唐晟凱，劉燕山，王 華，李大命，張彤晴，孫晶瑩，許 飛，王志浩

( 1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017； 2.江蘇省高寶邵伯湖漁業(yè)管理委員會辦公室，江蘇 揚州 225009； 3.南京易基諾環(huán)?？萍加邢薰荆K 南京 211100 )

在水域生態(tài)系統(tǒng)中，生物有機體可以通過黏液、唾液、尿液、糞便、血液等多種途徑向環(huán)境中釋放DNA。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)(下稱“環(huán)境DNA技術(shù)”)是通過從環(huán)境介質(zhì)中提取DNA，對基因組的特定DNA片段進行PCR擴增和高通量測序，從而實現(xiàn)對生物群落的監(jiān)測[1-3]。環(huán)境DNA技術(shù)最早于20世紀末應(yīng)用于微生物學(xué)研究，主要用于研究微生物的分類及其生化功能[4-5]；自2003年DNA條形碼被標(biāo)準(zhǔn)化以來，該技術(shù)逐步被應(yīng)用于底棲動物、魚類、兩棲動物等不同水生生物的監(jiān)測[6-12]；2015年以后，該技術(shù)開始被大量應(yīng)用于我國的魚類、長江江豚(Neophocaenaasiaeorientalis)、浮游動物等水生生物的監(jiān)測[13-15]。

邵伯湖位于江蘇省揚州市近郊，與高郵湖連通，屬淮河水系，是淮河入長江的通道，水域面積約77 km2，具有漁業(yè)、蓄洪、灌溉等功能。根據(jù)20世紀50年代的調(diào)查，邵伯湖、高郵湖、寶應(yīng)湖有魚類共計70多種[16]。近20年來，其魚類資源受到捕撈作業(yè)、江湖阻隔等人為因素的影響，資源狀況可能發(fā)生了一定的變化。然而近年來，鮮有對邵伯湖魚類資源的公開報道。傳統(tǒng)的魚類監(jiān)測，主要依靠不同的漁具進行樣本采集，過程費時費力，小型或稀有個體難以捕獲，且對魚類具有不同程度的傷害[13,17]。筆者利用邵伯湖水體的環(huán)境DNA樣本進行魚類資源監(jiān)測，不僅可為邵伯湖魚類資源保護以及長江大保護提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且有助于探索高效、對生態(tài)系統(tǒng)干擾小的淡水魚類資源監(jiān)測新方法。

1 材料與方法

1.1 采樣點位設(shè)置

在邵伯湖全湖設(shè)置15個采樣點，其中北部敞水區(qū)、中部敞水區(qū)和南部河道區(qū)分別設(shè)置4個、5個和6個采樣點。采樣點分布見圖1(采樣點簡稱S1～S15)。

圖1 采樣點分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Shaobo Lake

1.2 采樣及樣品前處理

樣品采集于2018年11月7日。在每個采樣點上，用無菌聚丙烯瓶(賽默飛世爾，美國)采集2 L表層水(在水面以下約20 cm處采集)，現(xiàn)場用0.22 μm混合纖維素酯(MCE)濾膜(易基諾，南京)過濾，每張濾膜過濾300 mL水樣，每個點位過濾濾膜5～6張作為平行樣品，過濾后的濾膜用干冰存儲。

1.3 DNA提取

使用DneasyPowerWater Kit(天根，德國)提取濾膜DNA，具體操作如下：將濾膜置于帶有研磨珠的5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL的55 ℃ PW1，均質(zhì)5 min，吸取全部上清液離心1 min；取上清液加入200 μL IRS，渦旋混勻后于4 ℃靜置5 min，離心1 min；取上清液加入650 μL PW3，混勻后過MB Spin Column富集DNA；分別加650 μL PW4和650 μL乙醇清洗，用100 μL EB洗脫。使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度，并于-20 ℃冷凍存儲。

1.4 PCR擴增

線粒體12S rRNA區(qū)域具有高保守性和高可變性，是脊椎動物魚類檢測中常用的引物區(qū)域，該引物提高了魚類環(huán)境DNA擴增能力[18-19]。筆者利用線粒體DNA 12S rRNA引物[18]進行PCR擴增，12S rRNA引物PCR擴增體系：總體系50 μL，包含2×Phusion Master Mix with HF Buffer 25 μL(賽默飛世爾，美國)，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。擴增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，66 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)。同時，利用線粒體COⅠ引物[20]進行魚類PCR擴增對比，反應(yīng)體系與12S rRNA引物一致，反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，48 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。2組體系均設(shè)置PCR陽性和陰性對照，以30種魚類組織混合DNA為陽性對照，ddH2O為PCR陰性對照。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進行目的條帶檢測。使用AMPure XP(貝克曼庫爾特，美國)磁珠純化PCR產(chǎn)物。

