馮森磊，任國(guó)梁，甘樹(shù)勝，梁夏菲，段海寶，葛紅星，董志國(guó)

( 江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005 )

彩虹明櫻蛤(Moerellairidescens)俗稱海瓜子，是沿海地區(qū)的一種經(jīng)濟(jì)貝類，屬簾蛤目櫻蛤科明櫻蛤?qū)?。因其個(gè)體大小和形狀與食用瓜子相似而得名。其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，主要分布于西太平洋沿岸和澳大利亞北部，在我國(guó)主要產(chǎn)于浙江和福建沿海等地[2]。

染色體是染色質(zhì)的一種形態(tài)，易被堿性染料染色，具有一定形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，它主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，是遺傳信息的載體，具有儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的功能[3]。染色體作為細(xì)胞中重要的遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能一直是細(xì)胞遺傳學(xué)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。核型是染色體在細(xì)胞有絲分裂中期的表型，能反映出染色體的數(shù)目、大小、形態(tài)等特征[4]。簾蛤目是雙殼貝類中的一個(gè)大類群，在我國(guó)常見(jiàn)的簾蛤目種類有60余種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2014年，我國(guó)對(duì)軟體動(dòng)物種類的染色體核型分析已報(bào)道81種，其中雙殼類52種，對(duì)簾蛤目染色體的研究有19種，其中簾蛤科9種，蛤蜊科4種，竹蟶科3種，刀蟶科2種，紫云蛤科1種[5]。段海寶等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青蛤(Cyclinasinensis)二倍體與單倍體數(shù)目分別是2n=38和n=19，核型組成為2n=11m+6sm+2st；楊品紅等[7]對(duì)三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的研究結(jié)果顯示，其染色體中的絕對(duì)長(zhǎng)度較小，二倍體數(shù)目為2n=38，核型為2n=12m+5sm+2st，臂數(shù)為NF=72；蔡巖等[8]研究表明，法螺(Charoniatritonis)染色體二倍體數(shù)2n=70，核型為2n=32m+18sm+20st，NF=120。而有關(guān)櫻蛤科種類的染色體研究尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者通過(guò)染色體制片獲得清晰的染色體分裂相，對(duì)彩虹明櫻蛤的染色體核型進(jìn)行分析，探明其染色體數(shù)目及核型組成，有助于從染色體方面為彩虹明櫻蛤的遺傳生化的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為彩虹明櫻蛤在貝類中的系統(tǒng)分類地位以及系統(tǒng)演化過(guò)程提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選自浙江寧波的彩虹明櫻蛤成貝，將彩虹明櫻蛤置于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行養(yǎng)殖，水體充氧，保持良好水質(zhì)，定期投喂微藻，以保證彩虹明櫻蛤的正常生理狀態(tài)。

1.2 試驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)[9]的方法，并根據(jù)試驗(yàn)中實(shí)際情況稍作改良，選取彩虹明櫻蛤成貝中的鰓瓣外緣組織作為材料，置于提前配制好的含有0.06%秋水仙素的過(guò)濾海水中，處理30 min。經(jīng)秋水仙素預(yù)處理后，通過(guò)溶液低滲40 min，加入8 mL配制好的預(yù)冷卡諾固定液[V(甲醇)∶V(冰乙酸)=3∶1]固定，反復(fù)固定3次，每次15 min，總固定時(shí)間為1 h，倒掉卡諾固定液，用鑷子將鰓組織移入1.5 mL離心管，加入1 mL的50%冰乙酸，制備細(xì)胞懸液，熱滴片法滴片，溫度為56 ℃，配制10%的吉姆薩染液[9∶1(體積比)]，染色30 min，自然晾干，鏡檢。

1.3 彩虹明櫻蛤染色體計(jì)數(shù)與核型分析

1.3.1 核型分析

選取分散好、形態(tài)完整的染色體中期分裂相，顯微拍照并利用Nikon NIS-Elements BR 3.1軟件測(cè)量染色體絕對(duì)長(zhǎng)度。使用Office 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度和臂比。利用Photoshop軟件提取每條染色體，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)Levan等[10]提出的染色體分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體類型分類，然后進(jìn)行配對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，繪制染色體核型圖。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

分類：根據(jù)臂比的大小可以確定染色體屬于哪種形態(tài)類型(表1)。

表1 染色體類型按臂比值分類

配對(duì)：根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)，即染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比、染色體的性狀和大小等進(jìn)行同源染色體的配對(duì)。

