劉 品，王文博

( 咸陽師范學院 生命科學系，陜西 咸陽 712000 )

大鯢(Andriasdavidianus)，屬隱鰓鯢科大鯢屬，因其叫聲酷似嬰兒啼哭俗稱“娃娃魚”，1869年在我國西部首次被發(fā)現(xiàn)，為我國獨有物種[1]。由于生存環(huán)境被破壞、氣候變化、人為濫捕濫殺等原因，大鯢曾一度瀕臨滅絕。20世紀70年代國內(nèi)開始大鯢的人工繁育與養(yǎng)殖。然而隨著大鯢養(yǎng)殖規(guī)模擴大，營養(yǎng)搭配不合理以及養(yǎng)殖環(huán)境污染等問題頻繁出現(xiàn)，大鯢養(yǎng)殖病害問題日益嚴重。人工養(yǎng)殖大鯢常見疾病包括細菌病、病毒病、寄生蟲病等[1]，其中，尤以病毒感染最為嚴重。大鯢感染病毒后發(fā)病快，死亡率高，且感染后無特效藥物。目前國內(nèi)報道的造成大鯢病毒性疾病的病毒只有一種，但對其命名尚未統(tǒng)一，有大鯢蛙病毒(Andriasdavidianusranavirus, ADRV；Chinesegiantsalamanderranavirus, CGSRV)、大鯢虹彩病毒(Andriasdavidianusiridovirus, ADIV；Giantsalamanderiridovirus, GSIV)等[2-5]。2010年，耿毅等[2]首次在甘肅隴南和陜西漢中患病大鯢內(nèi)臟中觀察到呈晶格狀排列的病毒顆粒，分析發(fā)現(xiàn)該病毒主要核衣殼蛋白(MCP)基因與蛙病毒3 MCP基因同源性達96%～99%。之后，中國水產(chǎn)科學院長江水產(chǎn)研究所(以下簡稱水科院長江所)、中國科學院水生生物研究所(以下簡稱中科院水生所)和北京動植物檢疫研究所等數(shù)個研究團隊也相繼開始關(guān)注該病毒。有學者分析全國不同養(yǎng)殖區(qū)域患病大鯢的10株病毒流行株的MCP基因，發(fā)現(xiàn)其序列相似性達99.7%～100%[6-8]，進一步證實中國大鯢蛙病毒流行株屬同一基因型。最終確定大鯢蛙病毒為導致大鯢出現(xiàn)皮膚潰瘍、四肢腫脹、腐爛等病癥的病原。大鯢蛙病毒隸屬于虹彩病毒科蛙病毒屬(Ranavirus)，該屬的病毒是一類能夠感染多種動物的大型單分子雙鏈DNA病毒，在魚類、兩棲類和爬行類等水生脊椎動物中均能引發(fā)流行性傳染病[9-10]。近十年來，國內(nèi)學者陸續(xù)開展了對大鯢蛙病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學特征、生活周期和致病機理等方面的研究，逐步加深了對該病毒的認識。筆者系統(tǒng)全面地綜述了近十年來在大鯢蛙病毒的致病機理、組學研究與功能基因分析、宿主抗病毒免疫功能基因分析、分子檢測和免疫防控技術(shù)等方面的研究進展，以期為大鯢病毒性疾病的防治提供參考。

1 大鯢蛙病毒感染致病的細胞基礎(chǔ)

