鄭方媛 吳 淵 梁媛媛 夏琪琪 周志南 劉鵬鵬

(浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江省市場監(jiān)管生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

近年來，口腔疾病已成為我國最為多發(fā)的常見病之一，涉及人群高達(dá)90%以上，菌群失調(diào)是引起口腔疾病的重要因素[1,2]。益生菌(Probiotics)對(duì)口腔健康的促進(jìn)及調(diào)節(jié)作用已有諸多研究論證[3-7]，在牙膏中添加益生菌或其功效成分，可以有效改善口腔菌群失調(diào)。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)是應(yīng)用最廣泛的益生菌之一，Elgamily等[8]實(shí)驗(yàn)證明L.rhamnosus抗菌性和再礦化潛力優(yōu)于多種生物活性多肽，推薦作為牙膏中的有效抗菌抑菌治療劑。

由于缺乏有效的牙膏中益生菌鑒定技術(shù)手段及監(jiān)管措施，益生菌牙膏市場存在產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的狀況，市售益生菌牙膏存在如益生菌標(biāo)識(shí)與實(shí)際使用菌株不一致等現(xiàn)象。在中國益生菌行業(yè)中，除了根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—乳酸菌檢驗(yàn)(GB4789.35-2016)》進(jìn)行活菌數(shù)的測定和《食品用益生菌通則》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)外，并無其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)用于益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)和經(jīng)營。而傳統(tǒng)表型鑒定方法在菌種檢測對(duì)象上受限，操作復(fù)雜，耗時(shí)長，迫切需要建立快速、可靠的牙膏益生菌種類鑒定方法。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域病菌檢測[9,10]。相對(duì)于傳統(tǒng)表型鑒定方法，穩(wěn)定性好、特異性好、靈敏度高。為適應(yīng)市場益生菌牙膏檢測技術(shù)開發(fā)需求，本研究基于PCR檢測技術(shù)，以添加了L.rhamnosus的牙膏為研究對(duì)象，以德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)等4種菌種為對(duì)照，以促旋酶基因gyrB為靶標(biāo)建立益生菌牙膏中L.rhamnosus成分的檢測技術(shù)并對(duì)其靈敏度和含量進(jìn)行檢測和評(píng)價(jià)，旨在為益生菌牙膏產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

實(shí)驗(yàn)用參考菌株：3株乳桿菌屬參考菌株(鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus，菌株編號(hào)：CICC6224、德氏乳桿菌L.delbrueckii，菌株編號(hào)：CICC6077、萊士曼氏乳桿菌Lactobacillus.leichmannii，菌株編號(hào)：ATCC7830)，2株非乳桿菌屬參考菌株(蠟樣芽孢桿菌Bacillus.cereus，菌株編號(hào)：CICC23828、動(dòng)物雙歧桿菌Bifidobacterium，菌株編號(hào)：ATCC7830)由中國工業(yè)微生物保藏管理中心提供。

乳桿菌屬以及動(dòng)物雙歧桿菌采用MRS瓊脂[11]平板劃線，厭氧培養(yǎng)，分離與純化；蠟樣芽孢桿菌采用營養(yǎng)瓊脂[12]平板劃線、分離與純化。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物(純化方法：PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis)、DL 2000DNA marker、瓊脂糖(Agarose Regular)、10×TBE緩沖溶液(Tris-EDTA)、1000×D-HelixRed核酸染料和雙蒸餾水(ddH2O)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2×PCR TaqMix 購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；MRS瓊脂和普通瓊脂平板培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Microfuge 16臺(tái)式微量離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；Nano-300超微量分光光度計(jì)，杭州奧盛儀器有限公司；D1200板式加熱器，美國Labnet’s公司；ABI Veriti 梯度PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Powerpac HC 1645052伯樂高流核酸電泳儀，美國Bio-Rad公司；Gel-Doc-XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

