朱興華，王金龍，袁廷柱，馮艷微，李 贊，徐曉輝，王衛(wèi)軍，孫國(guó)華，楊建敏

( 1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.山東省海洋生態(tài)資源重點(diǎn)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006； 3.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 4.長(zhǎng)島綜合試驗(yàn)區(qū)海洋經(jīng)濟(jì)促進(jìn)中心，山東 煙臺(tái) 265800； 5.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025 )

水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病普遍存在，而且危害極大?；【『蛺?ài)德華氏菌病是養(yǎng)殖動(dòng)物?；嫉募?xì)菌性疾病。鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是一種能夠感染貝類和魚(yú)類等水產(chǎn)動(dòng)物的條件性致病菌，其通過(guò)損傷皮膚繼而感染水產(chǎn)動(dòng)物，發(fā)病快、傳染性強(qiáng)、死亡率高[1]；遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardiantarda)是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物最具危害的病原菌之一，其含有大量致病因子，可經(jīng)血液傳播到各組織器官，引起感染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致個(gè)體死亡。

短蛸(Octopusocellatus)主要棲居于溫帶偏北海域，是我國(guó)北方沿海漁業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)物種之一[2]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊[3]。目前，短蛸的人工繁育和養(yǎng)殖處于初步階段，尚未形成一定的規(guī)模化[4-5]。在養(yǎng)殖過(guò)程中易感染弧菌屬、愛(ài)德華氏菌屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等細(xì)菌[6-7]，給短蛸養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。研究鰻弧菌、愛(ài)德華氏菌等細(xì)菌對(duì)短蛸的致病機(jī)理，對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中病原菌的診斷與防治具有重要意義。

肝臟(肝胰腺)作為軟體動(dòng)物中重要的代謝和免疫相關(guān)組織，在營(yíng)養(yǎng)攝取、激素合成和碳氮代謝中起主要作用，同時(shí)參與病原體清除、抗原加工以及病原菌感染宿主所引起的代謝變化[8]。肝臟在頭足類中發(fā)育良好，占胸腔的絕大部分[9]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)短蛸感染了鰻弧菌和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)后，2種弧菌均可破壞短蛸肝臟的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝功能損害，加速短蛸死亡[10]。微生物及其代謝物質(zhì)在維持宿主生理生命活動(dòng)穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，它形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)，可抵抗病原菌的侵染，有利于機(jī)體正常生命活動(dòng)的進(jìn)行[11]。當(dāng)病原菌入侵宿主時(shí)，會(huì)抑制或損害宿主共生微生物群落中的某些成員，對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響[12]，導(dǎo)致生物體的自我調(diào)節(jié)能力發(fā)生紊亂，產(chǎn)生病變。病原菌對(duì)宿主微生物菌群影響方面的研究主要集中在腸道組織[13-16]方面。而無(wú)脊椎動(dòng)物的肝臟中也存在著非致病性的共生菌，對(duì)宿主的抗病性和免疫功能有一定的影響[8]。目前病原菌對(duì)肝臟菌群的影響在文蛤(Meretrixmeretrix)中有過(guò)相關(guān)研究[8]，而在短蛸中尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者利用16S rRNA基因擴(kuò)增子技術(shù)檢測(cè)短蛸肝臟的菌群結(jié)構(gòu)，分析鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌感染后肝臟菌群結(jié)構(gòu)的變化，以期為今后短蛸養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌性疾病的準(zhǔn)確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

短蛸于2019年11月采自山東煙臺(tái)東方海洋基地附近海域，共66只，體質(zhì)量(60±5) g，體長(zhǎng)(15±2) cm，暫養(yǎng)于70 cm×60 cm×50 cm恒溫水箱中，水溫21 ℃，每日更換新鮮海水，空腹7 d待穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 病原菌分離與培養(yǎng)

取養(yǎng)殖水樣通過(guò)2216E固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序和菌種鑒定，得到鰻弧菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌2種菌株。將2種菌株分別置于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，細(xì)菌沉淀離心后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，最后稀釋成1.01×1010cfu/mL的鰻弧菌懸液和1.47×109cfu/mL的遲鈍愛(ài)德華氏菌懸液，備用。

