王瑋欣，李 宇，朱洪賡，張婉茹，馮廣朋，陳建華

( 1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產(chǎn)學院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005； 2.中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090 )

鄱陽湖和洪澤湖分別為我國第一、第四大淡水湖，分別為長江中下游地區(qū)和淮河下游地區(qū)江湖復合生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅具有重要的生態(tài)功能，還擁有復雜的淡水生物群落，魚類資源非常豐富[1]。但近年來，過度捕撈、圍網(wǎng)養(yǎng)殖和污水排放等人類活動導致湖泊水質(zhì)污染加劇，生態(tài)平衡遭到破壞，水產(chǎn)資源損失較為嚴重。

形態(tài)特征的差異是生物多樣性最直觀的表現(xiàn)，而從形態(tài)上分析魚類的外部特征是研究其種質(zhì)差異的重要方法之一[2]，該方法不僅直觀，而且操作簡單。傳統(tǒng)的魚類形態(tài)鑒別采用單一可量、可數(shù)性狀的比較，但該方法在鑒定形態(tài)相似程度高的種內(nèi)不同地理群體方面存在較大的缺陷[3]。為彌補可量性狀或可數(shù)性狀測量法的不足，有學者將可量性狀特征與框架結(jié)構(gòu)特征結(jié)合起來應用于鑒定不同地理群體[4-5]?？蚣芊治龇◤亩嘟嵌葴y量魚體的形態(tài)參數(shù)，借助判別分析、主成分分析和聚類分析等多種統(tǒng)計方法進行多變量分析[4,6]，篩選出具有顯著差異的變量用于鑒別不同種群間的差異。

遺傳多樣性即基因多樣性，是指一個群體內(nèi)不同個體或種內(nèi)不同群體之間的遺傳變異的總和[7]。物種的遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應能力就越強[8]。不同區(qū)域的種群具有不同的遺傳多樣性，因此不同區(qū)域種群間會出現(xiàn)一定的遺傳距離[9]。線粒體DNA因其結(jié)構(gòu)相對簡單、演化速度較快、檢測方便等特點已被作為常用的分子標記，其中線粒體細胞色素b(Cytb)基因序列近年來廣泛應用于研究爬行類和魚類等的系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和群體遺傳多樣性[10-11]。如趙麗麗等[10]通過分析秋刀魚(Cololabissaira)Cytb序列發(fā)現(xiàn)，秋刀魚的遺傳多樣性比較低，群體經(jīng)歷了種群擴張，其遺傳變異來自群體內(nèi)，地理分化不顯著，遺傳分化水平相對較低。

短頜鱭(Coiliabrachygnathus)屬鯡形目鳀科鱭屬。其與刀鱭(C.nasus)的主要區(qū)別在于上頜骨較短，向后延長不超過鰓蓋的后緣，體側(cè)縱列鱗數(shù)目較少[12]。短頜鱭主要分布于長江及淮河流域中、下游，偶見于長江口咸淡水區(qū)[13]。其肉質(zhì)細嫩鮮美，深受廣大消費者的喜愛，具有重要的經(jīng)濟價值，也是主要的捕撈對象之一[14]。自20世紀90年代起，因過度捕撈、水體污染及生態(tài)環(huán)境惡化等因素導致鱭屬魚類資源衰退[15]。目前，有關短頜鱭的生物學特性、資源分布、遺傳多樣性等方面的研究已有報道[12-13,16]，但關于不同湖泊之間短頜鱭種群分化的研究報道較少。

筆者以洪澤湖和鄱陽湖4個不同水域中的短頜鱭為研究對象，結(jié)合形態(tài)學和線粒體Cytb序列，分析2個湖泊的短頜鱭種群之間的差異，探討不同地理種群的遺傳多樣性，旨在為我國長江中下游湖泊短頜鱭的資源保護和合理開發(fā)利用、良種選育等提供基礎資料和科學指導。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和處理

短頜鱭樣本2019年7—11月采集于都昌縣、余干縣瑞洪鎮(zhèn)、泗洪縣臨淮鎮(zhèn)和洪澤區(qū)高良澗，共154尾。取少量肌肉組織浸泡于95%乙醇，儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 形態(tài)分析