1.1 大鯢蛙病毒細胞培養(yǎng)特性

在大鯢蛙病毒感染機制方面，已開展廣泛研究。2014年，Ma等[12]首次報道了大鯢蛙病毒在鯉上皮瘤細胞系中的形態(tài)發(fā)生過程。與其他病毒侵染細胞方式類似，大鯢蛙病毒感染1 h后通過膜融合方式進入細胞內(nèi)，6 h后開始增殖，72 h后進入平臺期；感染末期，病毒衣殼逐漸成熟并形成典型的二十面體結(jié)構(gòu)，于病毒基質(zhì)處聚集成假晶體陣列，最終通過出芽方式釋放[12]。大鯢蛙病毒也能在大鯢脾臟細胞中增殖，但大鯢蛙病毒感染后出現(xiàn)細胞病變的時間與在鯉上皮瘤細胞中相比要晚，鯉上皮瘤細胞感染病毒24 h即出現(xiàn)細胞病變，而大鯢脾臟細胞感染后36 h才出現(xiàn)細胞病變[13]。隨后，中科院水生所建立了大鯢的胸腺細胞系、脾細胞系和腎細胞系，并進一步比較了大鯢蛙病毒對3種細胞的侵染情況，發(fā)現(xiàn)大鯢胸腺細胞系對該病毒最敏感，侵染24 h即出現(xiàn)細胞病變，而在大鯢脾細胞系和腎細胞系中，病毒侵染36 h后才出現(xiàn)細胞病變[14]。雷存科等[15]比較了大鯢蛙病毒對爪蟾(Xenopus)腎細胞系、大鯢胸腺細胞系和鯉上皮瘤細胞系的敏感性，同樣發(fā)現(xiàn)大鯢胸腺細胞系對病毒更為敏感，相比于爪蟾腎細胞系和鯉上皮瘤細胞系，病毒在大鯢胸腺細胞系中細胞病變速度要更快且明顯。此外，在大鯢肌細胞中研究發(fā)現(xiàn)，大鯢蛙病毒感染后36 h才開始出現(xiàn)細胞病變[16]。說明大鯢蛙病毒對大鯢不同組織細胞敏感性存在差異。近來，有報道指出，大鯢蛙病毒能在人胚腎細胞內(nèi)順利完成其生活周期，產(chǎn)生具感染力的完整子代病毒，但感染后細胞出現(xiàn)病變時間較晚(72 h)[17]。以上研究結(jié)果表明，大鯢蛙病毒對于不同來源及不同組織源細胞敏感性存在差異，整體來看大鯢蛙病毒更易侵染大鯢胸腺細胞系。除此之外，水科院長江所開發(fā)出規(guī)?；囵B(yǎng)大鯢肌細胞和大鯢蛙病毒的方法——Cytodex 3微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，這將為大鯢蛙病毒疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[16]。

1.2 大鯢蛙病毒誘導細胞凋亡的機制

為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞會產(chǎn)生由基因調(diào)控的自主、有序的死亡，其中涉及多種細胞因子和調(diào)控機制，是多細胞生物生命過程中重要的生理或病理現(xiàn)象，常見的有細胞凋亡、自噬等[18]。病毒可以利用這一過程產(chǎn)生更多的子代病毒或利于自身的釋放，宿主細胞也可利用細胞凋亡和自噬過程阻止病毒的擴增和傳播[19]。此外，在病毒感染過程中還存在細胞壞死性凋亡、焦亡等細胞非典型程序性死亡方式[20-21]，可見病毒與宿主細胞之間的關(guān)系復雜而多樣。在水產(chǎn)動物中，誘導靶器官的細胞死亡是蛙病毒屬病毒重要的致病機制之一[22-23]。有研究指出，大鯢蛙病毒能在病灶細胞中引起細胞壞死，導致多個器官功能障礙，同時部分損傷細胞呈現(xiàn)出細胞凋亡的形態(tài)特點，如核濃縮、邊集等。說明大鯢蛙病毒在感染細胞過程中亦可能通過誘導細胞凋亡的方式引起細胞壞死，最終導致機體器官功能受損[24-26]。為深入探究大鯢蛙病毒致病機制，Du等[27]利用超薄切片技術(shù)，在未表現(xiàn)癥狀的染毒大鯢的肝、脾和腎臟組織細胞中發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)出現(xiàn)與自噬有關(guān)的囊泡以及凋亡小體。在培養(yǎng)的鯉上皮瘤細胞系中亦印證了這一點，大鯢蛙病毒侵染鯉上皮瘤細胞后，核內(nèi)出現(xiàn)典型的染色質(zhì)邊集和染色質(zhì)濃縮形成凋亡小體的現(xiàn)象，與此對應(yīng)的細胞凋亡率和線粒體膜電位崩解率顯著升高，表明大鯢蛙病毒可能通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導鯉上皮瘤細胞凋亡[28]。但該研究并未闡明病毒通過該通路中哪些效應(yīng)因子發(fā)揮促凋亡的作用。為明確大鯢蛙病毒誘導細胞凋亡的機制，Li等[29]利用大鯢肌細胞系開展了相關(guān)研究，結(jié)果顯示：大鯢蛙病毒感染期間，參與細胞外源性凋亡途徑的AdFas和AdTNFR1基因的表達顯著上調(diào)，半胱氨酸蛋白酶8的活性顯著增加，說明大鯢蛙病毒感染期間大鯢肌細胞外源凋亡途徑的半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)被激活；另外，細胞線粒體膜電位在感染期間顯著降低，并且在細胞質(zhì)中可檢測到細胞色素c，半胱氨酸蛋白酶9活性也顯著增加，說明大鯢蛙病毒感染后也可激活線粒體依賴性的細胞內(nèi)源性凋亡途徑。近來，Li等[30]又明確了一個連接外源性和內(nèi)源性凋亡通路的基因——Bid基因，其在大鯢蛙病毒感染的大鯢肌肉、腎臟和脾臟中的表達水平均顯著升高，且在大鯢肌肉細胞系中過表達Bid基因后細胞凋亡過程明顯增強，胞內(nèi)大鯢蛙病毒MCP的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平也都顯著升高，揭示Bid基因在大鯢蛙病毒誘導的細胞凋亡和病毒復制中起到了積極的作用。綜上可知，在大鯢中外源性和內(nèi)源性促凋亡途徑可能都參與了大鯢蛙病毒誘導的細胞凋亡過程。