1.3 注菌及取材

試驗(yàn)分為A、B、C組，每組15只短蛸。A組每只腹腔注射鰻弧菌懸液200 μL，B組每只腹腔注射等劑量的遲鈍愛(ài)德華氏菌懸液，C組每只腹腔注射等劑量磷酸緩沖鹽溶液作為對(duì)照。每日觀察各組短蛸的行為和生理變化，記錄死亡情況，找到半致死的時(shí)間點(diǎn)。

另設(shè)鰻弧菌組和遲鈍愛(ài)德華氏菌組，每組8只短蛸，分別在腹腔注射鰻弧菌懸液和遲鈍愛(ài)德華氏菌懸液，達(dá)到半致死時(shí)間點(diǎn)時(shí)，各組隨機(jī)挑選存活短蛸3只，取肝臟組織放入-80 ℃冰箱中保存。對(duì)照組無(wú)死亡，隨機(jī)取3只短蛸的肝臟組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)擴(kuò)增

利用CTAB法提取肝臟組織DNA。選擇16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域作為擴(kuò)增和測(cè)序的目的片段，引物序列為：

341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG；

805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCA。

合成帶有標(biāo)簽序列的特異性引物。PCR擴(kuò)增共兩輪，第一輪反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA取10～20 ng，加無(wú)菌水定容至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。第二輪的反應(yīng)體系為30 μL：2×Taq master Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，上一輪的PCR產(chǎn)物20 ng，加無(wú)菌水定容至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，選擇長(zhǎng)度在400～450 bp的條帶，使用GeneJET膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建及Illumina MiSeq測(cè)序

使用NEB DNA建庫(kù)試劑盒進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建文庫(kù)完成經(jīng)Qubit定量和檢驗(yàn)合格后，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)剔除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體之后獲得有效序列；按照有效序列之間的距離進(jìn)行聚類，根據(jù)序列間的相似性劃分不同的運(yùn)算分類單元(OTU)，通常情況對(duì)97%相似水平下的運(yùn)算分類單元進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析；利用R的Venn Diagram功能制作韋恩圖展現(xiàn)樣品的運(yùn)算分類單元數(shù)目的相似性和組間重疊情況。使用Mothur軟件計(jì)算每組樣品的Alpha多樣性指數(shù)；利用R軟件制作稀疏性曲線圖。利用RDP Classifier貝葉斯算法對(duì)運(yùn)算分類單元進(jìn)行物種分類，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在不同分類層級(jí)水平上的群落組成，利用R進(jìn)行作圖；利用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)短蛸肝臟菌群功能。

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

測(cè)序共產(chǎn)生217 287條質(zhì)控后序列，其中對(duì)照組、鰻弧菌組和遲鈍愛(ài)德華氏菌組的質(zhì)控后序列分別為78 155、59 159和79 973條，序列長(zhǎng)度為421.80～428.53 bp，除去嵌合體以及非特異性擴(kuò)增序列后，對(duì)照組、鰻弧菌組和遲鈍愛(ài)德華氏菌組的剩余序列數(shù)目分別為74 082、58 759和72 464條(表1)。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2 運(yùn)算分類單元分布韋恩圖

樣品間運(yùn)算分類單元數(shù)目組成相似性及其重疊情況見(jiàn)圖1。3組共有的運(yùn)算分類單元為141個(gè)，對(duì)照組特有的運(yùn)算分類單元為1834個(gè)，鰻弧菌組特有的運(yùn)算分類單元為870個(gè)，遲鈍愛(ài)德華氏菌組特有的運(yùn)算分類單元為2207個(gè)。對(duì)照組與遲鈍愛(ài)德華氏菌組共有的運(yùn)算分類單元為373個(gè)，對(duì)照組與鰻弧菌組共有的運(yùn)算分類單元為166個(gè)，遲鈍愛(ài)德華氏菌組和鰻弧菌組共有的運(yùn)算分類單元為200個(gè)。

圖1 運(yùn)算分類單元樣品分布韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs distribution among samples不同樣品用不同顏色表示，圖中數(shù)字代表特異或共有的運(yùn)算分類單元數(shù).Different samples are shown in different colors. The numbers in the diagram represent specific or common OTUs.