結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)度量學和框架結(jié)構(gòu)度量學方法，使用數(shù)顯游標卡尺測量短頜鱭樣品[17]。測量數(shù)據(jù)包括傳統(tǒng)可量性狀參數(shù)和框架性狀參數(shù)，共27項。其中傳統(tǒng)形態(tài)參數(shù)包括全長、體長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄高、臀鰭基長、胸鰭長、上頜骨長、眼后頭長共13個?？蚣苄誀顪y量參數(shù)參照文獻[17]選取9個解剖學同源坐標點(圖1)，框架坐標點之間直線距離形成的14個框架參數(shù)：吻端至額部有鱗部最前緣(2—4)、吻端至胸鰭起點距離(2—1)、額部有鱗部最前緣至胸鰭起點距離(4—1)、額部有鱗部最前緣至腹鰭起點距離(4—3)、額部有鱗部最前緣至臀鰭起點距離(4—5)、胸鰭起點至腹鰭起點距離(1—3)、背鰭起點至胸鰭起點距離(6—1)、背鰭起點至腹鰭起點距離(6—3)、背鰭起點至臀鰭起點距離(6—5)、腹鰭起點至臀鰭起點距離(3—5)、腹鰭起點至背鰭末端距離(3—8)、背鰭末端至臀鰭起點距離(8—5)、臀鰭起點至尾鰭背部起點距離(5—9)、背鰭末端至臀鰭末端距離(8—7)。

為消除樣本體型大小對量度特征變量的影響，將可量性狀數(shù)據(jù)和框架數(shù)據(jù)進行比值校正(表1)，共得到26項形態(tài)數(shù)值。采用SPSS 26.0軟件進行聚類分析、主成分分析和判別分析。其中判別分析采用逐步判別法，選擇Wilks的λ統(tǒng)計量值最小的變量進行判別分析[18]；聚類分析以歐氏最短距離系統(tǒng)聚類法[5]作為聚類方法。

圖1 短頜鱭的框架特征[17]Fig.1 Frame characteristic diagram of shortjaw tapertail anchovy C. brachygnathus[17]1.胸鰭起點; 2.吻端; 3.腹鰭起點; 4.額部有鱗部最前緣; 5.臀鰭起點; 6.背鰭起點; 7.臀鰭末端; 8.背鰭末端; 9.尾鰭背部起點.1.starting point of pectoral fin; 2.tip of snout; 3.starting point of pelvic fin; 4.most anterior of scales on skull; 5.starting point of anal fin; 6.starting point of dorsal fin; 7.end of anal fin; 8.end of dorsal fin; 9.dorsal starting point of caudal fin.

1.3 線粒體Cytb分析

1.3.1 DNA抽提、PCR擴增及測序

肌肉組織基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，按照說明書進行操作。線粒體Cytb序列PCR擴增所用引物[7]為CF(5′-GAC TTG AAA AAC CAC CGT TG-3′)和CR(5′-CTC CGA TCT CCG GAT TAC AAG AC-3′)。PCR反應體系為50 μL：10×LA Taq BufferⅡ(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，上、下游引物各1 μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 33 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇目標條帶明亮、單一的PCR產(chǎn)物送通用生物股份有限公司進行雙向測序。

表1 形態(tài)分析變量及校正參數(shù)

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

測得序列用Clustal X[19]軟件比對，并進行人工校對。通過DNASP 5.0[20]軟件計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)。采用MEGA 7.0軟件分析序列的堿基組成、多態(tài)位點和簡約信息位點；計算單倍型Kimara雙參數(shù)模型的遺傳距離，采用鄰接法以鳳鱭(Mystuscastaneous) (GenBank登錄號KF809936.1)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進化樹；計算群體內(nèi)和群體間Tajima-Nei模型遺傳距離，并以種群間矩陣構(gòu)建的群體間鄰接樹。由Arlequin 3.5軟件[21]進行Tajima′sD、Fu′sFs中性檢驗，計算遺傳分化指數(shù)(Fst)并進行分子變異分析，根據(jù)公式Nm=1/(4Fst)-1/4計算群體間基因流(Nm)[22]。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)分析

2.1.1 判別分析

對4個短頜鱭種群的框架數(shù)據(jù)的校正值和可量性狀數(shù)據(jù)逐步進行判別分析，共選出10個性狀：吻長/體長(x3)、吻長/頭長(x5)、頭長/體長(x6)、眼徑/眼間距(x11)、胸鰭長/體長(x12)、2—4/體長(x13)、4—3/體長(x16)、1—3/體長(x18)、6—3/體長(x20)、8—5/體長(x24)。構(gòu)建4個種群的費希爾判別函數(shù)(都昌種群y1、瑞洪種群y2、高良澗種群y3、臨淮種群y4)，檢驗顯示，4個短頜鱭群體間形態(tài)判別差異顯著(P<0.01)。將短頜鱭種群形態(tài)參數(shù)的校正值分別代入對應判別函數(shù)進行預測分類。結(jié)果顯示，種群的綜合判別準確率為87.00%，其中都昌種群、瑞洪種群、高良澗種群和臨淮種群的判別準確率分別為91.40%、80.00%、84.60%和82.50%。