2 大鯢蛙病毒組學研究

2.1 大鯢蛙病毒的基因組學研究

為了進一步研究蛙病毒屬病毒的基因功能和感染機制，研究者運用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學技術(shù)分析了該屬病毒的基因轉(zhuǎn)錄和表達。目前，自魚類、兩棲動物和爬行動物中分離出的多種蛙病毒已被完全測序。比較分析蛙病毒基因組序列發(fā)現(xiàn)，從兩棲動物中分離的蛙病毒具有高度的基因組序列共線性[5,31]。大鯢蛙病毒基因組學研究起步較晚，2013年中科院水生所率先測定了大鯢蛙病毒的全基因序列(登錄號：KC865735)，并根據(jù)20株完全測序的虹彩病毒26個核心蛋白基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1[5])，從進化關(guān)系上來看，大鯢蛙病毒與蛙病毒3相似性最高[5]。大鯢蛙病毒基因組全長約為106 734 kb，GC含量為55%，包含101個開放閱讀框，分別編碼44～1294個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中包括26個病毒核心基因、24個蛙病毒特有基因和40個未知基因[5]。與其他兩棲類蛙病毒相比，大鯢蛙病毒基因組發(fā)生了顯著的變異，包括片段倒置、片段插入和缺失[5]。不同蛙病毒分離株之間的片段倒置反映出病毒的高重組率，而基因組重排則會由于某些基因的破壞或添加而產(chǎn)生新的更具致病性的病毒株[32]。在大鯢蛙病毒中有3類與毒力相關(guān)的基因發(fā)生了變異：第1類是與病毒復制和發(fā)病機制相關(guān)的US22家族中的6R和49L基因；第2類是vIF2α基因，在大鯢蛙病毒中vIF2α的2個功能域只在C末端區(qū)域殘留69和76個氨基酸，vIF2α可阻斷宿主細胞雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶的抗病毒作用；第3類是變異的75L基因，在大鯢蛙病毒中75L同時包含完整的NLS和NES序列，而在其他幾種蛙病毒的同源序列中則僅含有NES序列或不完整的NLS序列[5,33-34]。NLS對病毒核蛋白的輸入和輸出、病毒蛋白的合成具有重要作用[35]。研究者認為，大鯢蛙病毒的75L基因可能參與病毒蛋白的合成和轉(zhuǎn)運，推測其可能是強毒性基因[5]。同一時期另外兩個研究團隊也對大鯢蛙病毒進行了全基因序列的測定(登錄號KF512820和KF033124)，測序結(jié)果與Chen等[5]測序結(jié)果基本一致[36-37]。

圖1 20株虹彩病毒核心蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹[5]Fig.1 Phylogenetic tree of core protein sequences from 20 iridoviruses[5]

