黃蘭英，張達(dá)娟，張樹林，畢相東，戴 偉

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)因繁殖力強(qiáng)、成活率高、生長周期短、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，自引入我國后迅速成為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。高密度集約化的池塘精養(yǎng)是凡納濱對(duì)蝦的普遍養(yǎng)殖模式，由于養(yǎng)殖密度高、人工餌料投入量大、養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化水平高等問題，常引起藻類尤其是藍(lán)藻的異常繁殖，從而產(chǎn)生以微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)為主的藍(lán)藻水華并釋放微囊藻毒素(MCs)[1-2]。微囊藻毒素是微囊藻屬、魚腥藻屬等藍(lán)藻產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過多種途徑發(fā)揮其毒性效應(yīng)[3-5]，對(duì)動(dòng)物及人體各器官具有損害作用[6-8]。

微囊藻毒素具有上百種異構(gòu)體，其中以微囊藻毒素-LR型毒性最強(qiáng)、分布范圍最廣[9]。微囊藻毒素具有嗜肝性[10-11]，通過不同途徑被吸收進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后主要蓄積在肝胰腺[12]，而肝胰腺作為重要免疫器官，與機(jī)體免疫功能息息相關(guān)[13]。誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是微囊藻毒素的毒性作用機(jī)理之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素進(jìn)入機(jī)體后能誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生[15-16]，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基能攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致丙二醛等氧化脂質(zhì)含量升高[17]及相關(guān)抗氧化酶活性變化[18]。微囊藻毒素對(duì)水生動(dòng)物肝胰腺具有氧化損傷作用。隗黎麗等[19]研究草魚(Ctenopharygodonidella)幼魚肝臟抗氧化系統(tǒng)對(duì)微囊藻毒素脅迫響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在高劑量微囊藻毒素誘導(dǎo)下活性均先升后降；鯉(Cyprinuscarpio)暴露在微囊藻毒素中，其肝細(xì)胞超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增加[20]；張口蟹(Chasmagnathusgranulatus)在注射銅綠微囊藻(M.aeruginosa)提取物7 d后，肝胰腺過氧化氫酶活性顯著升高[21]；銀漢魚(Odontestheshatcheri)在攝食有毒微囊藻后，其肝臟過氧化氫酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性及丙二醛含量增加[22]。此外，微囊藻毒素對(duì)Corydoraspaleatus[23]、斑馬魚(Daniorerio)[24]等魚類肝臟的抗氧化酶活性均具有誘導(dǎo)作用。Gon?alves-Soares等[25]報(bào)道，凡納濱對(duì)蝦經(jīng)微囊藻毒素注射處理后，體內(nèi)過氧化氫酶活性和相應(yīng)的基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；陳妍妍[26]發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素亞慢性染毒凡納濱對(duì)蝦后，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶基因表達(dá)水平隨微囊藻毒素濃度升高而顯著上調(diào)。大量研究表明，微囊藻毒素能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，提高抗氧化酶活性以抵抗氧化應(yīng)激作用。微囊藻毒素對(duì)水生動(dòng)物免疫酶活性影響的研究主要集中在微囊藻毒素對(duì)魚類抗氧化系統(tǒng)影響方面，在微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦氧化損傷及抗氧化系統(tǒng)影響方面的研究較少。筆者以微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦直接進(jìn)行血竇注射，檢測(cè)其肝胰腺超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性及丙二醛含量變化，探究微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺氧化損傷和相關(guān)免疫酶活性的影響，研究氧化損傷及免疫酶活性變化趨勢(shì)，為微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦中毒機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦購于天津市濱海新區(qū)海通江洋水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，體長(13.0±0.5) cm，體質(zhì)量(16.0±1.0) g，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d，日投喂1次，試驗(yàn)前24 h停止投喂。試驗(yàn)用水為曝氣24 h后的自來水，用海水晶調(diào)配鹽度至7～8，水溫(22±1) ℃，溶解氧7～8 mg/L，pH 8.0～8.5。暫養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)挑選規(guī)格一致、健康有活力的凡納濱對(duì)蝦作為試驗(yàn)用蝦。

