王偉 黃秋陽 羅書 鄭文武 馮健 葉強 鄭舒展

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科 四川 瀘州 646000；2.南充市中心醫(yī)院心血管內科 四川 南充 637000；3.四川省瀘州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站 四川 瀘州 646000)

大氣污染是全球性公共衛(wèi)生問題，特別是直徑小于或等于2.5微米的細顆粒物(Fine particulate matter,PM2.5)，是大氣中影響人類健康的主要物質。流行病學證據(jù)表明，PM2.5可增加心血管病的發(fā)病率和死亡率[1]，大氣PM2.5年平均暴露濃度每增加10 μg/m3，心血管疾病發(fā)病和死亡風險分別增加25%和16%[2]，可能與其促動脈粥樣硬化、破壞粥樣斑塊穩(wěn)定性相關[3]，但具體作用機制有待闡明。巨噬細胞是動脈粥樣硬化過程的主要效應細胞，其在粥樣斑塊中的聚集數(shù)量以及分泌炎癥因子是粥樣斑塊不穩(wěn)定的主要因素[4]。已有研究顯示PM2.5可直接進入循環(huán)系統(tǒng)，主要具有致炎效應，可被巨噬細胞的Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)識別[5]，活化NF-κB途徑引起炎癥因子[6-7]。然而，炎癥調控機制非常復雜，炎性小體以及活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在其中扮演的角色不得而知。炎性小體是胞內多蛋白復合體，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要分為NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族受體蛋白(包括不含PYD結構域的NLRC4)和非NLR家族受體蛋白AIM2等，其促進炎癥因子分泌在炎癥級聯(lián)反應中具有重要作用[8]。由于PM2.5復雜復合物的理化特性，相關炎性小體是否參與PM2.5的致炎作用研究甚少，推測PM2.5可能通過增加巨噬細胞TLR4的表達，進而通過激活細胞內炎癥小體的作用發(fā)揮促炎效應，影響巨噬細胞的凋亡，從而造成斑塊的不穩(wěn)定。另外，氧化應激在炎癥反應中的調控作用已被證實，因此本研究將重點探討多炎癥小體及ROS在PM2.5對巨噬細胞炎癥與凋亡作用中的具體影響，為闡明PM2.5在動脈粥樣硬化中的致病機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 PM2.5樣本采集于2020年3月～6月四川省瀘州市茜草園藝路(瀘州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站提供)；RAW264.7細胞株(中喬新舟)；ROS檢測試劑盒(碧云天)；ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、TLR4抑制劑TAK242(索萊寶)；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)；抗GAPDH、NLRC4 抗體(Abcam)；抗NLRP3抗體(CST)；抗NLRP1(Santa)；抗AIM2抗體(Proteintech)；抗Caspase1抗體(Affbiotech)；Western blot實驗相關試劑(ASPEN)；IL-1β、IL-18、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(ELK Biotechnology)；ROS活性氧誘導劑、ROS活性氧抑制劑(Bestbio)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5混懸液制備 將PM2.5樣本置于滅菌注射用水中，使用超聲清洗器洗脫、溶解、震蕩3次，每次持續(xù)40 min，將所得洗脫溶解液紗布過濾后取過濾液，12000 r/min下離心10 min，取沉淀物低溫冷凍干燥獲得PM2.5顆粒物，再將PM2.5顆粒超聲波震蕩溶于PBS溶液中，配成終濃度100 μg/mL溶液，高溫蒸汽滅菌后放置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，使用時用PBS稀釋至實驗所需濃度。

1.2.2 細胞處理 使用DMEM高糖培養(yǎng)基+5%FBS+1%青鏈霉素作為RAW264.7巨噬細胞完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當細胞貼壁長滿90%時進行傳代， PBS洗滌兩次后使用一次性細胞刮刀將細胞輕輕刮離瓶底，1000 r/min離心3 min，取沉淀吹散混勻重置后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組 首先確定PM2.5在不同濃度和時間下對細胞活性和凋亡的影響，PM2.5濃度梯度設為0、25、50、75和100 μg/mL；時間梯度上設6、12、18、24、36和48 h。再將細胞分成空白對照組、PM2.5組、PM2.5+TKA242組、PM2.5+ROS(-)組、PM2.5+ROS(+)組，其中空白對照組按1∶1加入等量PBS，PM2.5組加入PM2.5懸液，PM2.5+TKA242組加入PM2.5懸液和TLR4抑制劑TKA242(40 μmol/L)，PM2.5+ROS(-)組加入PM2.5懸液和ROS抑制劑(1∶500)，PM2.5+ROS(+)組加入PM2.5懸液和ROS激動劑(1∶1000)，培養(yǎng)適當時間。