2.2 大鯢蛙病毒蛋白質(zhì)組學研究

病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括病毒顆粒的結(jié)構(gòu)形成、病毒與宿主的互作、病毒感染的初始步驟、病毒基因的轉(zhuǎn)錄和宿主轉(zhuǎn)移等[38]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以對基因表達進行識別、分析，并鑒定蛋白質(zhì)的功能及作用模式。當前，已有研究者運用一維或二維聚丙烯酰胺凝膠電泳、肽質(zhì)量指紋圖譜、MALDI質(zhì)譜分析、液—質(zhì)聯(lián)用等蛋白質(zhì)組學技術(shù)對包括大鯢蛙病毒在內(nèi)的蛙病毒成員進行了蛋白質(zhì)組學研究[36,39-40]。通過分析病毒在感染宿主細胞過程中其蛋白表達的變化，研究病毒蛋白的功能，可以加深對蛙病毒生物學過程的理解。Li等[36]首次通過液相—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從純化的大鯢蛙病毒顆粒中檢測到40種病毒相關(guān)病毒蛋白，其中包括15個核心病毒蛋白。為進一步分析這些蛋白，該研究團隊通過反轉(zhuǎn)錄PCR確認了這些基因，結(jié)合藥物抑制試驗發(fā)現(xiàn)37個分時期表達蛋白，即5個立即早期基因(IE)，12個延遲早期基因(E)和20個晚期基因(L)，與其他虹彩病毒相比，這些基因序列比較保守，但是基因的表達時間會有些差異。此外，在大鯢蛙病毒中還發(fā)現(xiàn)幾個與其他虹彩病毒同源的包膜蛋白(ORF002L、ORF060R和095L)，這些蛋白與病毒粒子組裝和病毒感染有關(guān)[36,38,41]。袁江迪等[42]通過凝膠電泳分析了正常大鯢和感染大鯢蛙病毒大鯢的血清蛋白和黏液蛋白，證實了大鯢感染大鯢蛙病毒后大鯢血清和黏液蛋白組分會出現(xiàn)顯著不同。水生動物體表黏液和血清中蛋白作用眾多，可保護機體免受病原體損傷與侵染等發(fā)揮免疫保護作用[43]。當前通過分析黏液蛋白與血清中的蛋白組分以評估機體生理生化狀況或某些疾病的研究較廣泛。

3 大鯢抗病毒免疫相關(guān)基因的鑒定和功能研究

3.1 大鯢感染大鯢蛙病毒后轉(zhuǎn)錄組測序分析

轉(zhuǎn)錄組測序是利用新一代測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)，可以全面快速獲得特定細胞或組織在某一生理狀態(tài)下信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA及非編碼RNA的序列信息和表達信息。目前大鯢轉(zhuǎn)錄組測序分析方面已開展了大量工作[44-50]，其中不乏針對大鯢感染病毒后宿主的先天性免疫、體液免疫和細胞免疫應(yīng)答機制等方面的轉(zhuǎn)錄組學研究，篩選出眾多大鯢抗病毒免疫相關(guān)的信號通路與基因信息[44,46,49-50]。早在2014年，中科院水生所構(gòu)建了大鯢感染大鯢蛙病毒后胸腺的cDNA文庫，通過表達序列標簽(EST)分析獲得137個可能的免疫相關(guān)基因，重點分析了免疫球蛋白重鏈(IgM、IgY和IgD)、IFN誘導蛋白6(IFI6)和T細胞受體β鏈(TCR β)的結(jié)構(gòu)特征和表達譜，為大鯢抗病毒免疫的分子機制提供了重要信息[44]。該研究首次在大鯢中發(fā)現(xiàn)特殊形式的IgY和IFI6基因，以及含有鉸鏈的IgD區(qū)，這些變化之前在其他兩棲動物中均未發(fā)現(xiàn)[44]。這種特殊形式的IgY可在不引發(fā)炎癥反應(yīng)的情況下中和病原體[51]。而IFI6基因?qū)儆贔AM14家族，有報道指出，該家族成員可能參與病毒感染過程中線粒體介導的細胞凋亡[52]。2015年，水科院長江所采用Solexa測序和Trinity 轉(zhuǎn)錄組測序組裝技術(shù)分析了感染大鯢蛙病毒的大鯢脾臟，發(fā)現(xiàn)部分差異表達基因涉及免疫反應(yīng)相關(guān)的信號通路，如Toll樣受體(TLR)、NACHT-LRR受體(NLR)和RIG-I樣受體(RLR)介導的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，推測病毒感染會引起大鯢脾臟中免疫相關(guān)信號通路的應(yīng)答[46]。該研究還發(fā)現(xiàn)，感染病毒后大鯢先天免疫中補體系統(tǒng)相關(guān)基因表達發(fā)生變化，推測病毒感染可能引發(fā)大鯢脾臟補體系統(tǒng)原發(fā)性免疫缺陷[46]。近來，為了解大鯢感染不同病毒后的宿主應(yīng)答的差異，Ke等[50]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較了大鯢感染大鯢蛙病毒和沼澤綠牛蛙虹彩病毒(RGV)后其脾臟的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)感染初期種間病原體(沼澤綠牛蛙虹彩病毒)的復制速度要顯著快于自然病原體(大鯢蛙病毒)。說明兩種病毒侵染宿主后增殖模式不同，引起的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)也不盡相同，最終兩種病毒侵染結(jié)果也出現(xiàn)差異。綜上可知，對大鯢轉(zhuǎn)錄組學的分析主要集中于從不同角度分析大鯢與病毒之間的互作關(guān)系，為病毒入侵大鯢的致病機制提供了重要資料。