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(MC-LR)購于伊普瑞斯科技有限公司，純度≥95%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)設(shè)1個(gè)處理組(注射微囊藻毒素)和1個(gè)對(duì)照組(注射磷酸緩沖液)。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行中分別投放凡納濱對(duì)蝦30尾。注射后0、2、4、8、16、24、48、72 h時(shí)分別自各平行中隨機(jī)挑取凡納濱對(duì)蝦3尾，迅速解剖取出肝胰腺后液氮保存，測(cè)定肝胰腺總蛋白及丙二醛含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，并記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)凡納濱對(duì)蝦死亡情況。

1.2.2 微囊藻毒素注射

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸緩沖液溶解，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)中微囊藻毒素的注射濃度為3.52×10-4mmol/kg(相當(dāng)于微囊藻密度2.6×105個(gè)/L[27])，注射體積為20 μL。對(duì)照組注射等量磷酸緩沖鹽溶液，注射部位為凡納濱對(duì)蝦腹部第二對(duì)游泳足中央的血竇處。

1.2.3 樣品制備與指標(biāo)檢測(cè)

將凡納濱對(duì)蝦肝胰腺于液氮中研磨并準(zhǔn)確稱質(zhì)量，按蝦m(肝胰腺)∶V(生理鹽水)=1 g∶9 mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的冷生理鹽水，制備成10%組織勻漿，并以3500 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，取上清液待測(cè)。使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定丙二醛含量及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，其測(cè)定嚴(yán)格按照相關(guān)方法完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)分析以SPSS 26.0進(jìn)行。先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行單因素方差分析檢測(cè)結(jié)果的顯著性水平，再進(jìn)行HSD多重比較。P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 微囊藻毒素注射后凡納濱對(duì)蝦死亡情況

注射后對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦活力正常，無死亡情況；試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦在注射后72 h內(nèi)沉于或側(cè)倒于缸底，并出現(xiàn)死亡。注射微囊藻毒素8 h后凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)死亡，72 h凡納濱對(duì)蝦死亡率達(dá)13.33%(圖1)。

圖1 微囊藻毒素注射凡納濱對(duì)蝦后死亡率Fig.1 Mortality of Pacific white shrimp L. vannameiexposed to microcystins (MC-LR) injection

2.2 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺氧化損傷的影響

注射微囊藻毒素后，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺丙二醛含量呈逐漸升高的趨勢(shì)(圖2)。注射微囊藻毒素8 h后，丙二醛含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在72 h達(dá)到最大值(4.02±0.02) nmol/mg。

圖2 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of MC-LR on malondialdehyde content in hepatopancreas of Pacific white shrimp L. vannamei不同字母表示各處理組不同時(shí)間段上差異顯著(P<0.05);下同.Different letters indicate that there are significant differences in each treatment group in different time periods (P<0.05). et sequentia.

2.3 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶的影響

微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性有顯著影響。注射微囊藻毒素2 h內(nèi)超氧化物歧化酶活性顯著上升，并達(dá)到最大值(16.88±0.14) U/mg，比對(duì)照組增加了36.71%(P<0.05)(圖3a)。

圖3 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶及過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effect of MC-LR on activities of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in hepatopancreas of Pacific white shrimp L. vannamei

2 h后，試驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性逐漸降低，至72 h僅為(6.89±0.06) U/mg(P<0.05)。谷胱甘肽過氧化物酶活性變化呈先升后降的趨勢(shì)。凡納濱對(duì)蝦在注射微囊藻毒素8 h內(nèi)，谷胱甘肽過氧化物酶活性逐漸升高，在8 h達(dá)到最大值(273.12±2.39) U/mg，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，隨后逐漸降低，16 h開始顯著低于對(duì)照組，72 h達(dá)到最低值(121.85±1.69) U/mg(P<0.05)(圖3b)。注射微囊藻毒素4 h內(nèi)，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺過氧化氫酶活性明顯升高，并在4 h達(dá)到最大值，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3c)。4 h后過氧化氫酶活性逐漸降低，并在24 h后顯著低于對(duì)照組，72 h達(dá)到最低值(P<0.05)。