2.3 多樣性指數(shù)分析

Alpha指數(shù)可以反映微生物群落的多樣性和豐度，其中Chao1指數(shù)預(yù)估群落分布豐度，香農(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)預(yù)估樣品中微生物的多樣性。對(duì)照組的Chao1指數(shù)為21 460.22，遲鈍愛(ài)德華氏菌組為9196.04，鰻弧菌組為5550.49，表明對(duì)照組群落豐度最大，鰻弧菌組群落豐度最?。幌戕r(nóng)指數(shù)與辛普森指數(shù)，對(duì)照組為4.78、0.03，遲鈍愛(ài)德華氏菌組為4.09、0.09，鰻弧菌組為0.45、0.91，表明對(duì)照組的群落多樣性最高，其次是遲鈍愛(ài)德華氏菌組，鰻弧菌組最低(表2)。3組樣品的文庫(kù)覆蓋率達(dá)到0.98，以香農(nóng)指數(shù)構(gòu)建的稀釋性曲線趨于平緩(圖2)，說(shuō)明各組樣品測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量合理，可以較為全面地體現(xiàn)樣本中微生物菌群的組成情況。

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖2 各組樣品稀釋性曲線Fig.2 Dilution curve of samples in each group

2.4 菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在門(mén)水平上3組樣本的菌群結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)圖3。對(duì)照組的核心菌門(mén)(相對(duì)豐度>1%)是變形菌門(mén)(46.2%)、擬桿菌門(mén)(13.32%)、軟壁菌門(mén)(9.03%)、厚壁菌門(mén)(7.9%)、酸桿菌門(mén)(5.76%)、浮霉菌門(mén)(3%)和放線菌門(mén)(2.62%)；遲鈍愛(ài)德華氏菌組的核心菌門(mén)為變形菌門(mén)(43.33%)、軟壁菌門(mén)(31.33%)、厚壁菌門(mén)(16.5%)和放線菌門(mén)(2.59%)；鰻弧菌組的核心菌門(mén)是軟壁菌門(mén)(95.95%)和變形菌門(mén)(2.2%)。對(duì)照組的變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等相對(duì)豐度高于其他2組；而遲鈍愛(ài)德華氏菌組的變形菌門(mén)相對(duì)豐度高于鰻弧菌組，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度高于其他2組；鰻弧菌組只有軟壁菌門(mén)相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其他2組(圖4)。

圖3 門(mén)水平上樣本的群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 The distribution diagram of the community structure of all samples at the phylum level.

圖4 門(mén)水平上樣本相對(duì)豐度對(duì)比Fig.4 Comparison of relative abundance of samples at phylum level

屬水平上3組樣本的菌群結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)圖5。對(duì)照組的核心菌屬由支原體屬(Mycoplasma,9.01%)、短波單胞菌屬(Brevundimonas,5.74%)、Gp4(5.16%)、假單胞菌屬(4.26%)、硫氧化湖沉積桿菌屬(Limnobacter，2.29%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium,1.73%)和狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto,1.07%)構(gòu)成；遲鈍愛(ài)德華氏菌組中豐度較高的屬依次為支原體屬(31.28%)、乳球菌屬(Lactococcus, 9.49%)、腸桿菌屬(Enterobacter, 6.07%)、短波單胞菌屬(3.71%)、假單胞菌屬(Pseudomonas, 3.44%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella, 2.06%)；鰻弧菌組核心菌屬為支原體屬(95.94%)。遲鈍愛(ài)德華氏菌組與鰻弧菌組均未發(fā)現(xiàn)Gp4屬。對(duì)照組未分類占37.4%，遲鈍愛(ài)德華氏菌組未分類占12.7%，鰻弧菌組未分類占1.15%。對(duì)照組唯有未分類菌屬相對(duì)豐度明顯高于其他2組；遲鈍愛(ài)德華氏菌組的乳球菌屬以及腸桿菌屬相對(duì)豐度高于其他2組；而鰻弧菌組的支原體屬相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他2組(圖6)。

圖5 屬水平上所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布Fig.5 The distribution diagram of the community structure of all samples at the genus level

圖6 屬水平上樣本相對(duì)豐度對(duì)比Fig.6 Comparison of relative abundance of samples at genus level