染色體臂數(shù)(NF)：m、sm、st類型的染色體臂數(shù)計(jì)為2，t類型的染色體臂數(shù)計(jì)為1。

相對(duì)長(zhǎng)度為實(shí)測(cè)長(zhǎng)度占全部染色體長(zhǎng)度總和的百分比；臂比為長(zhǎng)臂長(zhǎng)度與短臂長(zhǎng)度之比。

2 結(jié) 果

2.1 彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目

選取30個(gè)分裂相較好的中期分裂相染色體視野(圖1)，統(tǒng)計(jì)染色體的數(shù)目并計(jì)算其百分比。其中2n=36占比最高，為46.67%；2n=34占比為20.00%，而2n為其他數(shù)量的所占比例均<10%(表2)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，彩虹明櫻蛤染色體眾數(shù)為2n=36。

圖1 彩虹明櫻蛤中期分裂相染色體Fig.1 Metaphase chromosome of the clam M. iridescens

表2 彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

2.2 彩虹明櫻蛤染色體核型分析

在彩虹明櫻蛤的染色體標(biāo)本中，選取10個(gè)分散好、形態(tài)正常的染色體中期分裂相進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算其相對(duì)長(zhǎng)度和臂比的結(jié)果(表3)，通過(guò)對(duì)比分析進(jìn)行配對(duì)(圖2)。

表3 彩虹明櫻蛤染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比以及類型

圖2 彩虹明櫻蛤中期分裂相染色體及核型Fig.2 Metaphase chromosome and karyotype of the clam M. iridescensa.中期分裂相染色體； b.染色體核型.a.metaphase chromosomes； b.karyotype of chromosome.

通過(guò)比較總結(jié)得出，彩虹明櫻蛤的18對(duì)染色體中，有4對(duì)中著絲粒染色體(m)、8對(duì)亞中著絲粒染色體(sm)、6對(duì)亞端著絲粒染色體(st)。染色體核型為2n=8m+16sm+12st，NF=72，染色體總長(zhǎng)度為83.10 μm，未發(fā)現(xiàn)性染色體和隨體。

3 討 論

3.1 貝類染色體制片

在制備染色體的過(guò)程中，有很多處理因素都可能會(huì)造成染色體不同程度的收縮，所測(cè)得的染色體長(zhǎng)度往往不能真實(shí)反映染色體的長(zhǎng)度特征，但各染色體的臂比和相對(duì)長(zhǎng)度等，則能體現(xiàn)出染色體的特征[10-11]。利用Photoshop軟件進(jìn)行圖像清晰化和摳圖處理，結(jié)合臂比和相對(duì)長(zhǎng)度以及染色體形態(tài)等特征，進(jìn)行同源染色體配對(duì)，可以得到較為清晰的染色體核型圖。目前制備貝類染色體的材料，大多采用的是貝類早期胚胎、生殖腺、擔(dān)輪幼蟲(chóng)及鰓組織等[12]。蔡明夷等[13]選取波紋巴菲蛤(Paphiaundulata)擔(dān)輪幼蟲(chóng)為材料，采用滴片法成功制出波紋巴非蛤的染色體，染色體數(shù)目為2n=38；周琳等[14]取魁蚶(Scapharcabroughtonii)孵化后的擔(dān)輪幼蟲(chóng)為材料采用滴片法制出其染色體，染色體數(shù)目為2n=38；于瑞海等[15]選取活的等邊淺蛤(Macridiscusaequilatera)中鰓為組織材料，采用滴片法制取出染色體，染色體數(shù)目為2n=36；周麗青等[9]通過(guò)調(diào)節(jié)水溫，選取鰓絲及鰓絲對(duì)應(yīng)部位創(chuàng)面的愈合增生組織為材料，采用熱滴片法制出櫛江珧(Atrinapectinata)染色體，染色體數(shù)目為2n=34。以早期胚胎和擔(dān)輪幼蟲(chóng)為材料可以更容易獲得染色體分裂相，這是因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，分裂能力強(qiáng)，更容易看到染色體分裂相。但利用胚胎和擔(dān)輪幼蟲(chóng)制備染色體，會(huì)受到季節(jié)的限制，而利用鰓組織則不受季節(jié)限制，細(xì)胞分裂會(huì)相對(duì)較少[15]。對(duì)于分裂相較少的情況，一般采用植物血球凝集素進(jìn)行預(yù)處理，可以有效增加細(xì)胞分裂[16]。此外，利用鰓組織制備染色體成為了一種重要手段，并在多種貝類如紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)等貝類中取得了成功[17-18]。染色體制片的流程一般是預(yù)處理—低滲—固定—解離—滴片—染色，然后得到清晰的染色體分裂相。在本試驗(yàn)中，以彩虹明櫻蛤成貝鰓組織為材料，制備染色體標(biāo)本，分別采用0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 4個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的秋水仙素溶液處理鰓組織，處理時(shí)間為40 min。從制片效果看，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%最適，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%、0.04%處理的染色體分裂相少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%處理的染色體收縮、聚集、分散不好，無(wú)法計(jì)數(shù)，而在0.065 mol/L KCl溶液下處理40 min低滲效果最佳，0.045 mol/L KCl溶液低滲效果不理想，細(xì)胞形態(tài)易發(fā)生畸形。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低和處理時(shí)間的長(zhǎng)短都會(huì)影響到染色體形態(tài)，低滲時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生畸形，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致染色體丟失。