1.2.4 CCK8細胞活性檢測 取對數(shù)期細胞接種在96孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，每組予以相應干預后再向每孔加入10μL的CCK-8溶液，再在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標儀測定在450 nm的吸光度。

1.2.5 細胞凋亡率檢測 向24孔板中加入PBS洗滌細胞，一次性細胞刮刀將細胞輕輕刮離瓶底，300 r/min離心10 min棄上清，按照ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書用Binding Buffer重懸2次并稀釋細胞至1×106個/mL，Annexin V-FITC避光染色10 min,然后PI避光孵育5 min，1 h內流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.6 ROS檢測 取各組處理好的細胞用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌后，按照ROS檢測試劑盒說明書加入10 μmol/L的DCFH-DA，37℃下孵育20 min，再用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，在488 nm波長下使用酶標儀檢測樣品吸光度。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 使用RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠分離后進行轉膜，5% 脫脂牛奶封閉膜，加入一抗[TLR4、NLRP1(1∶500); NLRP3、NLRC4、AIM2、Caspase-1(1∶1000)]，4℃?zhèn)葦[搖床上緩慢搖動孵育過夜，再加入二抗稀釋液室溫孵育2 h，用電化學發(fā)光液對蛋白印跡條帶進行顯影，使用AlphaEase-FC軟件分析目標條帶的灰度值。

1.2.8 ELISA檢測 取各組處理后的細胞培養(yǎng)上清液500 μL，4℃下3500 r/min離心10 min，取上清液，稀釋后按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-18、IL-10濃度，首先梯度稀釋標準品，以標準品濃度及對應OD值繪制標準曲線，然后檢測樣品并通過回歸方程計算樣本細胞因子濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得各組織樣本濃度。

2 結果

2.1 PM2.5抑制RAW264.7巨噬細胞活性 實驗證實PM2.5對RAW264.7巨噬細胞活性的影響呈時間、劑量依賴性，即暴露24 h后PM2.5的濃度越高RAW264.7細胞的活性越低(P<0.05),同時在相同的PM2.5濃度(50 μg/mL)作用下，細胞的活性隨著PM2.5作用時間的延長而降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同PM2.5濃度及干預時間對巨噬細胞活性的影響(n=4)

2.2 PM2.5促進巨噬細胞的凋亡 50 μg/mL的PM2.5刺激24 h后，PM2.5組較空白對照組有更高的凋亡率(P<0.05)，表明PM2.5可促進巨噬細胞的凋亡，而在PM2.5+TKA242組抑制TLR4、PM2.5+ROS(-)組抑制ROS后凋亡率低于PM2.5組(P<0.05)，而激活ROS的PM2.5+ROS(+)組凋亡率則比PM2.5組明顯上升(P<0.05)，提示PM2.5可能通過TLR4、ROS相關機制促進巨噬細胞凋亡。見圖2。

2.3 PM2.5增加多炎性小體的表達以及促炎因子釋放 Western blot 顯示PM2.5組相較于空白對照組檢測出NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達升高(P<0.05)，Caspase-1表達也明顯增高(P<0.05)，同時ELISA顯示PM2.5組相對于空白對照組促炎因子IL-1β、IL-18分泌增加(P<0.05)，而抑炎因子IL-10則減少(P<0.05)，提示PM2.5促進多炎性小體表達并促進炎性因子釋放。見圖3。

2.4 PM2.5通過TLR4激活多炎性小體促進炎性因子釋放 相對于空白對照組，PM2.5組檢測到TLR4的高表達 (P<0.05)，而使用TLR4抑制劑TKA242抑制TLR4后NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達較PM2.5組下降，Caspase-1表達也降低 (P<0.05)，ELISA顯示PM2.5+TKA242組較PM2.5組促炎因子IL-1β、IL-18的分泌減少(P<0.05)。見圖4。

圖2 各組RAW264.7巨噬細胞凋亡率變化(n=3)

圖3 PM2.5干預下炎性小體表達(A)以及細胞因子分泌(B)情況(n=3)

圖4 PM2.5通過TLR4激活多炎性小體(A)促進炎性因子釋放(B)(n=3)

2.5 ROS在PM2.5促巨噬細胞炎癥反應和凋亡的作用 PM2.5組ROS水平明顯高于空白對照組(P<0.05)，抑制TLR4后ROS水平較PM2.5組降低(P<0.05)(圖5)，提示PM2.5可通過TLR4促進ROS的生成。與PM2.5組比較，加入ROS抑制劑的PM2.5+ROS(-)組NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達下降，TLR4、Caspase-1表達降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-18的分泌也減少，而PM2.5+ROS(+)組加用ROS激動劑后則表現(xiàn)出相反的結果，見圖6。

