朱興華，王金龍，袁廷柱，馮艷微，李 贊，徐曉輝，王衛(wèi)軍，孫國華，楊建敏

( 1.上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 2.山東省海洋生態(tài)資源重點修復實驗室，山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006； 3.上海海洋大學，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 4.長島綜合試驗區(qū)海洋經(jīng)濟促進中心，山東 煙臺 265800； 5.魯東大學 農(nóng)學院，山東 煙臺 264025 )

水產(chǎn)養(yǎng)殖中細菌性疾病普遍存在，而且危害極大。弧菌病和愛德華氏菌病是養(yǎng)殖動物?；嫉募毦约膊?。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是一種能夠感染貝類和魚類等水產(chǎn)動物的條件性致病菌，其通過損傷皮膚繼而感染水產(chǎn)動物，發(fā)病快、傳染性強、死亡率高[1]；遲鈍愛德華氏菌(Edwardiantarda)是對水產(chǎn)動物最具危害的病原菌之一，其含有大量致病因子，可經(jīng)血液傳播到各組織器官，引起感染，嚴重時可導致個體死亡。

短蛸(Octopusocellatus)主要棲居于溫帶偏北海域，是我國北方沿海漁業(yè)重要的經(jīng)濟物種之一[2]，具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值，市場前景廣闊[3]。目前，短蛸的人工繁育和養(yǎng)殖處于初步階段，尚未形成一定的規(guī)模化[4-5]。在養(yǎng)殖過程中易感染弧菌屬、愛德華氏菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等細菌[6-7]，給短蛸養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)。研究鰻弧菌、愛德華氏菌等細菌對短蛸的致病機理，對養(yǎng)殖過程中病原菌的診斷與防治具有重要意義。

肝臟(肝胰腺)作為軟體動物中重要的代謝和免疫相關(guān)組織，在營養(yǎng)攝取、激素合成和碳氮代謝中起主要作用，同時參與病原體清除、抗原加工以及病原菌感染宿主所引起的代謝變化[8]。肝臟在頭足類中發(fā)育良好，占胸腔的絕大部分[9]。研究發(fā)現(xiàn)，當短蛸感染了鰻弧菌和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)后，2種弧菌均可破壞短蛸肝臟的組織結(jié)構(gòu)和細胞結(jié)構(gòu)，導致肝功能損害，加速短蛸死亡[10]。微生物及其代謝物質(zhì)在維持宿主生理生命活動穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，它形成了一個動態(tài)平衡系統(tǒng)，可抵抗病原菌的侵染，有利于機體正常生命活動的進行[11]。當病原菌入侵宿主時，會抑制或損害宿主共生微生物群落中的某些成員，對微生物菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響[12]，導致生物體的自我調(diào)節(jié)能力發(fā)生紊亂，產(chǎn)生病變。病原菌對宿主微生物菌群影響方面的研究主要集中在腸道組織[13-16]方面。而無脊椎動物的肝臟中也存在著非致病性的共生菌，對宿主的抗病性和免疫功能有一定的影響[8]。目前病原菌對肝臟菌群的影響在文蛤(Meretrixmeretrix)中有過相關(guān)研究[8]，而在短蛸中尚未見報道。

筆者利用16S rRNA基因擴增子技術(shù)檢測短蛸肝臟的菌群結(jié)構(gòu)，分析鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌感染后肝臟菌群結(jié)構(gòu)的變化，以期為今后短蛸養(yǎng)殖過程中細菌性疾病的準確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

短蛸于2019年11月采自山東煙臺東方海洋基地附近海域，共66只，體質(zhì)量(60±5) g，體長(15±2) cm，暫養(yǎng)于70 cm×60 cm×50 cm恒溫水箱中，水溫21 ℃，每日更換新鮮海水，空腹7 d待穩(wěn)定后進行試驗。

1.2 病原菌分離與培養(yǎng)