牙膏樣品A(L.rhamnosus濃度：0.01%)、B(濃度：0.03%)、C(濃度：0.05%)、D(濃度：0.10%)，各取1.0g加入10g無菌水于離心管中充分混勻，制成濃度10%的牙膏水溶液，取1.0mL牙膏水溶液加至1.5mL離心管中，10000rpm離心2min棄上清，收集沉淀，標(biāo)記-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用手冊(cè)提取A、B、C、D牙膏樣品菌種DNA。乳桿菌屬以及動(dòng)物雙歧桿菌接種于MRS瓊脂，37℃厭氧培養(yǎng)16～24h，蠟樣芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)16～24h，用50 μL ddH2O收集培養(yǎng)物，置于95℃板式加熱器內(nèi)裂解10min作為陽性和對(duì)照菌種DNA樣本。提取的DNA用超微量分光光度計(jì)檢測，并將其濃度調(diào)整為約20 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系及程序

參考楊小紅等[13]所用的L.rhamnosus特異性PCR引物組(rhaF，rhaR)，經(jīng)國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行同源性比對(duì)驗(yàn)證，該區(qū)段基因?yàn)長.rhamnosus促旋酶基因gyrB的一段序列，具有特異性。利用細(xì)菌通用編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的染色體基因16sr DNA引物序列組對(duì)提取的牙膏中添加的L.rhamnosus有效成分進(jìn)行擴(kuò)增測序。

以提取的牙膏中菌種DNA和參考菌株的基因組DNA為模板，利用rhaF，rhaR引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR體系見表1，使用梯度PCR儀擴(kuò)增，程序設(shè)置為：95℃ 5min，30個(gè)循環(huán)(95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10min，4℃保存。

核酸電泳檢測方法為在1%瓊脂糖凝膠上以120 V的電壓對(duì)7.0μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行30min電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄擴(kuò)增結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.3.4 PCR反應(yīng)特異性測試

用rhaF，rhaR引物組分別對(duì)菌株L.rhamnosus，CICC6224、 L.delbrueckii，CICC6077、L.leichmannii， ATCC783、B.cereus，CICC23828、Bifidobacterium，ATCC7830進(jìn)行擴(kuò)增，以等體積ddH2O為模板空白對(duì)照，以不含以上菌株的DNA作為陰性對(duì)照。所有DNA均使用ddH2O稀釋至1 ng·μL-1作為模板，反應(yīng)結(jié)束后分別取7.0μL擴(kuò)增產(chǎn)物利用核酸電泳進(jìn)行檢測。

1.3.5 對(duì)含不同濃度鼠李糖乳桿菌牙膏的PCR測試及測序

用rhaF，rhaR引物組分別對(duì)A(濃度：0.01%)、B(濃度：0.03%)、C(濃度：0.05%)、D(濃度：0.10%)4個(gè)牙膏提取的DNA(0.10 ng/μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以等體積L.rhamnosus，CICC6224陽性菌株的DNA為陽性對(duì)照，ddH2O為模板空白對(duì)照，以不含鼠李糖乳桿菌的DNA作為陰性對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

用細(xì)菌16S rDNA通用引物組(27F，1492R[14])對(duì)L.rhamnosus，CICC6224進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，所測16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的L.rhamnosus序列進(jìn)行BLAST比較。反應(yīng)體系(25μL)：2×Taq PCR MasterMix 10μL，引物16SrDNA F和16SrDNA R(100 μmol·L-1)各0.5 μL，模板DNA 2.0μL，加ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增程序：95℃ 5min，30個(gè)循環(huán)(95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 130s)，72℃ 10min，4℃保存。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序。

1.3.6 PCR反應(yīng)靈敏度測試

將L.rhamnosus濃度為0.05%的牙膏提取的DNA(20ng·μL-1)進(jìn)行梯度稀釋至DNA濃度為：1ng·μL-1、0.5ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.05ng·μL-1、0.01ng·μL-1，用rhaF，rhaR引物組分別對(duì)這5個(gè)濃度梯度DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以等體積L.rhamnosus，CICC6224陽性菌株的DNA為陽性對(duì)照，ddH2O為模板空白對(duì)照，以不含L.rhamnosus的DNA作為陰性對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)特異性測試結(jié)果

使用rhaF，rhaR引物組分別對(duì)5種菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果見圖1。以ddH2O為模板的空白對(duì)照以及陰性對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明反應(yīng)系統(tǒng)自身不發(fā)生擴(kuò)增；以L.rhamnosus DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物在電泳圖上顯示核酸條帶，條帶長度與理論長度376bp相符，以L.delbrueckii、L.leichmannii、B.cereus、Bifidobacterium DNA為模板的擴(kuò)增結(jié)果中無PCR特征條帶。說明以L.rhamnosus gyrB基因設(shè)計(jì)的特異性引物系統(tǒng)對(duì)L.rhamnosus DNA檢測具有良好的特異性。