1.5 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent試劑盒(NEB，美國)構(gòu)建二代測序文庫后，Agilent 2100檢測DNA文庫質(zhì)量，稀釋DNA文庫至100 pmol/L，利用Ion Proton測序儀進行樣品的二代測序。二代測序數(shù)據(jù)下機后，數(shù)據(jù)分析全部基于Ubuntu 14.04版本下的EcoView軟件。利用EcoView軟件中USEARCH進行物種運算分類單元聚類，基于美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫完成物種注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 12S rRNA引物與COⅠ引物PCR結(jié)果

將同一點位平行樣品混合后分別進行12S rRNA引物和COⅠ引物擴增，PCR結(jié)果見圖2，15個采樣點樣本的2對引物擴增產(chǎn)物中均有目的條帶，且條帶清晰單一，陰性對照無顯著條帶。12S rRNA引物擴增中S3、S4、S8、S9、S12和S14位點擴增效果最好，目的條帶最亮；S1、S2、S6、S10、S13位點擴增效果較好，目的條帶較亮；S5、S7、S11、S15位點擴增效果稍低，目的條帶較暗。15個樣本COⅠ引物擴增的效率基本一致，條帶亮度一致。

圖2 12S rRNA引物與COⅠ引物PCR結(jié)果Fig.2 The results of PCR using mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primers

2.2 12S rRNA引物與COⅠ引物檢測結(jié)果

12S rRNA測序共獲得0.95 Gb數(shù)據(jù)量，2 522 310條序列，過濾低質(zhì)量、序列長度小于80 bp和大于250 bp等數(shù)據(jù)后，獲得140 463條序列。由圖3a可見：注釋到輻鰭魚綱的序列50 427條，占總序列數(shù)36%；注釋到哺乳綱的序列74 147條，占53%；注釋到鳥類的序列2407條，占2%；未注釋出的序列13 482 條，占總序列數(shù)9%。按序列相似性97%進行物種聚類，共獲得171個運算分類單元，其中：71個輻鰭魚綱運算分類單元，占比41%；56個哺乳綱運算分類單元，占比33%；5個鳥類運算分類單元，占比3%；39個運算分類單元未注釋出，占比23%。

圖3 12S rRNA引物與COⅠ引物測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primersa.12S rRNA引物測序序列數(shù)與運算分類單元數(shù)分布； b.COⅠ引物測序序列數(shù)與運算分類單元數(shù)分布.a.the distribution of reads and OTUs using 12S rRNA primers； b.the distribution of Reads and OTUs using COⅠprimers.

線粒體COⅠ測序數(shù)據(jù)過濾低質(zhì)量、序列長度小于200 bp和大于600 bp等數(shù)據(jù)后，獲得291 379條序列。由圖3b可見：注釋到后生動物的序列170 654條，占比最高，約占總序列數(shù)的59%，后生動物中注釋到輻鰭魚綱的序列僅有990條，其他注釋到后生動物的序列總數(shù)為169 664條，主要是節(jié)肢動物、輪蟲和其他脊椎動物等后生動物；共有29 302條序列注釋到綠色植物，約占總序列數(shù)的10%；共有6682條序列注釋到真菌，約占總序列數(shù)的2%；共有84 741條序列未注釋到物種。線粒體COⅠ測序數(shù)據(jù)共注釋出1135個運算分類單元：注釋到后生動物的運算分類單元高達782個，占總運算分類單元數(shù)的69%，后生動物中注釋到輻鰭魚綱的僅有16個；注釋到綠色植物的運算分類單元145個，占總運算分類單元數(shù)的13%；注釋到真菌的運算分類單元72個，占總運算分類單元數(shù)的6%；其他未注釋到物種的運算分類單元136個，占總運算分類單元數(shù)的12%。

2.3 12S rRNA引物與COⅠ引物檢測結(jié)果對比

雖然12S rRNA引物檢測結(jié)果獲得的總序列數(shù)和總運算分類單元數(shù)小于COⅠ引物檢測結(jié)果，但前者注釋到魚類的序列數(shù)和運算分類單元數(shù)明顯高于后者(圖4)。在12S rRNA引物注釋出的171個運算分類單元中，魚類運算分類單元占71個，分屬40個物種；而在COⅠ引物注釋出的1135個運算分類單元中，魚類運算分類單元僅占16個，分屬9個物種。結(jié)果表明，12S rRNA引物對魚類物種的監(jiān)測能力優(yōu)于COⅠ引物。

圖4 12S rRNA引物與COⅠ引物檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of mitochondrial DNA 12S rRNA and COⅠ primersa.2種引物序列數(shù)對比；b.2種引物注釋運算分類單元數(shù)對比a.the number of reads using two primers； b.the number of OTUs and species using two primers.

