杜可欣 蔣一博 陳 軍 牟維林

(煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)日化有限公司，煙臺(tái) 264006)

近年來，隨著自由基學(xué)說迅速發(fā)展，衰老和多種疾病的發(fā)生已被證實(shí)與自由基的過量產(chǎn)生有密切關(guān)聯(lián)。因此，想到達(dá)延緩皮膚衰老的效果可從抑制自由基的產(chǎn)生與清除現(xiàn)有自由基兩方面進(jìn)行研究，傳統(tǒng)的抗氧化劑一般來源于化學(xué)合成，存在穩(wěn)定性差、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)，而來自植物的天然抗氧化劑具有安全無毒、穩(wěn)定性強(qiáng)、天然等優(yōu)勢更符合消費(fèi)者要求，有些得到了極大的開發(fā)利用。天然抗氧化劑的研究一方面可為行業(yè)提供更安全高效的選擇，另一方面也可為弘揚(yáng)中草藥植物成分貢獻(xiàn)一份力量。

超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)是一種金屬酶，廣泛分布在微生物、動(dòng)物和植物體內(nèi)。它能夠催化超氧陰離子自由基(O2-)歧化生成氧(O2)和過氧化氫(H2O2)，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到關(guān)鍵性作用，同時(shí)SOD作為機(jī)體中清除自由基的天然活性物質(zhì)，在機(jī)體的自我保護(hù)系統(tǒng)中也起到至關(guān)重要的作用。DPPH清除測定法于1958年被提出，至今被廣泛應(yīng)用于生物試樣與酚類等物質(zhì)抗氧化能力的定量測定中，測定原理是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處具有強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH單電子與自由基清除劑進(jìn)行配對，使其吸收逐漸消失，醇溶液顯色反應(yīng)開始減弱，顯色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。

虎杖作為一種重要的中藥材，被收錄于藥典中。因虎杖中含有黃酮類、酚類以及單糖類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效?；⒄忍崛∥?，主要由白藜蘆醇和大黃素組成，研究顯示白藜蘆醇和大黃素表現(xiàn)出廣泛的抗氧化特性。黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名山茶根，具有清熱燥濕，止血的功效，用藥歷史悠遠(yuǎn)，黃芩提取物、包括有黃芩苷、黃芩素等，研究表明黃芩及其有效成分具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等。紅景天生長在高海拔且極寒的地域，惡劣的環(huán)境造就了其超強(qiáng)的生命力，可作藥用，能夠補(bǔ)氣清肺，益智養(yǎng)心。紅景天根部的提取物主要成份為紅景天苷和甙元酪醇，具有增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)心腦血管及抗氧化的作用。甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，甘草以根及其根莖入藥，主要成分是三萜類和黃酮類還含有生物堿等。甘草除了補(bǔ)脾益氣、清熱解毒等功效，在護(hù)膚領(lǐng)域被大家熟知的是美白功效。本研究比較了虎杖、黃芩、紅景天及甘草的抗氧化作用，旨在為抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芩、虎杖、紅景天、甘草、葛根、瑪咖、青梅、松花粉、HaCaT細(xì)胞、DPPH細(xì)胞、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 樣品制備

1.2.1 原料前處理

表1 待檢樣品編碼與原料前處理方法

1.2.2 待檢樣品溶液制備

取經(jīng)過前處理好的1%濃度的待檢原料溶液40μl，加入到3960μl培養(yǎng)液中，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，得濃度為10μg/g待檢樣品。

1.3 試劑配制

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞裂解液的制備

37℃、5% CO2條件下，培養(yǎng)足夠數(shù)量的HaCaT細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整到5個(gè)/ml，接入6孔培養(yǎng)板中，每孔加入3ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)12h后，棄上清，加入上述檢測原料，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，每個(gè)樣品孔加入2ml的無血清培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，超聲探頭保持在液面以下，將細(xì)胞超聲破碎。功率為300W，冰水浴，每3～5s超聲1次，間隔4次(每次間隔時(shí)間30 s左右)。

1.3.2 SOD活性檢測試劑配制

①底物應(yīng)用液的配制：底物儲(chǔ)備液：緩沖液按1∶200的比例混勻配成底物應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配，2℃～8℃可保存7天。

②酶工作液的配制：酶儲(chǔ)備液：酶稀釋液按1∶10的比例混勻配成酶工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，2℃～8℃可保存3天。

1.3.3 DPPH抑制率檢測試劑配制

配制濃度為0.5mmol/ml的DPPH溶液：稱取2.958mg DPPH，用甲醇溶解并定容于15ml的容量瓶中，避光保存于0℃～4℃環(huán)境中。

2 檢測方法

2.1 SOD酶活性檢測

按照表2檢測程序?qū)?jīng)原料溶液處理過的細(xì)胞進(jìn)行SOD酶活性檢測。

表2 檢測程序列表

混勻，37℃孵育20min，波長450nm，酶標(biāo)儀測定吸光度值，參考波長630nm。

酶活力抑制率計(jì)算:在本反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)。按公式計(jì)算SOD的抑制率：