2.2 對(duì)含不同濃度鼠李糖乳桿菌牙膏的PCR試驗(yàn)及測序結(jié)果

將含0.01%、0.03%、0.05%、0.10%四個(gè)濃度的L.rhamnosus牙膏提取的DNA(0.10ng·μL-1)用作PCR反應(yīng)的模板。電泳圖顯示條帶的亮度隨著L.rhamnosus濃度的增大而增強(qiáng)，且條帶長度與理論長度376 bp相符，空白及陰性對(duì)照均無條帶，陽性對(duì)照組顯示陽性(圖2)，說明擴(kuò)增有效，并且通過PCR反應(yīng)可以檢測到牙膏樣品中的L.rhamnosus，且根據(jù)條帶亮度可以判斷濃度范圍。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對(duì)照；1-5表示各種菌的DNA模板1：鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus，2：蠟樣芽孢桿菌B.cereus，3：德氏乳桿菌L.delbrueckii，4：萊士曼氏乳桿菌L.leichmannii，5：動(dòng)物雙歧桿菌Bifidobacterium。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照；1-4：不同濃度鼠李糖乳桿菌的牙膏提取DNA 1：0.01%，2：0.03%，3：0.05%，4：0.10%。

將含有L.rhamnosus濃度為0.10%的牙膏C提取的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的L.rhamnosus 序列進(jìn)行比較，結(jié)果均顯示與L.rhamnosus的序列一致性最高，說明牙膏中所添加的為L.rhamnosus的有效成分，含有L.rhamnosus DNA，并且建立的L.rhamnosus PCR體系能實(shí)現(xiàn)對(duì)牙膏中L.rhamnosus成分的有效檢測。

2.3 PCR反應(yīng)靈敏度測試結(jié)果

將含L.rhamnosus牙膏提取的DNA濃度稀釋為1ng·μL-1、0.5ng·μL-1、0.1ng·μ-11、0.05ng·μ-11、0.01ng·μ-11，并用作PCR反應(yīng)的模板。電泳圖在DNA濃度大于0.1ng·μ-11時(shí)顯示陽性結(jié)果(圖3)。在小于0.1ng·μ-11濃度下陽性較弱，結(jié)果判讀不可靠。因此對(duì)檢測牙膏中L.rhamnosus成分的PCR擴(kuò)增方法靈敏度為0.1ng·μ-11。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對(duì)照；P：陽性對(duì)照；1-5：DNA濃度 1：1ng·μ-11，2：0.5ng·μ-11，3：0.1ng·μ-11，4：0.05ng·μ-11，5：0.01ng·μ-11。

3 結(jié)論

益生菌牙膏產(chǎn)品的菌種組成與含量是產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，基于L.rhamnosus gyrB基因的PCR方法對(duì)L.rhamnosus菌株檢測具有良好的特異性，且能實(shí)現(xiàn)牙膏中L.rhamnosus菌株的精確鑒定，該方法靈敏度為0.1ng·μ-11，該檢測限和靈敏度可基本滿足需求。構(gòu)建適合益生菌產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的快速、精準(zhǔn)的菌株檢測技術(shù)已成為益生菌行業(yè)的重要研究方向，本研究為建立和完善牙膏益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考，有助于提升產(chǎn)品評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制及市場監(jiān)管水平。

由于試驗(yàn)樣品的限制，為適應(yīng)更廣的益生菌產(chǎn)品市場檢測應(yīng)用領(lǐng)域，該方法設(shè)計(jì)的益生菌牙膏產(chǎn)品的菌種特異性擴(kuò)增體系結(jié)合電泳的檢測方法對(duì)除本試驗(yàn)中的L.rhamnosus外的其他益生菌菌株(如副干酪乳桿菌、雙岐桿菌等)的特異性擴(kuò)增試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究與填充，且益生菌牙膏產(chǎn)品中菌株有效成分的微量/痕量的檢測還需進(jìn)一步穩(wěn)定性研究。