取養(yǎng)殖水樣通過2216E固體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)，挑取單克隆擴大培養(yǎng)后進行16S rRNA基因測序和菌種鑒定，得到鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌2種菌株。將2種菌株分別置于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，細菌沉淀離心后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，最后稀釋成1.01×1010cfu/mL的鰻弧菌懸液和1.47×109cfu/mL的遲鈍愛德華氏菌懸液，備用。

1.3 注菌及取材

試驗分為A、B、C組，每組15只短蛸。A組每只腹腔注射鰻弧菌懸液200 μL，B組每只腹腔注射等劑量的遲鈍愛德華氏菌懸液，C組每只腹腔注射等劑量磷酸緩沖鹽溶液作為對照。每日觀察各組短蛸的行為和生理變化，記錄死亡情況，找到半致死的時間點。

另設(shè)鰻弧菌組和遲鈍愛德華氏菌組，每組8只短蛸，分別在腹腔注射鰻弧菌懸液和遲鈍愛德華氏菌懸液，達到半致死時間點時，各組隨機挑選存活短蛸3只，取肝臟組織放入-80 ℃冰箱中保存。對照組無死亡，隨機取3只短蛸的肝臟組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)擴增

利用CTAB法提取肝臟組織DNA。選擇16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域作為擴增和測序的目的片段，引物序列為：

341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG；

805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCA。

合成帶有標簽序列的特異性引物。PCR擴增共兩輪，第一輪反應體系為20 μL：2×Taq master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA取10～20 ng，加無菌水定容至20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。第二輪的反應體系為30 μL：2×Taq master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，上一輪的PCR產(chǎn)物20 ng，加無菌水定容至30 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，選擇長度在400～450 bp的條帶，使用GeneJET膠回收試劑盒進行回收純化。

1.5 文庫構(gòu)建及Illumina MiSeq測序

使用NEB DNA建庫試劑盒進行DNA文庫構(gòu)建，構(gòu)建文庫完成經(jīng)Qubit定量和檢驗合格后，采用Illumina MiSeq測序平臺進行上機測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)剔除非特異性擴增序列及嵌合體之后獲得有效序列；按照有效序列之間的距離進行聚類，根據(jù)序列間的相似性劃分不同的運算分類單元(OTU)，通常情況對97%相似水平下的運算分類單元進行生物信息統(tǒng)計分析；利用R的Venn Diagram功能制作韋恩圖展現(xiàn)樣品的運算分類單元數(shù)目的相似性和組間重疊情況。使用Mothur軟件計算每組樣品的Alpha多樣性指數(shù)；利用R軟件制作稀疏性曲線圖。利用RDP Classifier貝葉斯算法對運算分類單元進行物種分類，統(tǒng)計每個樣品在不同分類層級水平上的群落組成，利用R進行作圖；利用PICRUSt軟件預測短蛸肝臟菌群功能。

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

測序共產(chǎn)生217 287條質(zhì)控后序列，其中對照組、鰻弧菌組和遲鈍愛德華氏菌組的質(zhì)控后序列分別為78 155、59 159和79 973條，序列長度為421.80～428.53 bp，除去嵌合體以及非特異性擴增序列后，對照組、鰻弧菌組和遲鈍愛德華氏菌組的剩余序列數(shù)目分別為74 082、58 759和72 464條(表1)。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)

2.2 運算分類單元分布韋恩圖

樣品間運算分類單元數(shù)目組成相似性及其重疊情況見圖1。3組共有的運算分類單元為141個，對照組特有的運算分類單元為1834個，鰻弧菌組特有的運算分類單元為870個，遲鈍愛德華氏菌組特有的運算分類單元為2207個。對照組與遲鈍愛德華氏菌組共有的運算分類單元為373個，對照組與鰻弧菌組共有的運算分類單元為166個，遲鈍愛德華氏菌組和鰻弧菌組共有的運算分類單元為200個。

圖1 運算分類單元樣品分布韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs distribution among samples不同樣品用不同顏色表示，圖中數(shù)字代表特異或共有的運算分類單元數(shù).Different samples are shown in different colors. The numbers in the diagram represent specific or common OTUs.