都昌種群：

y1=-11 562.492-768 611.074x3+122 429.953x5+146 182.791x6+207.477x11-135.188x12-1966.207x13-312.009x16-1204.588x18+554.656x20-326.263x24

瑞洪種群：

y2=-11 382.763-761 116.427x3+121 315.304x5+144 941.037x6+219.90x11-146.133x12-1912.060x13-462.876x16-1048.538x18+716.114x20-421.765x24

高良澗種群：

y3=-11 502.947-768 188.900x3+122 397.561x5+145 870.367x6+161.466x11-109.948x12-1887.908x13-254.092x16-1115.892x18+491.011x20-415.235x24

臨淮種群：

y4=-11 417.997-765 442.199x3+121 932.980x5+145 265.505x6+171.405x11-158.925x12-1683.051x13-159.440x16-1125.828x18+411.587x20-393.568x24

2.1.2 聚類分析

對不同種群的14個框架參數(shù)的校正值和12個可量性狀參數(shù)(除全長外)進行聚類分析(圖2)。結(jié)果表明，鄱陽湖湖區(qū)內(nèi)短頜鱭種群(都昌種群和瑞洪種群)聚成一支，洪澤湖湖區(qū)內(nèi)短頜鱭種群(高良澗種群和臨淮種群)聚成一支。

圖2 不同短頜鱭種群的形態(tài)聚類分析Fig.2 Morphological cluster diagrams of different populations of shortjaw tapertail anchovy C. brachygnathus

2.1.3 主成分分析

對4個短頜鱭種群的形態(tài)數(shù)據(jù)校正值進行主成分分析，得到協(xié)方差矩陣的累積貢獻率、貢獻率及特征根(表2)。分析結(jié)果共提取了6個主成分，其中前3個主成分(1、2、3)的總貢獻率為65.12%。在主成分1中，影響較大的變量為頭長/體長、眼徑/頭長、眼徑/眼間距；對主成分2影響較大的變量為眼后頭長/體長、眼后頭長/頭長；對主成分3影響較大的為4—5/體長。

表2 4個短頜鱭種群的形態(tài)特征因子負荷矩陣及主成分貢獻率

2.2 線粒體Cytb分析

2.2.1 序列堿基組成及種群遺傳多樣性

共得到60條長度為1148 bp的Cytb序列，其中突變位點49個(4.27%)，簡約信息位點13個。Cytb基因片段堿基含量的平均含量分別為：A=28.4%、T=27.8%、C=28.6%、G=15.2%，A+T(56.2%)含量顯著高于G+C(43.8%)含量。

通過統(tǒng)計60條Cytb基因共定義33種單倍型(表3)。Hap-1、Hap-2、Hap-3、Hap-4為都昌種群和瑞洪種群共有，數(shù)量分別為9、3、4、3，占所有單倍型數(shù)量的31.67%；Hap-6、Hap-12為都昌種群、高良澗種群和臨淮種群共有，數(shù)量分別為6、5，占所有單倍型數(shù)量的18.33%；都昌種群和臨淮種群共有單倍型為Hap-13，數(shù)量為2；Hap-25為高良澗種群和臨淮種群的共有單倍型，數(shù)量為2；其余單倍型均為特有單倍型，共有28個，占單倍型總數(shù)的百分比為75.75%。

表3 短頜鱭Cytb序列33種單倍型在4個群體中的分布

從遺傳多樣性指數(shù)看(表4)，4種群的基因多態(tài)性較高，核苷酸多態(tài)性較低。不同種群間比較可以發(fā)現(xiàn)，無論是基因多態(tài)性還是核苷酸多態(tài)性，瑞洪種群均最低(0.778、0.00166)，而都昌種群的基因多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性均最高(0.963、0.00486)。

表4 短頜鱭種群Cytb序列的遺傳多樣性參數(shù)