當(dāng)時(shí)，錢鐘書的鄰居林徽因女士也養(yǎng)貓，稱家里那只貓是他們一家“愛的焦點(diǎn)”。兩家的貓經(jīng)常打架，錢家的貓?zhí)?，常常受鄰居貓的“欺?fù)”。

SOD抑制率(%)=

抑制率越大，表明測定樣品的SOD酶活性越高。在本試劑盒測定原理中用抑制率代表SOD酶活性的變化，即抑制率代表樣品處理后細(xì)胞SOD酶活性提高的百分比，如果抑制率越高則表明原料對培養(yǎng)細(xì)胞SOD酶活性的促進(jìn)作用越強(qiáng)。

表2 DPPH的抑制率

2.2 DPPH抑制率檢測

①取樣品稀釋液2ml及濃度為0.5mmol/ml的DPPH溶液0.5ml，先后加入同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Ai。

②取0. 5ml 0.5mmol/ml的DPPH溶液與2ml甲醇混合，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Ao。

③取2ml樣品稀釋液與0.5ml甲醇混合，搖勻，在黑暗中37℃放置20min，以甲醇為空白在514nm測定其吸光度Aj。

樣品對DPPH的抑制率的計(jì)算:

抑制率(%)=[1-(Ai-Aj) /Ao]×100

3 結(jié)果與分析

3.1 各樣品對SOD酶活性的影響

表3 待檢原料對SOD酶活性的影響

圖1 使用超氧化物歧化酶(SOD)測定

樣品稀釋萬分之一后，使用酶標(biāo)儀，在波長450 nm時(shí)檢測其OD值。并且根據(jù)公式，與對照組相比，計(jì)算各樣品組的SOD抑制率。其中3號樣品抑制效果比較明顯，3號為虎杖的醇提物。該結(jié)果表明虎杖醇提物中具有能提高細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的成分，經(jīng)3號樣品處理后可使細(xì)胞內(nèi)酶活性提高20%左右，從而提高了細(xì)胞的抗氧化性能。另外樣品1-A號、樣品4號、5號及8-A號也顯示出一定的提高細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的能力。

所謂的自由基就是當(dāng)機(jī)體進(jìn)行代謝時(shí)，能奪去氧的一個(gè)電子，這樣這個(gè)氧原子就變成自由基。自由基很不穩(wěn)定，它要從組織細(xì)胞的分子中再奪取電子來使自己配對，當(dāng)細(xì)胞分子失去一個(gè)電子后，它也變成自由基，又要去奪取細(xì)胞膜或細(xì)胞核分子中的電子，這樣又會(huì)產(chǎn)生新的自由基。如超氧化物陰離子自由基、羥自由基、氫自由基和甲基自由基，等等。在細(xì)胞中由于自由基非常活潑，化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能。自由基對皮膚的損傷是一個(gè)重要的因素，對已生成的自由基進(jìn)行清除，就可以有效的減緩皮膚的衰老。

超氧化物歧化酶簡稱SOD，按其所含金屬輔基不同可分為三種，第一種是含銅、鋅金屬輔基的稱(Cu.Zn-SOD)，是最為常見的一種酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是含錳金屬輔基的稱(Mn-SOD)，呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵金屬輔基的稱(Fe-SOD)，呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。SOD是氧自由基的自然天敵，為自由基清除劑，廣泛存在于生物體的各種組織中，能清除自由基O2-(超氧陰離子自由基)。而O2-具有細(xì)胞毒性，可使脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰老。羥自由基在細(xì)胞中非?；顫?，化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能。自由基對皮膚的損傷是一個(gè)重要的因素，對已生成的自由基進(jìn)行清除，就可以有效地減緩皮膚的衰老。

3.2 各樣品對DPPH的抑制率的影響

用分光光度計(jì)在波長514nm時(shí)測定各樣品的Ao、Ai以及Aj的OD值，根據(jù)公式計(jì)算出樣品對DPPH的抑制率，用GraphPad軟件作圖2。各樣品都具有抑制DPPH自由基的作用，其中樣品5(葛根)、樣品7(青梅)、樣品1-B(黃芩水提液)的抑制作用比較明顯。

圖2 用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)檢測樣品對清除能力的影響

在皮膚衰老的過程中，自由基對皮膚的損傷是一個(gè)重要的因素。對已生成的自由基進(jìn)行清除，就可以有效地減緩皮膚衰老。DPPH 為1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，廣泛用于定量測定抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)的原理是根DPPH自由基有單電子，在514nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除的藥品存在時(shí)，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)在波長514nm檢測并進(jìn)行快速的定量分析。

4 結(jié)論

綜上所述，虎杖提取物具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的能力，可使細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性提高20%左右，黃芩、紅景天提取物也顯示出一定的提高SOD酶活性的能力，且各樣品均具有抑制DPPH自由基的作用，作為天然的抗氧化成分，在護(hù)膚品領(lǐng)域具有一定的開發(fā)潛力。