2.3 多樣性指數(shù)分析

Alpha指數(shù)可以反映微生物群落的多樣性和豐度，其中Chao1指數(shù)預估群落分布豐度，香農(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)預估樣品中微生物的多樣性。對照組的Chao1指數(shù)為21 460.22，遲鈍愛德華氏菌組為9196.04，鰻弧菌組為5550.49，表明對照組群落豐度最大，鰻弧菌組群落豐度最?。幌戕r(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)，對照組為4.78、0.03，遲鈍愛德華氏菌組為4.09、0.09，鰻弧菌組為0.45、0.91，表明對照組的群落多樣性最高，其次是遲鈍愛德華氏菌組，鰻弧菌組最低(表2)。3組樣品的文庫覆蓋率達到0.98，以香農(nóng)指數(shù)構(gòu)建的稀釋性曲線趨于平緩(圖2)，說明各組樣品測序數(shù)據(jù)數(shù)量合理，可以較為全面地體現(xiàn)樣本中微生物菌群的組成情況。

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

圖2 各組樣品稀釋性曲線Fig.2 Dilution curve of samples in each group

2.4 菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在門水平上3組樣本的菌群結(jié)構(gòu)組成見圖3。對照組的核心菌門(相對豐度>1%)是變形菌門(46.2%)、擬桿菌門(13.32%)、軟壁菌門(9.03%)、厚壁菌門(7.9%)、酸桿菌門(5.76%)、浮霉菌門(3%)和放線菌門(2.62%)；遲鈍愛德華氏菌組的核心菌門為變形菌門(43.33%)、軟壁菌門(31.33%)、厚壁菌門(16.5%)和放線菌門(2.59%)；鰻弧菌組的核心菌門是軟壁菌門(95.95%)和變形菌門(2.2%)。對照組的變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門等相對豐度高于其他2組；而遲鈍愛德華氏菌組的變形菌門相對豐度高于鰻弧菌組，厚壁菌門相對豐度高于其他2組；鰻弧菌組只有軟壁菌門相對豐度遠高于其他2組(圖4)。

圖3 門水平上樣本的群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 The distribution diagram of the community structure of all samples at the phylum level.

圖4 門水平上樣本相對豐度對比Fig.4 Comparison of relative abundance of samples at phylum level

屬水平上3組樣本的菌群結(jié)構(gòu)組成見圖5。對照組的核心菌屬由支原體屬(Mycoplasma,9.01%)、短波單胞菌屬(Brevundimonas,5.74%)、Gp4(5.16%)、假單胞菌屬(4.26%)、硫氧化湖沉積桿菌屬(Limnobacter，2.29%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium,1.73%)和狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto,1.07%)構(gòu)成；遲鈍愛德華氏菌組中豐度較高的屬依次為支原體屬(31.28%)、乳球菌屬(Lactococcus, 9.49%)、腸桿菌屬(Enterobacter, 6.07%)、短波單胞菌屬(3.71%)、假單胞菌屬(Pseudomonas, 3.44%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella, 2.06%)；鰻弧菌組核心菌屬為支原體屬(95.94%)。遲鈍愛德華氏菌組與鰻弧菌組均未發(fā)現(xiàn)Gp4屬。對照組未分類占37.4%，遲鈍愛德華氏菌組未分類占12.7%，鰻弧菌組未分類占1.15%。對照組唯有未分類菌屬相對豐度明顯高于其他2組；遲鈍愛德華氏菌組的乳球菌屬以及腸桿菌屬相對豐度高于其他2組；而鰻弧菌組的支原體屬相對豐度遠遠超過其他2組(圖6)。

圖5 屬水平上所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布Fig.5 The distribution diagram of the community structure of all samples at the genus level