微小RNA(miRNA)是長度約為22個核苷酸的小型非編碼RNA，通過與特定的mRNA靶位點結(jié)合，導致靶標mRNA降解或翻譯抑制，從而在靶基因表達中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在機體病原微生物感染后的防御過程中發(fā)揮重要作用[53]。miRNA介導的宿主—病原體相互作用的研究已成為免疫系統(tǒng)研究的熱點。在生物或非生物脅迫下運用高通量測序技術(shù)可以識別大量已知miRNAs和特異性miRNAs[54-56]。有報道指出，病毒編碼的miRNA可能參與了病毒免疫逃逸過程[56]。大鯢感染大鯢蛙病毒后其脾臟相關(guān)的miRNA表達模式會發(fā)生變化，共發(fā)現(xiàn)82個下調(diào)和9個上調(diào)的差異表達miRNA，它們在大鯢蛙病毒感染引起的非特異性免疫以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[49]。當前，識別大鯢中與免疫相關(guān)的miRNAs并對其功能進行解析，將為深入了解大鯢抵抗大鯢蛙病毒入侵機制提供依據(jù)。

3.2 大鯢抗病毒免疫相關(guān)基因的篩選和功能分析

免疫應(yīng)答是病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)被機體細胞膜上的PAMPs識別受體(PRR)識別，引起級聯(lián)反應(yīng)并誘導機體分泌多種可溶性介質(zhì)抵御病原感染的過程[57]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種識別不同病毒的PRR，如TLR家族、NLR家族、RLR家族、PYHIN家族和NOD家族等[58]。目前大鯢的模式識別受體已有報道，包含能夠識別病毒或者細菌的核苷酸衍生物的TLR7、半乳糖凝集素家族(Galectin)、識別各種病原體基序的細胞質(zhì)螺旋酶維甲酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(MDA5)等[59-62]。Galectin參與識別并結(jié)合病原微生物表面配體，大鯢感染大鯢蛙病毒后多個組織Galectin家族基因的表達量變化顯著，推測Galectin家族參與了大鯢抗病毒免疫調(diào)節(jié)[59]。RIG-Ⅰ和MDA5在結(jié)構(gòu)上比較相似，且均在先天性抗病毒免疫及相關(guān)的信號通路中發(fā)揮作用[63-64]。與其他生物感染病毒后的機體反應(yīng)類似，大鯢蛙病毒也能引起大鯢腎臟和脾臟的模式識別受體如TLR7、RIG-Ⅰ和MDA5的表達，但只在脾臟內(nèi)的接頭分子髓樣細胞分化因子88(MyD88)被激活[60-62]?；赟olexa測序技術(shù)，F(xiàn)an等[46]研究發(fā)現(xiàn)，大鯢感染病毒后脾臟有513個基因表現(xiàn)出差異，其中大量基因涉及TLR、NLR和RLR模式受體介導的信號通路，但是在轉(zhuǎn)錄水平中只有33個基因呈現(xiàn)出顯著差異。大鯢蛙病毒如何刺激大鯢細胞內(nèi)模式識別受體并引起一系列的分子事件目前尚未明確，有待進一步研究。