2.5 菌群分布組成差異

根據(jù)3組樣本中豐度最高的前50個(gè)物種的分類信息繪制的聚類分析見(jiàn)圖7。對(duì)照組和遲鈍愛(ài)德華氏菌組的物種豐度較接近，鰻弧菌組差異較大。對(duì)照組與遲鈍愛(ài)德華氏菌組聚成一支，鰻弧菌組單獨(dú)聚成一支，說(shuō)明對(duì)照組和遲鈍愛(ài)德華氏菌組菌群分布較類似，距離較近。

圖7 屬水平物種豐度聚類分析熱圖Fig.7 The heat map of species abundance clustering at the genus level

2.6 菌群功能預(yù)測(cè)

PICRUSt分析表明，對(duì)照組預(yù)測(cè)的功能基因可注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中4條第一層級(jí)功能通路以及17條第二層級(jí)功能通路，其中包括：新陳代謝(相對(duì)豐度為49.86%)類通路中的氨基酸代謝(10.35%)、碳水化合物代謝(9.89%)、能量代謝(5.96%)、輔助因子和維生素代謝(4.22%)、脂質(zhì)代謝(3.71%)、核苷酸代謝(3.42%)、外源生物降解和代謝(3.16%)、聚糖的生物合成和代謝(2.18%)、萜類化合物與聚酮類化合物的代謝(2.10%)、其他氨基酸代謝(1.90%)等；遺傳信息處理(17.09%)類通路中的復(fù)制與修復(fù)(7.50%)，翻譯(4.79%)，折疊、分選與降解 (2.43%)，轉(zhuǎn)錄(2.38%)；環(huán)境信息處理(12.47%)類通路中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)(9.98%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(2.31%)；細(xì)胞進(jìn)程(4.43%)類通路中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(3.49%)(圖8)。

圖8 基于KEGG的功能結(jié)構(gòu)分布Fig.8 The histogram of function structure distribution based on KEGG

鰻弧菌組與遲鈍愛(ài)德華氏菌組注釋到了與對(duì)照組相同的第一層級(jí)與第二層級(jí)功能通路，但各功能豐度普遍低于對(duì)照組正常水平。其中鰻弧菌組細(xì)胞進(jìn)程類通路的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能豐度為172 676，與對(duì)照組對(duì)比下降92.62%；新陳代謝類通路的外源生物降解和代謝功能豐度為252 854，下降88.06%，氨基酸代謝功能豐度下降79.64%，環(huán)境信息處理類通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能豐度下降92.78%，遺傳信息處理類通路中的轉(zhuǎn)錄功能豐度下降69.74%；遲鈍愛(ài)德華氏菌組新陳代謝類通路的氨基酸代謝功能豐度下降25.36%，細(xì)胞進(jìn)程類通路的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能豐度下降26.09%(圖9)。

圖9 基于KEGG的功能組成和豐度對(duì)比Fig.9 The histogram of function composition and abundance comparison based on KEGG

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)為代表的高通量測(cè)序逐漸取代了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)分析手段，廣泛應(yīng)用到各種組織菌群的研究[17-18]，為全面探索微生物菌群結(jié)構(gòu)及群落差異指明了新方向。筆者首次采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序法探究短蛸肝臟菌群多樣性與功能，并對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌和鰻弧菌感染后肝臟菌群的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了分析，以期為短蛸養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌性疾病的準(zhǔn)確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。

3.1 菌群豐度與多樣性影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示：遲鈍愛(ài)德華氏菌組與對(duì)照組共有的運(yùn)算分類單元為373個(gè)，鰻弧菌組與對(duì)照組共有的運(yùn)算分類單元為166個(gè)；聚類分析熱圖中，對(duì)照組與遲鈍愛(ài)德華氏菌組聚成一支，鰻弧菌組單獨(dú)聚成一支。由此可知，遲鈍愛(ài)德華氏菌組與對(duì)照組的菌群組成較為相近，而鰻弧菌組與其他兩組差異較大，表明鰻弧菌相比愛(ài)德華氏菌，對(duì)肝臟菌群產(chǎn)生了更大的影響。對(duì)照組肝臟菌群的豐度和多樣性最高，遲鈍愛(ài)德華氏菌組次之，鰻弧菌組最少。這種變化可能是由于病菌的入侵改變了細(xì)菌群落的組成與種間相互作用，從而改變微生物介導(dǎo)的功能，影響了宿主的免疫應(yīng)答，宿主的自我調(diào)節(jié)能力紊亂，發(fā)生病變。細(xì)菌感染后，宿主共生菌多樣性降低與宿主健康受損的相關(guān)性在許多研究中均有發(fā)現(xiàn)[19-20]。