2.2.2 種群間遺傳分化與分子進化樹

系統(tǒng)進化樹顯示，除單倍型Hap-16、共有單倍型(8個)、個別單倍型(3個)之外，其他單倍型主要分為兩系(圖3)。來源于洪澤湖湖區(qū)短頜鱭樣本的11種單倍型Hap-27、Hap-26、Hap-32、Hap-28、Hap-22、Hap-31、Hap-23、Hap-29、Hap-24、Hap-30、Hap-33單獨成為一系，來源于鄱陽湖湖區(qū)短頜鱭樣本的10種單倍型Hap-8、Hap-14、Hap-18、Hap-20、Hap-11、Hap-7、Hap-17、Hap-5、Hap-15、Hap-19成為另外一系。

圖3 基于短頜鱭Cytb基因序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)進化樹Fig.3 Construction of adjacency (neighbor-joining) phylogenetic tree based on Cytb gene sequence of shortjaw tapertail anchovy C. brachygnathus“○”表示都昌；“□” 表示瑞洪；“△” 表示高良澗；“▽” 表示臨淮；“◆” 表示共有單倍型.“○” shows Duchang;“□” shows Ruihong;“△” shows Gaoliangjian;“▽” shows Linhuai;“◆” shows common haplotype.

2.2.3 種群的歷史動態(tài)

中性檢驗結(jié)果顯示，4個種群的Tajima′sD值與Fu′sFs值均為負值(表5)。其中都昌種群的Tajima′sD值統(tǒng)計有顯著差異(P<0.05)，高良澗和都昌種群的Fu′sFs值統(tǒng)計有極顯著差異(P<0.01)，表明都昌和高良澗種群的Cytb序列進化顯著偏離中性化。由此判斷，洪澤湖和鄱陽湖短頜鱭近期經(jīng)歷了群體擴張模式[23]。

表5 短頜鱭種群內(nèi)的中性檢測結(jié)果

2.2.4 種群間遺傳距離和分化

以Tajima-Nei遺傳距離模型計算4個種群內(nèi)和種群間的遺傳距離，結(jié)果顯示，Cytb序列在種群內(nèi)的遺傳距離為0.002～0.006，種群間的遺傳距離為0.003～0.006(表6)。總體上遺傳距離差距較小，無論種群內(nèi)還是種群間均小于0.05。

表6 短頜鱭Cytb序列單倍型間遺傳距離

由種群間系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可見，短頜鱭4個地理種群可分為兩大支：同屬鄱陽湖的都昌種群與瑞洪種群聚為一支，同屬洪澤湖的臨淮種群與高良澗種群聚為一支。

圖4 基于Tajima-Nei遺傳距離模型的種群間鄰接樹Fig.4 Neighbor joining tree among populations based on Tajima-Nei genetic distance model

遺傳分化指數(shù)大小可以判斷4個種群之間的遺傳分化程度。都昌種群與臨淮種群、高良澗種群之間的遺傳分化指數(shù)分別為0.22972和0.34085(P<0.05)，瑞洪種群與臨淮種群、高良澗種群之間的遺傳分化指數(shù)分別為0.48406和0.60873(P<0.05)；而都昌種群與瑞洪種群間、高良澗與臨淮種群間的遺傳分化指數(shù)均小于0.05，且統(tǒng)計檢驗均不顯著(P>0.05)(表7)。都昌種群與瑞洪種群間的基因流、高良澗種群與臨淮種群間的基因流均大于1，其余種群之間的基因流均小于1。

表7 基于Cytb序列的短頜鱭兩兩種群間遺傳分化指數(shù)(對角線下)和基因流(對角線上)

分子變異分析結(jié)果顯示，種群內(nèi)的遺傳變異為71.22%，種群間變異為28.78% (P<0.05)(表8)。

表8 短頜鱭種群分子變異分析結(jié)果

3 討 論

3.1 種群形態(tài)差異分析

形態(tài)分析結(jié)果顯示，在主成分分析上，這些性狀主要反映了魚體的頭部特征、鰭位置等與游泳有關的特征，由此認為，環(huán)境的不同導致短頜鱭頭部和游泳特征的差異[24]，久而久之，4個種群產(chǎn)生形態(tài)上的差異。聚類分析結(jié)果顯示，存在明顯的地理相關性；判別分析中F檢驗顯示，4個短頜鱭種群間形態(tài)判別差異顯著(P<0.01)，種群的綜合判別準確率為87.00%。綜合形態(tài)分析結(jié)果，短頜鱭各地理種群間存在明顯形態(tài)差異，說明已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的種群分化。

3.2 種群遺傳多樣性與歷史動態(tài)