病毒感染機體后，模式識別受體與相應(yīng)配體結(jié)合，迅速激活細胞內(nèi)的接頭分子，如MyD88、干擾素刺激基因(ISG)等，將信號傳遞到胞內(nèi)，這些分子可活化核因子κB(NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)，進而誘導干擾素和炎性細胞因子的表達，最終激活機體的抗病毒防御機制，抑制病毒的侵染和復制[65]。NF-κB信號通路在機體的免疫應(yīng)答、細胞凋亡及應(yīng)激反應(yīng)等過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[66]。目前，大鯢已有多個與病毒侵染后免疫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被克隆鑒定分析(表1)。Chen等[67]克隆并鑒定了大鯢Ⅰ型干擾素(ⅠIFN)基因。干擾素可誘導編碼抗病毒蛋白的ISG的表達，它們通過JAK/STAT信號通路在宿主針對病毒和細菌感染的先天免疫應(yīng)答中起主要作用[68]。感染病毒后，大鯢外周血白細胞Ⅰ IFN基因表達水平顯著升高，而在大鯢肌細胞過表達Ⅰ IFN基因后，病毒載量和滴數(shù)均明顯降低，Ⅰ IFN誘導型基因—抗病毒蛋白(Mx)基因的表達也顯著上調(diào)[67]。Mx在脊椎動物和無脊椎動物中高度保守，是由Ⅰ IFN誘導，可在病毒感染期間與其他IFN誘發(fā)蛋白一起抵抗病毒入侵[69]。大鯢感染病毒后，其腎臟、脾臟和肌肉等組織中的Mx基因表達水平顯著升高；而在大鯢肌肉細胞過表達Mx基因后再進行病毒侵染，細胞中病毒載量、基因表達量和MCP合成水平都有所降低：可見Mx在大鯢對病毒的免疫反應(yīng)中也起著重要的抗病毒作用[70]。近來，大鯢上又有IRF3、白介素18(IL-18)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)等免疫相關(guān)基因被相繼鑒定分析[71-73]。研究證實IRF3在病毒感染后可激活I(lǐng)FN和ISGs的表達，病毒誘導的IRF3磷酸化后從胞質(zhì)易位至核，刺激IFN-1和其他IFN誘導的基因的轉(zhuǎn)錄，引起細胞的抗病毒相關(guān)基因的表達[74]。感染大鯢蛙病毒后，大鯢脾臟的IRF3基因表達升高，而沉默IRF3基因后，病毒侵染造成的ISG基因表達則受到抑制[71]，說明IRF3在病毒誘導的大鯢抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。IL-18由激活的免疫細胞產(chǎn)生，可與胞內(nèi)接頭蛋白MyD88互作并激活NF-κB和MAKP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，誘導下游基因如TNF-α和IFN-γ等的表達，進而引發(fā)機體的免疫應(yīng)答[75]。大鯢白細胞沉默IL-18基因后再感染病毒，其NF-κB和4種促炎細胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-α和IFN-γ)的表達受到抑制；而用重組IL-18蛋白處理白細胞后，NF-κB和4種促炎細胞因子則被明顯誘導，這意味著大鯢IL-18s參與觸發(fā)NF-κB信號傳導和促炎反應(yīng)[72]。TRAF3是一種信號轉(zhuǎn)導蛋白，在細胞中主要功能是連接上游受體信號和下游抗病毒信號。大鯢血液和脾臟TRAF3均能對大鯢蛙病毒的侵染作出應(yīng)答，沉默大鯢吞噬細胞TRAF3基因后，可顯著抑制IFN信號通路相關(guān)基因的表達；在鯉上皮瘤細胞中過表達TRAF3基因后，可激活I(lǐng)FN-β啟動子并活化NF-κB：這表明TRAF3基因在大鯢天然抗病毒免疫中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[73]。

綜上所述，目前已發(fā)現(xiàn)多個模式識別受體及下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與了大鯢感染大鯢蛙病毒后免疫應(yīng)答，涉及NF-κB、MAPK、ERK和IFN等眾多信號通路，但確切的分子機制仍有待進一步研究。