3.2 不同水平上優(yōu)勢(shì)菌群影響

門(mén)水平上細(xì)菌分類結(jié)果顯示，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是短蛸肝臟的核心菌門(mén)。這與文蛤肝臟中的優(yōu)勢(shì)菌群組成相似，文蛤肝臟的優(yōu)勢(shì)菌群依次為放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)[8]。以上細(xì)菌同時(shí)也是白甲魚(yú)(Onychostomasima)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)等多種水產(chǎn)動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群[21-23]。本試驗(yàn)中，變形菌門(mén)是短蛸肝臟中最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群，其中包含了γ-變形菌綱的短波單胞菌屬、假單胞菌屬，α-變形菌綱的甲基桿菌屬，β-變形菌綱的硫氧化湖沉積桿菌屬等。此外，厚壁菌門(mén)的狹義梭菌屬也是短蛸肝臟的優(yōu)勢(shì)菌屬。短波單胞菌屬和假單胞菌屬常被報(bào)道為各種對(duì)蝦腸道中共有的優(yōu)勢(shì)菌屬[24]；狹義梭菌屬被報(bào)道是鱧屬(Channa)魚(yú)類和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)等腸道的優(yōu)勢(shì)菌屬[25-26]。說(shuō)明短蛸肝臟菌群和以上水生動(dòng)物腸道菌群存在一定的共性。

屬水平上細(xì)菌分類結(jié)果顯示，對(duì)照組的核心菌屬中支原體屬占9.01%，經(jīng)過(guò)菌感染后，試驗(yàn)組支原體屬豐度激增，在鰻弧菌組中占95.94%。在弧菌感染文蛤的試驗(yàn)中同樣出現(xiàn)了支原體激增的狀況[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，短蛸在注射鰻弧菌后，肝臟組織出現(xiàn)了部分細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞界限模糊，脂肪顆粒及細(xì)胞質(zhì)外溢，甚至細(xì)胞核和部分細(xì)胞器破裂溶解的現(xiàn)象[13]。筆者推測(cè)，原因可能是激增的支原體通過(guò)黏附作用與宿主細(xì)胞結(jié)合，獲取細(xì)胞膜中的脂質(zhì)和膽固醇，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

3.3 PICRUSt功能預(yù)測(cè)影響

PICRUSt預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，短蛸肝臟菌群主要的功能與新陳代謝類功能有關(guān)，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝等，表明肝臟菌群能夠參與短蛸的代謝活動(dòng)。狹義梭菌屬是短蛸肝臟的優(yōu)勢(shì)菌屬。研究表明，狹義梭菌屬細(xì)菌可以利用發(fā)酵糖類和碳水化合物，提供機(jī)體所需能量，促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫功能和抗癌功能[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟菌群在短蛸的生理活動(dòng)中發(fā)揮著十分重要的作用。注射病菌后，各代謝通路以及細(xì)胞其他基礎(chǔ)生命活動(dòng)功能通路豐度都有所降低，表明當(dāng)菌群結(jié)構(gòu)遭到破壞后，肝臟的生理機(jī)能也相應(yīng)受損。

4 結(jié) 論

短蛸肝臟具有穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)，在短蛸的日常代謝活動(dòng)中發(fā)揮一定的作用。當(dāng)受到鰻弧菌與愛(ài)德華氏菌侵染后，肝臟菌群的多樣性與豐度均發(fā)生變化。與對(duì)照組相比，愛(ài)德華氏菌組菌群結(jié)構(gòu)變化較小，鰻弧菌組變化較大，表明鰻弧菌對(duì)短蛸肝臟的菌群結(jié)構(gòu)破壞更大。研究結(jié)果可豐富和拓展短蛸肝臟菌群的基礎(chǔ)研究，并為短蛸養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌性疾病的準(zhǔn)確診斷與防控提供基礎(chǔ)資料。