3 討 論

3.1 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺氧化損傷的影響

微囊藻毒素是微囊藻屬、魚腥藻屬等藻類產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，常見于淡水養(yǎng)殖池塘。其主要以肝臟為靶器官[28]，破壞水生動(dòng)物肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、引起肝細(xì)胞變形，導(dǎo)致肝功能失調(diào)[29]，并具有時(shí)間—濃度雙重效應(yīng)[30]。微囊藻毒素通過細(xì)胞膜上有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)后[31]，誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧，持續(xù)產(chǎn)生的活性氧攻擊多不飽和脂肪酸并使其氧化，產(chǎn)生醛、醇、酮和環(huán)氧化物等，其中丙二醛是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，丙二醛可攻擊動(dòng)物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)及細(xì)胞膜系統(tǒng)中的不飽和脂肪酸等，誘發(fā)多種病理損傷，危害動(dòng)物機(jī)體健康[32]。其含量高低可以衡量機(jī)體的抗氧化狀態(tài)，同時(shí)也間接反映細(xì)胞損傷水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在注射微囊藻毒素8 h后，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺丙二醛含量顯著升高且持續(xù)上升(P<0.05)，梁花蕾[33]在鯽(Carassiusauratus)飼料中添加藍(lán)藻粉后，鯽肝臟丙二醛含量顯著升高，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。這表明微囊藻毒素進(jìn)入凡納濱對(duì)蝦機(jī)體后，機(jī)體活性氧的產(chǎn)生與清除平衡被打破，細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的雙鍵遭到破壞，從而脂質(zhì)過氧化造成丙二醛含量升高。

3.2 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶的影響

過氧化氫酶是酶促抗氧化反應(yīng)的主要成員，它能迅速分解過氧化氫，避免其與超氧陰離子自由基生成羥基自由基[37]。本試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦在注射微囊藻毒素4 h內(nèi)，過氧化氫酶活性顯著升高(P<0.05)，而超氧化物歧化酶最高活性出現(xiàn)在2 h，主要原因是超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)化超氧陰離子自由基生成大量過氧化氫，過氧化氫含量升高導(dǎo)致機(jī)體過氧化氫酶活性增加以清除過量過氧化氫。4 h后過氧化氫酶活性逐漸降低并在16 h后逐漸低于對(duì)照組，可能與微囊藻毒素造成細(xì)胞內(nèi)活性氧含量過高有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫濃度超過過氧化氫酶清除能力時(shí)，過氧化氫酶的構(gòu)象遭到破壞，活性逐漸降低。此外，活性氧攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而過氧化氫酶作為與細(xì)胞膜相關(guān)的酶[38]，其活性下降可能與細(xì)胞膜受到損傷有關(guān)。試驗(yàn)16 h后超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性逐漸低于對(duì)照組，表明凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷。16 h開始超氧化物歧化酶活性低于對(duì)照組可能與過氧化氫酶活性下降有關(guān)，因?yàn)檫^氧化氫能造成超氧化物歧化酶蛋白氨基酸殘基發(fā)生氧化[39]。超氧化物歧化酶將超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫，過氧化氫酶可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，當(dāng)過氧化氫酶活性下降時(shí)，過氧化氫含量升高，超氧化物歧化酶受到過氧化氫攻擊，導(dǎo)致酶活性下降。

谷胱甘肽過氧化物酶是以谷胱甘肽為底物，將過氧化氫和有機(jī)氫過氧化物還原為無害物質(zhì)的活性酶[40]。本試驗(yàn)在注射微囊藻毒素后，谷胱甘肽過氧化物酶活性在8 h內(nèi)逐漸升高，表明機(jī)體過氧化氫及有機(jī)氫過氧化物含量升高，誘導(dǎo)機(jī)體谷胱甘肽過氧化物酶活性增加。16 h后谷胱甘肽過氧化物酶活性低于對(duì)照組，可能的原因是前期有機(jī)氫過氧化物大量還原消耗過量谷胱甘肽。由于微囊藻毒素能加快谷胱甘肽的消耗并抑制其從頭合成[41]，導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶酶促反應(yīng)底物濃度降低。因此谷胱甘肽濃度降低可能是造成谷胱甘肽過氧化物酶活性下降的原因之一。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶都是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)必不可少的抗氧化酶，在清除活性氧、維護(hù)細(xì)胞氧化還原平衡及阻止或修復(fù)氧化損傷過程中發(fā)揮重要作用[34]。

4 結(jié) 論

注射微囊藻毒素后，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺丙二醛含量逐漸升高，表明脂質(zhì)過氧化反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，微囊藻毒素可以造成對(duì)蝦肝胰腺出現(xiàn)氧化應(yīng)激。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性均為先升后降，表明微囊藻毒素抑制凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化酶活性，對(duì)肝胰腺造成嚴(yán)重的氧化損傷。