[22]從哈茨木霉中分離純化的絲氨酸蛋白酶在pH 5.0～10.0 均能保持初始酶活性的62%以上，在溫度30～50 ℃仍具有超過85%的剩余酶活性，與本研究結(jié)果較為相似。金屬離子也是影響蛋白酶活性的因素之一，胡燕梅等[23]研究表明Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+等對盾殼霉幾丁質(zhì)酶活性有激活作用，而Zn2+和Cu2+卻對盾殼霉幾丁質(zhì)酶活性發(fā)揮有抑制作用。本研究表明Zn2+和K+對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液的殺線活性有促進作用和Cu2+對蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性具有抑制作用，Mg2+、Fe3+、Mn2+、Na+對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線活性無顯著影響，其原因可能是與殺線蛋白結(jié)合的特殊受體也能與某些金屬離子相結(jié)合，而金屬離子和受體結(jié)合會減少受體與殺線蛋白的結(jié)合，最終影響殺線蛋白的殺線活性。吳曉冰等[24]發(fā)現(xiàn)綠色木霉(T. viride) T-YY 菌株黃色素對較高濃度的氧化劑可以適應，但對還原劑的穩(wěn)定性較差，而本研究發(fā)現(xiàn)蛋白培養(yǎng)濾液在較低濃度的氧化還原劑脅迫下具有良好的殺線穩(wěn)定性，但隨著濃度增加其穩(wěn)定性降低。褚福紅和于新[25]研究結(jié)果表明氧化劑、還原劑在一定濃度范圍內(nèi)，綠色木霉代謝物對芒果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporiodes)抑菌活性影響不顯著，與本研究結(jié)果基本一致。張建華等[26]通過對長枝木霉T6 菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究表明，當發(fā)酵液在4 ℃和25 ℃環(huán)境下放置60 d，其抑菌活性和對照相比無顯著差異，與本研究結(jié)果基本一致，說明PT6 蛋白濾液具有較好的儲藏穩(wěn)定性。

本研究表明，長枝木霉PT6 蛋白培養(yǎng)濾液具有較好的穩(wěn)定性，如耐酸堿、高溫，對金屬離子不敏感，儲藏效果良好等特性，但關于其他因素對PT6 蛋白培養(yǎng)濾液殺線穩(wěn)定性的影響及不同環(huán)境因子影響PT6 蛋白培養(yǎng)濾液穩(wěn)定性機制還有待進一步研究。