本研究中，不同短頜鱭種群的Cytb序列A+T含量(56.2%)顯著高于G+C含量(43.8%)，存在顯著的堿基偏倚性，這與鮭亞科[25]、秋刀魚(C.saira)[10]和刀鱭[26]等類似。中性檢驗結(jié)果顯示，都昌種群、瑞洪種群、高良澗種群和臨淮種群Tajima′sD值和Fu′sFs值均為負數(shù)，表明4個短頜鱭種群的Cytb序列進化均顯著偏離中性進化，推測洪澤湖和鄱陽湖短頜鱭近期經(jīng)歷了群體擴張模式。這可能是因為短頜鱭喜歡集群，較易拓展新的棲息地并能快速擴張種群[27]。

3.3 種群遺傳分化

在種群遺傳分化上，F(xiàn)reeland[28]認為，遺傳分化指數(shù)0～0.05為低度分化，遺傳分化指數(shù)>0.05～0.25為中度分化，遺傳分化指數(shù)>0.25為高度分化。本研究中，基于短頜鱭兩兩種群間遺傳差異的分析顯示，都昌種群和瑞洪種群間基因交流頻繁，遺傳分化程度較小，為低度分化(遺傳分化指數(shù)<0.05)，高良澗種群和臨淮種群間同上(遺傳分化指數(shù)<0.05)；而都昌種群分別與高良澗種群、臨淮種群之間的遺傳分化程度顯著，屬于高度分化(遺傳分化指數(shù)>0.25，P<0.05)，瑞洪種群分別與高良澗種群、臨淮種群之間同上(遺傳分化指數(shù)>0.25，P<0.05)。通過短頜鱭種群地理位置分布，都昌種群和瑞洪種群屬于鄱陽湖，高良澗種群和臨淮種群屬于洪澤湖，與兩兩種群間遺傳差異分析結(jié)果相符合；基于Tajima-Nei遺傳距離模型的種群間鄰接樹也顯示了相同的結(jié)果。不同種群間的基因交流越充分，其遺傳分化就越小，當基因流<1時，基因流不足以維持遺傳勻質(zhì)化，遺傳漂變會導致遺傳分化[29]。由本研究的基因流結(jié)果可見，都昌種群和瑞洪種群分別與高良澗種群和臨淮種群間之間線粒體基因流均小于1，顯示其基因流已不足以維持遺傳勻質(zhì)化，遺傳漂變等因素會導致鄱陽湖湖區(qū)和洪澤湖湖區(qū)短頜鱭進一步分化[30]，表明鄱陽湖與洪澤湖短頜鱭種群間產(chǎn)生了較大的遺傳分化，而鄱陽湖和洪澤湖內(nèi)部短頜鱭種群間遺傳分化程度較小[31]。

由短頜鱭Cytb序列的33種單倍型在各種群中的分布以及系統(tǒng)進化樹結(jié)果可見：Hap-1、Hap-2、Hap-3和Hap-4為都昌種群和瑞洪種群的共有單倍型，Hap-5、Hap-7～Hap-11、Hap-14～Hap-18為都昌種群的特有單倍型，Hap-19～Hap-20為瑞洪種群的特有單倍型；高良澗種群的特有單倍型為Hap-26～Hap-33，臨淮種群的特有單倍型為Hap-21～Hap-24，Hap-25為瑞洪種群和高良澗種群的共有單倍型；而鄱陽湖種群與洪澤湖種群存在的共有單倍型僅為3種：Hap-6、Hap-12、Hap-13，由此可見，鄱陽湖湖區(qū)種群與洪澤湖湖區(qū)種群之間，在單倍型分布上也存在較大差異。結(jié)合分子變異分析結(jié)果，進一步表明各地理群體間已產(chǎn)生顯著的遺傳分化。

根據(jù)形態(tài)和分子分析結(jié)果可知，鄱陽湖湖區(qū)與洪澤湖湖區(qū)的短頜鱭種群間已經(jīng)產(chǎn)生了種群分化，這可能是因為鄱陽湖距洪澤湖較遠，且沒有明顯河流連通兩大湖泊，另外棲息的自然環(huán)境不同以及地理隔離等，可能導致兩大湖區(qū)的短頜鱭長時間缺少基因交流，逐漸產(chǎn)生遺傳分化。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示：洪澤湖和鄱陽湖的短頜鱭種群之間存在由頭部和游泳特征所引起的形態(tài)差異；鄱陽湖湖區(qū)與與洪澤湖湖區(qū)的短頜鱭種群間遺傳分化程度顯著。為更準確客觀地了解不同湖泊短頜鱭種群之間的遺傳變異程度，仍需要增加采樣點，并應用微衛(wèi)星或單核苷酸多態(tài)性等分子標記開展更深入的研究分析。