表1 大鯢免疫相關(guān)基因

4 大鯢蛙病毒免疫防控的研究

在水生動物中，免疫防控是防控傳染性疾病最有效的途徑之一，其中注射疫苗、口服疫苗等方式在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用較多[80-82]。與魚類和其他兩棲類相比，中國大鯢免疫防控等方面的研究起步較晚，尚未有針對性藥物用于防控大鯢蛙病毒引起的疾病。因此，開發(fā)疫苗成為預(yù)防水生動物病毒性疾病最為有效的方法。

4.1 滅活疫苗

滅活病毒疫苗主要通過物理或化學方法，將具有感染性的病毒殺死使其失去致病力，但仍保持其抗原性。目前，應(yīng)用最為普遍且安全的就是滅活疫苗。這類疫苗開發(fā)周期短且安全性較好，但該類疫苗只能誘導機體體液免疫，防護時間短并需要適當?shù)拿庖咦魟┡浜鲜褂?。在大鯢蛙病毒滅活疫苗研究方面，已開展了大量研究工作。2013年，孫建濱等[83]首次利用β-丙內(nèi)酯和福爾馬林滅活大鯢蛙病毒制作疫苗，發(fā)現(xiàn)兩種方法制作的滅活疫苗對大鯢的免疫保護率分別為83.3%和72.2%，在注射疫苗7 d后即可檢測到抗體，21 d時抗體效價分別達到1∶320和1∶287。眾所周知，佐劑不在體內(nèi)產(chǎn)生免疫記憶，但可在短時間內(nèi)提高機體的免疫應(yīng)答水平，進而提高機體的抗病力。大鯢蛙病毒滅活疫苗研究中，研究者也關(guān)注到免疫佐劑對疫苗的免疫效果的提高。劉文枝等[84]評估了β-丙內(nèi)酯滅活大鯢蛙病毒疫苗免疫效果的同時還對兩種免疫佐劑的使用效果進行研究，結(jié)果顯示：該滅活疫苗在免疫早期即可誘導大鯢非特異性免疫，促進大鯢免疫應(yīng)答相關(guān)基因如TLR9和MyD88表達；兩種免疫佐劑鉛膠和弗氏完全佐劑相對免疫保護率分別為84%和90%。另外，鄧綠洲等[85]發(fā)現(xiàn)，黃茋多糖和ISA763A兩種佐劑都能提高β-丙內(nèi)酯滅活大鯢蛙病毒疫苗的免疫效應(yīng)，其相對免疫保護率分別為71.43%和85.71%，大鯢免疫水平和免疫相關(guān)基因的表達水平均提高。近來，索鈺杰等[86]針對β-丙內(nèi)酯滅活的大鯢蛙病毒疫苗的安全性和免疫效力進行了系統(tǒng)性研究，進一步明確了最佳免疫方式和疫苗免疫劑量。

4.2 DNA疫苗

DNA疫苗也稱核酸疫苗或基因疫苗，是利用基因工程技術(shù)將抗原基因重組到真核表達載體，而后直接注入生物體內(nèi)誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的新型疫苗。已有研究證實，DNA疫苗對虹彩病毒科的紅鯛虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒和傳染性脾腎壞死病毒有效，免疫保護率可分別達到71.4%、66.7%和80.0%[87-89]。曾憲輝等[90]將大鯢蛙病毒中MCP基因克隆到真核表達載體中表達，首次制作出大鯢蛙病毒的DNA疫苗，免疫大鯢后可誘導細胞免疫并產(chǎn)生特異性抗體，免疫保護率可達73.3%。隨后，又有研究者構(gòu)建了含有大鯢蛙病毒 2L(pcDNA-2L)基因和58L(pcDNA-58L)基因的DNA疫苗，但接種pcDNA-2L的大鯢相對存活率(66.7%)顯著高于接種pcDNA-58L的大鯢(3.3%)，在接種pcDNA-2L后14 d和21 d的大鯢體內(nèi)還可檢測到大鯢蛙病毒的特異性抗體[91]。DNA疫苗對病毒的免疫保護率變化較大，一方面與病毒種類有關(guān)，另一方面與選擇的病毒基因有關(guān)。選做疫苗的病毒DNA片段一般都是病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列，這些結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原的免疫效果存在差異，相應(yīng)地對機體的免疫系統(tǒng)的激活效果也不同，最終出現(xiàn)不同的保護效率。

