何 冰，潘浩漢，吳建陽，羅 威，武愛龍*

（1.湛江幼兒師范?？茖W(xué)校，廣東湛江 524037；2.嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院，廣東湛江 524037）

洋紅風(fēng)鈴木（Tabebuia rosea），又稱為巴拉圭風(fēng)鈴木等，為紫葳科風(fēng)鈴木屬植物，廣泛分布于墨西哥、巴西、巴拉圭、玻利維亞等美洲地區(qū)。其花冠呈漏斗狀，又似風(fēng)鈴狀，開花季節(jié)花團(tuán)錦簇，色彩鮮艷，具有獨特風(fēng)韻以及優(yōu)良的景觀效果[1-2]。目前，由于風(fēng)鈴木作為國內(nèi)剛引進(jìn)的園林樹種，研究比較少，其中針對黃花風(fēng)鈴木的研究又占到很大部分[3-6]，對于洋紅風(fēng)鈴木的研究非常少，都是和其他風(fēng)鈴木品種一起從種質(zhì)資源形態(tài)與分子鑒定[7]、開花性狀與觀賞價值[8]、開發(fā)利用前景[9]、品種生長適應(yīng)性[10]等方面研究，國內(nèi)外還沒有單獨對其進(jìn)行研究。目前洋紅風(fēng)鈴木已在華南地區(qū)廣泛種植，主要用于行道樹、庭院樹以及生態(tài)景觀林帶營建。該研究以洋紅風(fēng)鈴木種子為外植體，研究不同激素濃度（6-BA、IBA、NAA、IAA、GA3）對洋紅風(fēng)鈴木初始培養(yǎng)、芽的分化影響，并基于單因素的預(yù)試驗基礎(chǔ)上，建立洋紅風(fēng)鈴木植株的不定芽誘導(dǎo)體系，并利用單因素法、響應(yīng)面法對其誘導(dǎo)出芽的情況進(jìn)行優(yōu)化，以期為洋紅風(fēng)鈴木的種苗繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。供試洋紅風(fēng)鈴木種子于2019年2月采自于嶺南師范學(xué)院樹人廣場，其位于廣東省粵西地區(qū)，屬于熱帶亞熱帶氣候，并受海洋氣候調(diào)節(jié)，全年氣候整體良好。采集方式待莢果成熟，呈黑褐色，未開裂之前采集種子。

1.1.2 外植體滅菌。在超凈工作臺上，先用75%的酒精擦拭消毒洋紅風(fēng)鈴木莢果外殼，隨后剝?nèi)デv果外層，取出其種子，再用75%的酒精消毒浸泡1 min，用無菌水沖洗3次，然后再放入0.2%的升汞（加幾滴吐溫-20）中浸泡消毒1 min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液后，用無菌水沖洗6次備用。

1.2 方法

1.2.1 接種。將消毒洗凈后的洋紅風(fēng)鈴木種子放在無菌超凈臺上30 min，等種子表面水分晾干后，將其接種到初始培養(yǎng)基中。

1.2.2 初始培養(yǎng)基的篩選。①單因素試驗設(shè)計，選用MS作為基本培養(yǎng)基，將6-BA、GA3分別設(shè)置5個濃度梯度：6-BA（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）；GA3（0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）。將種子分別接種到初始培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶接種1粒種子，每個處理接種30瓶，3次重復(fù)，30 d后，統(tǒng)計各處理的出芽情況。②響應(yīng)面（RSM）試驗設(shè)計，在單因素預(yù)試驗基礎(chǔ)上，得到初始培養(yǎng)2種激素6-BA、GA3有效的濃度范圍，根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計原理，以發(fā)芽率為響應(yīng)值，確定初始培養(yǎng)中激素組合的最佳配比，共13個處理（表1）。將洋紅風(fēng)鈴木種子接種到不同初始培養(yǎng)基中進(jìn)行種子發(fā)芽處理，每瓶接種1粒種子，每個處理接種30瓶，3次重復(fù)，30 d后，統(tǒng)計各處理的發(fā)芽情況，進(jìn)而探討最佳初始培養(yǎng)基。

表1 洋紅風(fēng)鈴木初始培養(yǎng)基試驗設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推測出最佳組合配方并進(jìn)行實際試驗驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

將消毒后的種子接種到初始培養(yǎng)基中，30 d后觀察發(fā)芽情況（表2）。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，洋紅風(fēng)鈴木種子在有激素添加的情況下，出芽率明顯提高。不同的初始培養(yǎng)基由于添加的激素種類以及濃度不一致，其出芽率也有很大差異，其中在添加6-BA的激素中，出芽率最高的是A3處理，出芽率均值達(dá)到59.85%，芽的長勢較好。隨著6-BA激素濃度達(dá)到0.8 mg/L時，出芽率反而降低，芽苗出現(xiàn)玻璃化、纖細(xì)現(xiàn)象；在添加GA3的激素中，出芽率均值最高的是B2處理。隨著GA3激素濃度達(dá)到0.4 mg/L時其出芽率反而降低，畸形芽變多。綜上，洋紅風(fēng)鈴木種子出芽處理中，添加6-BA激素的處理要略高于添加GA3激素的處理，同時初始培養(yǎng)基激素添加范圍建議6-BA為0.2～0.6 mg/L，GA3為0～0.2 mg/L。