圖5 各組巨噬細胞內ROS相對水平(n=3)

3 討論

當前大氣環(huán)境污染備受全球關注，其中PM2.5與人類疾病密切相關，臨床研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM2.5中會導致心肌梗死發(fā)生率上升[9]，動物實驗也提示暴露于PM2.5會損傷心肌、增加粥樣斑塊的易損性[10-11]，而在動脈粥樣硬化斑塊的形成和穩(wěn)定過程中巨噬細胞來源的泡沫細胞在血管壁的堆積至關重要[4]。PM2.5經(jīng)呼吸道通過肺毛細血管進入血液循環(huán)[12]，可改變循環(huán)系統(tǒng)的氧化應激狀態(tài)和炎性水平，引起系統(tǒng)性炎癥反應[13]。

炎性小體激活后調節(jié)caspase-1的活化，促使多種細胞因子產(chǎn)生，可刺激巨噬細胞分泌促炎因子和趨化因子，因而具有炎癥放大效應[14]。NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2是目前研究最多的炎性小體，在調節(jié)炎癥因子產(chǎn)生過程中具有獨立或者協(xié)同的作用[8]。其中，NLRP3的活化可造成粥樣斑塊的不穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)NLPR3可被PM2.5激活[15]，但是PM2.5成分復雜[16]，除了NLRP3，PM2.5能否激活其他炎性小體尚無相關研究。本實驗觀察到PM2.5作用于巨噬細胞后四種炎性小體表達均增加，caspase-1表達增高，促炎因子IL-1β、IL-18分泌增加，炎癥抑制因子IL-10減少，提示PM2.5可通過激活多種炎性小體從而促進巨噬細胞的炎癥效應，但是在此過程中是否存在激活多炎性小體的共同位點需要進一步研究。

圖6 ROS影響下各組炎性小體表達(A)以及細胞因子分泌(B)情況(n=3)

巨噬細胞凋亡貫穿于整個動脈粥樣硬化病理過程[16]，早期斑塊中巨噬細胞凋亡的增加利于抑制泡沫細胞形成，而晚期粥樣斑塊中巨噬細胞凋亡則會促使壞死核心形成[17]，并且觸發(fā)NLRP3活化加速動脈粥樣硬化發(fā)展[18]。本實驗觀察到PM2.5能夠促進巨噬細胞的凋亡。TLR4是識別病原體高度保守結構基序的主要受體，在AS的發(fā)生發(fā)展中的作用極其重要。同時，氧化損傷與炎癥反應都是引起內皮功能紊亂和促進動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的公認的重要因素[16]，研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可通過理化特性和經(jīng)代謝生成的ROS影響細胞[19]，而ROS也能引起炎性小體的激活、聚集[20]，ROS的產(chǎn)生也會促進TLR4的表達，使TLR4介導的氧化應激反應效應增強[16]。目前關于PM2.5對二者的共同影響鮮有報道。本研究觀察到PM2.5可刺激巨噬細胞ROS的產(chǎn)生，TLR4抑制劑可抑制PM2.5對ROS的升高作用，表明PM2.5通過TLR4介導巨噬細胞ROS的生成；另一方面，使用ROS抑制劑也可削弱PM2.5對TLR4的上調作用，而加入ROS激動劑則進一步增加TLR4的表達，表明ROS作為 PM2.5作用于TLR4后的產(chǎn)物分子可正反饋TLR4的表達，通過上調TLR4的表達進一步促進PM2.5的致炎作用。另外，ROS激動劑可進一步增加PM2.5促多炎癥小體的表達和炎性因子的分泌作用，而ROS抑制劑則削弱PM2.5的致炎效應，說明PM2.5可能通過TLR4/ROS途徑促進巨噬細胞炎癥反應和凋亡過程。

由于不同區(qū)域的PM2.5在成分上可能存在區(qū)別，對機體的影響可能存在差異，沒有采集多區(qū)域的PM2.5樣本進行平行實驗是本實驗的不足之處，同時本實驗為體外實驗，未在原始細胞中進行實驗，可能與人體內病理過程存在區(qū)別，因此下一步研究可觀察PM2.5對體內動脈粥樣硬化過程的影響及對巨噬細胞炎癥反應的機制探討。

4 結論

PM2.5可通過TLR4受體增加多炎性小體的表達，同時增加ROS的水平促進RAW264.7巨噬細胞凋亡和炎癥反應。