3.2 彩虹明櫻蛤染色體核型特征及其進(jìn)化規(guī)律

本試驗(yàn)表明，彩虹明櫻蛤的染色體數(shù)目為2n=36，這與等邊淺蛤的染色體數(shù)目相同[15]，而與大多數(shù)的簾蛤目種類染色體數(shù)目不同，簾蛤目種類染色體數(shù)目大多為2n=38[5]。從染色體數(shù)目來(lái)看，彩虹明櫻蛤和等邊淺蛤(2n=36)有著較親密的親緣關(guān)系。Nakamura等[19-20]認(rèn)為，原始雙殼貝類染色體數(shù)目可能是2n=38。貝類在核型進(jìn)化過(guò)程中，主要有兩個(gè)方向，一個(gè)是染色體數(shù)目的增加，一個(gè)是染色體數(shù)目的減少。目前相關(guān)研究表明，雙殼貝類染色體數(shù)目減少是比較常見(jiàn)的類型，比如大獺蛤(Lutrariamaxima)和中國(guó)紫蛤(Sanguinolariachinensis)的染色體數(shù)目分別為34和30條[21-22]，而有關(guān)染色體數(shù)目增加的種類還未有報(bào)道。已知的簾蛤目染色體數(shù)目多為2n=38，而2n=30或2n=34可能是進(jìn)化過(guò)程中染色體數(shù)目減少的類型，2n=36可能是進(jìn)化過(guò)程中的中間過(guò)渡類型[5]。筆者制備染色體的材料是成體鰓組織，在得出的染色體分裂相中，存在少于正常條數(shù)的染色體數(shù)目，這可能是由于在制片過(guò)程中出現(xiàn)染色體丟失或者聚集等情況。同時(shí)，有絲分裂發(fā)生異常也會(huì)造成非整數(shù)倍體等異?，F(xiàn)象，導(dǎo)致所得到的分裂相與正常染色體數(shù)目不同。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在彩虹明櫻蛤的18對(duì)同源染色體中，有4對(duì)為中著絲粒染色體(m)，8對(duì)為亞中著絲粒染色體(sm)，6對(duì)亞端著絲粒染色體(st)，m和sm類型染色體占2/3。這與大多數(shù)貝類的染色體核型組成相似，以m和sm類型染色體為主[5]，Ahmed[23]研究表明，m和sm染色體組型一般具有穩(wěn)定性，而t和st染色體較多變。在彩虹明櫻蛤的染色體中，中部和亞中部比值是：m/sm=4/8，因此在櫻蛤科中彩虹明櫻蛤的染色體進(jìn)化過(guò)程比較保守，表明其有穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征。m/sm著絲粒染色體核型比例比st/t型更高時(shí)，生物進(jìn)化程度更為高級(jí)或特化[24]。同時(shí)比較彩虹明櫻蛤和縊蟶(Sinonovaculaconstricta)中的染色體組型發(fā)現(xiàn)[23]，彩虹明櫻蛤沒(méi)有端部著絲染色體，其可能比縊蟶進(jìn)化程度更為高級(jí)。然而，對(duì)文蛤(Meretrixmeretrix)染色體的研究發(fā)現(xiàn)，文蛤沒(méi)有t或st型[25-26]，表明文蛤可能比彩虹明櫻蛤進(jìn)化程度更為高級(jí)。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目為2n=36，染色體核型公式為2n=8m+16sm+12st，未發(fā)現(xiàn)性染色體和隨體。從制片效果來(lái)看，選取繁殖前期具有較強(qiáng)分裂能力的彩虹明櫻蛤鰓組織作為制備染色體材料，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%的秋水仙素進(jìn)行預(yù)處理40 min，0.065 mol/L的KCl溶液低滲40 min，更易獲得清晰的中期染色體分裂相。