表2 單因素試驗結(jié)果

2.2 激素組合對洋紅風(fēng)鈴木出芽率的影響

在無菌超凈臺上將消毒滅菌后的種子接種到初始培養(yǎng)基中，30 d開始統(tǒng)計不定芽的出芽率。從表3可以看出，13組組合都可發(fā)芽，不同組合的出芽率存在較大差異，出芽率的范圍在34.31%～91.83%，其中第4組組合出芽率最高，第9組組合出芽率最低。

表3 洋紅風(fēng)鈴木出芽率響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3 出芽率回歸方程分析

以培養(yǎng)基中6-BA（A）、GA3（B）為自變量因素，洋紅風(fēng)鈴木種子播種出芽的出芽率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)試驗結(jié)果（表4）得到回歸方程為：Y=78.48-19.40×A-4.26×B-4.30A×B-8.36A2-9.78B2，該回歸方程有極顯著性（P＜0.000 1）；方程失擬不顯著（F=1.95，P＞0.1），由此可以看出，該回歸方程擬合性好，可以用于洋紅風(fēng)鈴木種子出芽率的理論預(yù)測。模型的變異系數(shù)為4.28%（＜10%），表明模型試驗良好，穩(wěn)定性不錯。從表4可以看出，A、B、A2達(dá)到差異極顯著（P＜0.01），AB達(dá)到差異顯著（P＜0.05）。表明激素6-BA濃度、GA3濃度對洋紅風(fēng)鈴木出芽率著極顯著影響，6-BA濃度與GA3濃度的交互作用對結(jié)果差異不顯著。通過回歸方程得到最優(yōu)出芽的培養(yǎng)基的6-BA、GA3濃度分別為：A=0.4 mg/L，B=0.1 mg/L。

表4 響應(yīng)面回歸方程分析

2.4 響應(yīng)值和等高線分析

從圖1可以看出，6-BA以及GA3交互作用顯著，其中，6-BA濃度對出芽率的影響最大。因此，可知洋紅風(fēng)鈴木種子對于初始培養(yǎng)基中6-BA激素濃度的變化很敏感。

圖1 6-BA、GA3濃度對洋紅風(fēng)鈴木出芽率影響的響應(yīng)面和等高線

2.5 最佳激素濃度配比及驗證

通過二次回歸方程的分析可得出洋紅風(fēng)鈴木誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最優(yōu)條件為：A=0.4 mg/L，B=0.1 mg/L，最佳出芽率預(yù)測值為88.48%。根據(jù)回歸方程推測出的最佳激素配比MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3，并在此條件下，進(jìn)行驗證，重復(fù)3次，實測發(fā)芽率為87.68%、89.12%和88.82%，平均發(fā)芽率為88.54%。試驗發(fā)芽率測定值與理論預(yù)測值的誤差為1%（＜5%），因此，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化測定條件是可行的。

3 討論

響應(yīng)面分析法是一種可以減少試驗次數(shù)、使用方便、回歸預(yù)測性好的優(yōu)化分析方法。在植物組培試驗中，最常用的試驗方法是正交試驗設(shè)計，但是正交試驗方法只是對一個個孤立的試驗進(jìn)行分析，無法找到各個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。牟會榮、蔡厚道等[17-18]利用以上2種試驗設(shè)計方法進(jìn)行試驗設(shè)計與研究，均發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法優(yōu)于正交法。關(guān)于洋紅風(fēng)鈴木植株再生體系的建立與優(yōu)化的研究還未見報道，由于再生體系流程要經(jīng)過誘導(dǎo)、增殖、生根的階段，要統(tǒng)計出芽率、增殖率、生根率，通過傳統(tǒng)的方法篩選最佳培養(yǎng)基非常不容易，要經(jīng)過大量的試驗，而通過利用響應(yīng)面法來優(yōu)化組織培養(yǎng)的條件，能夠迅速地達(dá)到組培苗木工廠化生產(chǎn)的目的，并且在已有植物組織培養(yǎng)研究中廣泛應(yīng)用[11-12]。

該研究從洋紅風(fēng)鈴木種子消毒滅菌處理、不定芽的分化，建立了洋紅風(fēng)鈴木不定芽誘導(dǎo)體系，同時以洋紅風(fēng)鈴木出芽率作為響應(yīng)值，結(jié)合CCD試驗設(shè)計回歸分析各處理之間的總體差異，得到的試驗結(jié)果再進(jìn)行驗證試驗，可以簡化組培流程，提高試驗的精確度，快速進(jìn)行工廠化的生產(chǎn)，滿足市場對種苗的需求。目前國內(nèi)外還沒有相關(guān)報道，具有獨創(chuàng)性的優(yōu)勢。因此，未來的研究可利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化植物組培流程，豐富組培試驗方法，促進(jìn)植物組織培養(yǎng)研究技術(shù)的進(jìn)步。