4.3 重組疫苗

重組疫苗是通過遺傳學重組機制來生產(chǎn)的疫苗，主要有兩大類：一類是重組亞單位疫苗，通過重組DNA技術(shù)將病毒表面抗原在細菌或細胞培養(yǎng)物中表達，獲得所需的抗原制備疫苗；一類是重組活載體疫苗，通過改變已知病毒致病基因制備疫苗，或者是將致病病毒關(guān)鍵基因插入到非致病微生物上制備疫苗。彩虹病毒的MCP占總多肽的40%～45%，在誘導抗病毒免疫反應(yīng)中起重要作用，因此在制作疫苗時中也多以重組MCP作為抗原生產(chǎn)疫苗[92-93]。已有研究者分別運用兩種方式制作出針對大鯢蛙病毒的重組疫苗。2015年，水科院長江所Zhou等[92]根據(jù)酵母密碼子偏好性優(yōu)化大鯢蛙病毒的MCP基因序列后，通過重組技術(shù)利用酵母表達了MCP，將蛋白純化后免疫大鯢，其相對保護率可達78%。而后Zhou等[93]通過將大鯢蛙病毒的MCP基因重組到桿狀病毒基因組，制成了大鯢蛙病毒的重組活載體疫苗—重組桿狀病毒疫苗，將其免疫大鯢后獲得84%的相對保護率。比較而言，重組疫苗安全性要高于其他種類疫苗，但易受到載體系統(tǒng)的影響。兩種方式獲得的重組疫苗對大鯢的保護率均較高，可以作為大鯢蛙病毒的候選疫苗，但仍需對疫苗的安全性與免疫效力開展系統(tǒng)性研究。

5 展 望

迄今為止，人們已在大鯢蛙病毒的分離與純化、理化性質(zhì)、檢測技術(shù)、感染致病分子機制、基因組學、蛋白組學以及免疫防控等多方面開展了研究，對于明確大鯢蛙病毒的生物學特性、感染機制、快速準確檢測與免疫防治有重要的意義。未來還需要從以下方面開展研究工作：(1)要加快研發(fā)有效抗大鯢蛙病毒藥物，特別是在中草藥制劑方面。當前中草藥在水生動物疾病的預(yù)防與控制方面研究日益增多，已有研究證實，中草藥對大鯢細菌性疾病的防護作用[94-95]，并且中草藥提取物還可作為免疫佐劑增強大鯢蛙病毒疫苗免疫效果[85]，利用中草藥及相關(guān)制劑增強大鯢免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究尚少，中草藥制劑的研發(fā)也應(yīng)該成為大鯢蛙病毒防治研究的重要方向；(2)要加深大鯢蛙病毒功能基因方面的研究。相比于蛙病毒屬的其他病毒，大鯢蛙病毒發(fā)現(xiàn)較晚，其基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達研究尚淺，闡明病毒基因的功能可洞悉病毒更深層次的致病機制；(3)要深化RNA干擾、基因編輯等基因工程技術(shù)在抗大鯢蛙病毒方面的應(yīng)用，該類技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒感染治療領(lǐng)域，在抗大鯢蛙病毒研究方面[96-97]也取得了初步進展，基因工程技術(shù)優(yōu)勢突出，發(fā)展前景廣闊，可為大鯢蛙病毒防治開辟新的方向；(4)繼續(xù)開展病毒與宿主互作機制研究。當前，已有大量關(guān)于大鯢應(yīng)答病毒感染相關(guān)基因的研究，但研究層次尚屬起步，多數(shù)集中在克隆獲得其核酸序列以及分析病毒感染后基因的表達變化等方面，今后還要進一步結(jié)合細胞分子生物學、基因組學、蛋白組學和生物化學等技術(shù)手段，闡明宿主對病毒侵染的代謝免疫調(diào)控機制、病毒調(diào)控與利用宿主代謝機制，深入揭示大鯢蛙病毒與宿主互作的分子機制。