圖6 屬水平上樣本相對豐度對比Fig.6 Comparison of relative abundance of samples at genus level

2.5 菌群分布組成差異

根據(jù)3組樣本中豐度最高的前50個物種的分類信息繪制的聚類分析見圖7。對照組和遲鈍愛德華氏菌組的物種豐度較接近，鰻弧菌組差異較大。對照組與遲鈍愛德華氏菌組聚成一支，鰻弧菌組單獨聚成一支，說明對照組和遲鈍愛德華氏菌組菌群分布較類似，距離較近。

圖7 屬水平物種豐度聚類分析熱圖Fig.7 The heat map of species abundance clustering at the genus level

2.6 菌群功能預測

PICRUSt分析表明，對照組預測的功能基因可注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中4條第一層級功能通路以及17條第二層級功能通路，其中包括：新陳代謝(相對豐度為49.86%)類通路中的氨基酸代謝(10.35%)、碳水化合物代謝(9.89%)、能量代謝(5.96%)、輔助因子和維生素代謝(4.22%)、脂質(zhì)代謝(3.71%)、核苷酸代謝(3.42%)、外源生物降解和代謝(3.16%)、聚糖的生物合成和代謝(2.18%)、萜類化合物與聚酮類化合物的代謝(2.10%)、其他氨基酸代謝(1.90%)等；遺傳信息處理(17.09%)類通路中的復制與修復(7.50%)，翻譯(4.79%)，折疊、分選與降解 (2.43%)，轉(zhuǎn)錄(2.38%)；環(huán)境信息處理(12.47%)類通路中的膜轉(zhuǎn)運(9.98%)、信號轉(zhuǎn)導(2.31%)；細胞進程(4.43%)類通路中的細胞運動(3.49%)(圖8)。

圖8 基于KEGG的功能結(jié)構(gòu)分布Fig.8 The histogram of function structure distribution based on KEGG

鰻弧菌組與遲鈍愛德華氏菌組注釋到了與對照組相同的第一層級與第二層級功能通路，但各功能豐度普遍低于對照組正常水平。其中鰻弧菌組細胞進程類通路的細胞運動功能豐度為172 676，與對照組對比下降92.62%；新陳代謝類通路的外源生物降解和代謝功能豐度為252 854，下降88.06%，氨基酸代謝功能豐度下降79.64%，環(huán)境信息處理類通路的信號轉(zhuǎn)導功能豐度下降92.78%，遺傳信息處理類通路中的轉(zhuǎn)錄功能豐度下降69.74%；遲鈍愛德華氏菌組新陳代謝類通路的氨基酸代謝功能豐度下降25.36%，細胞進程類通路的細胞運動功能豐度下降26.09%(圖9)。

圖9 基于KEGG的功能組成和豐度對比Fig.9 The histogram of function composition and abundance comparison based on KEGG

3 討 論

隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，以16S rRNA基因擴增子測序技術(shù)為代表的高通量測序逐漸取代了傳統(tǒng)的分子生物學分析手段，廣泛應用到各種組織菌群的研究[17-18]，為全面探索微生物菌群結(jié)構(gòu)及群落差異指明了新方向。筆者首次采用16S rRNA基因擴增子測序法探究短蛸肝臟菌群多樣性與功能，并對遲鈍愛德華氏菌和鰻弧菌感染后肝臟菌群的結(jié)構(gòu)變化進行了分析，以期為短蛸養(yǎng)殖過程中細菌性疾病的準確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。

3.1 菌群豐度與多樣性影響

試驗結(jié)果顯示：遲鈍愛德華氏菌組與對照組共有的運算分類單元為373個，鰻弧菌組與對照組共有的運算分類單元為166個；聚類分析熱圖中，對照組與遲鈍愛德華氏菌組聚成一支，鰻弧菌組單獨聚成一支。由此可知，遲鈍愛德華氏菌組與對照組的菌群組成較為相近，而鰻弧菌組與其他兩組差異較大，表明鰻弧菌相比愛德華氏菌，對肝臟菌群產(chǎn)生了更大的影響。對照組肝臟菌群的豐度和多樣性最高，遲鈍愛德華氏菌組次之，鰻弧菌組最少。這種變化可能是由于病菌的入侵改變了細菌群落的組成與種間相互作用，從而改變微生物介導的功能，影響了宿主的免疫應答，宿主的自我調(diào)節(jié)能力紊亂，發(fā)生病變。細菌感染后，宿主共生菌多樣性降低與宿主健康受損的相關(guān)性在許多研究中均有發(fā)現(xiàn)[19-20]。