2.4 12S rRNA引物魚類檢測分析

表1 環(huán)境DNA檢出的魚類種類

圖5 魚類群落組成分析Fig.5 Analysis of fish community compositiona.魚類群落組成；b.注釋的40種魚類序列數(shù)；c.15個采樣位點魚類組成分布.a.fish community composition； b.number of sequences of 40 fish species annotated； c.fish composition distribution in 15 sampling sites.

表2 魚類物種在各采樣位點的分布

3 討 論

3.1 邵伯湖魚類物種檢測

近年來，越來越多的學(xué)者利用環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查湖泊、河流的生物組成[21-24]，筆者利用環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查邵伯湖15個位點的魚類物種多樣性，初步分析邵伯湖魚類資源現(xiàn)狀。利用環(huán)境DNA共監(jiān)測到40種魚類運算分類單元，其中有36種注釋到種，4種注釋到屬。在20世紀50年代的調(diào)查中，邵伯湖、高郵湖、寶應(yīng)湖共計有魚類70多種[16]。由于缺少所有70多種的魚類物種名稱，因此本次監(jiān)測的結(jié)果難以與之進行全面的對比。與當(dāng)時調(diào)查到的主要經(jīng)濟魚類對比，本次未監(jiān)測到的經(jīng)濟魚類有鳊(Parabramispekinensis)、黃鱔(Monopterusalbus)、鰻鱺(Anguillajaponica)3種。由于邵伯湖深度較淺，本次監(jiān)測的監(jiān)測點水深為1.6～2.2 m，環(huán)境DNA比較均質(zhì)，不需要分層取樣。本次監(jiān)測到的魚類中，河川沙塘鱧、小黃黝魚、粘皮鯔蝦虎魚、波氏吻蝦虎魚等為典型的底層魚類[25]。以上3種未監(jiān)測出的魚類中，只有黃鱔為底層魚類。未監(jiān)測到的原因可能是多方面的，如：由于江湖阻隔、過度捕撈等人為因素，洄游性魚類的資源量大大減少等；目前魚類環(huán)境DNA監(jiān)測方法不盡完善[26-27]，且擴增引物具有偏好性[28]，當(dāng)樣本中某些魚類DNA含量較低時，也較難檢出。

3.2 各物種檢測到的序列總數(shù)

3.3 12S rRNA引物和COⅠ引物對魚類監(jiān)測效果的對比

魚類環(huán)境DNA監(jiān)測中，常用線粒體12S rRNA、COⅠ，CYTB和18S r RNA等區(qū)域引物進行擴增，檢測效果尚無一致性結(jié)論。筆者用線粒體12S rRNA和COⅠ引物同時進行擴增，進而對比2種引物對魚類的監(jiān)測效果。結(jié)果顯示，12S rRNA引物檢出的魚類物種數(shù)是COⅠ引物的4.4倍，魚類檢出效果明顯優(yōu)于COⅠ引物。原因可能在于，12S rRNA引物針對脊椎動物設(shè)計，在脊椎動物中更加保守，容易擴增。COⅠ引物主要針對動物類群設(shè)計[32]，而環(huán)境DNA中魚類DNA含量極少，且后生動物DNA含量極高，該引物會優(yōu)先偏好性地擴增浮游動物[33-34]、大型底棲無脊椎動物[35]等后生動物。因此，12S rRNA引物更適合應(yīng)用于淡水魚類的環(huán)境DNA監(jiān)測。

3.4 環(huán)境DNA技術(shù)在湖泊魚類資源監(jiān)測中的應(yīng)用前景

環(huán)境DNA技術(shù)為淡水魚類資源監(jiān)測、物種多樣性評價等提供了新的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。相比傳統(tǒng)的監(jiān)測方法，運用環(huán)境DNA技術(shù)具有以下主要優(yōu)勢：采樣過程簡單，需要的人力與時間成本較低，且對生境無破壞，無需接觸魚體，可應(yīng)用于難以進行傳統(tǒng)捕撈監(jiān)測的水域(如已實施全面禁捕的水域、生態(tài)系統(tǒng)比較脆弱的水域等)；不依賴物種鑒定專家，減少了物種鑒定中的主觀差異；靈敏度高，對不易捕獲或稀有種類的監(jiān)測效果較好。運用環(huán)境DNA技術(shù)進行魚類資源監(jiān)測仍存在一些局限，如缺乏技術(shù)規(guī)范、少數(shù)近緣物種因序列相似而難以區(qū)分以及無法反映魚類的生理狀態(tài)、生長發(fā)育階段等生物學(xué)特征等。

因此，在現(xiàn)階段的淡水魚類資源監(jiān)測中，環(huán)境DNA技術(shù)宜與傳統(tǒng)的監(jiān)測方法結(jié)合使用，同時仍需對該技術(shù)進行不斷的發(fā)展與完善。

4 結(jié) 論