3.2 不同水平上優(yōu)勢菌群影響

門水平上細菌分類結(jié)果顯示，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是短蛸肝臟的核心菌門。這與文蛤肝臟中的優(yōu)勢菌群組成相似，文蛤肝臟的優(yōu)勢菌群依次為放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門[8]。以上細菌同時也是白甲魚(Onychostomasima)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)等多種水產(chǎn)動物腸道中的優(yōu)勢菌群[21-23]。本試驗中，變形菌門是短蛸肝臟中最優(yōu)勢的細菌類群，其中包含了γ-變形菌綱的短波單胞菌屬、假單胞菌屬，α-變形菌綱的甲基桿菌屬，β-變形菌綱的硫氧化湖沉積桿菌屬等。此外，厚壁菌門的狹義梭菌屬也是短蛸肝臟的優(yōu)勢菌屬。短波單胞菌屬和假單胞菌屬常被報道為各種對蝦腸道中共有的優(yōu)勢菌屬[24]；狹義梭菌屬被報道是鱧屬(Channa)魚類和團頭魴(Megalobramaamblycephala)等腸道的優(yōu)勢菌屬[25-26]。說明短蛸肝臟菌群和以上水生動物腸道菌群存在一定的共性。

屬水平上細菌分類結(jié)果顯示，對照組的核心菌屬中支原體屬占9.01%，經(jīng)過菌感染后，試驗組支原體屬豐度激增，在鰻弧菌組中占95.94%。在弧菌感染文蛤的試驗中同樣出現(xiàn)了支原體激增的狀況[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，短蛸在注射鰻弧菌后，肝臟組織出現(xiàn)了部分細胞膜溶解，細胞界限模糊，脂肪顆粒及細胞質(zhì)外溢，甚至細胞核和部分細胞器破裂溶解的現(xiàn)象[13]。筆者推測，原因可能是激增的支原體通過黏附作用與宿主細胞結(jié)合，獲取細胞膜中的脂質(zhì)和膽固醇，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)。

3.3 PICRUSt功能預測影響

PICRUSt預測結(jié)果顯示，短蛸肝臟菌群主要的功能與新陳代謝類功能有關(guān)，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝等，表明肝臟菌群能夠參與短蛸的代謝活動。狹義梭菌屬是短蛸肝臟的優(yōu)勢菌屬。研究表明，狹義梭菌屬細菌可以利用發(fā)酵糖類和碳水化合物，提供機體所需能量，促進生長、增強免疫功能和抗癌功能[27-28]。本試驗結(jié)果表明，肝臟菌群在短蛸的生理活動中發(fā)揮著十分重要的作用。注射病菌后，各代謝通路以及細胞其他基礎(chǔ)生命活動功能通路豐度都有所降低，表明當菌群結(jié)構(gòu)遭到破壞后，肝臟的生理機能也相應受損。

4 結(jié) 論

短蛸肝臟具有穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)，在短蛸的日常代謝活動中發(fā)揮一定的作用。當受到鰻弧菌與愛德華氏菌侵染后，肝臟菌群的多樣性與豐度均發(fā)生變化。與對照組相比，愛德華氏菌組菌群結(jié)構(gòu)變化較小，鰻弧菌組變化較大，表明鰻弧菌對短蛸肝臟的菌群結(jié)構(gòu)破壞更大。研究結(jié)果可豐富和拓展短蛸肝臟菌群的基礎(chǔ)研究，并為短蛸養(yǎng)殖過程中細菌性疾病的準確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。