龍 夢，樊慧敏，江 遙，夏洪麗，程 俊，喻大鵬，夏立群,4，魯義善,4

( 1.廣東海洋大學 深圳研究院，廣東省水生動物健康評估工程技術(shù)研究中心，深圳市海水經(jīng)濟動物種苗健康評價公共技術(shù)服務(wù)平臺，廣東 深圳 518120； 2.深圳市大鵬新區(qū)科技創(chuàng)新服務(wù)中心，廣東 深圳 518120； 3.中國科學院 水生生物研究所，湖北 武漢 430072； 4.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088 )

氣單胞菌屬(Aeromonas)是一類革蘭氏陰性短桿菌，在自然界中廣泛分布，是養(yǎng)殖水生動物暴發(fā)性傳染病的重要病原菌，其中部分種類也是人—畜—魚共患病原菌。在環(huán)境脅迫或條件合適的情況下，氣單胞菌可引起魚類，如青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiusauratus)等，貝類及蝦、蟹類等發(fā)病[1]。氣單胞菌屬根據(jù)生長發(fā)育所需溫度范圍及是否有動力分為兩大類，即嗜溫有動力氣單胞菌和嗜冷無動力氣單胞菌。嗜溫有動力氣單胞菌包括嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、舒氏氣單胞菌(A.schubertii)等，嗜冷無動力氣單胞菌僅包含殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)1種細菌[2]。氣單胞菌可單獨或幾種細菌混合感染致病，引發(fā)出血性敗血癥、腸炎、腹水病、癤瘡病等[3-5]。其中以出血性敗血癥危害魚的種類最多、范圍最大、流行季節(jié)最長及造成的損失最大，對我國淡水魚類養(yǎng)殖造成持續(xù)性的威脅[6-7]。

目前，我國對氣單胞菌病的控制方法主要有抗生素、化學藥物和疫苗等，但大量使用藥物帶來的藥物殘留、耐藥基因傳播以及耐藥菌的產(chǎn)生等問題，已嚴重危及環(huán)境和人體健康，而針對氣單胞菌的疫苗當前我國批準的僅有嗜水氣單胞菌滅活疫苗[8-10]。生物防治是利用拮抗菌抑制病原菌的生長繁殖，使有害微生物的密度低于其致病密度，從而達到防控疾病的目的。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的病原菌拮抗菌包括芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌、酵母菌等。其中芽孢桿菌以具有耐高溫，耐酸堿，抗擠壓，能分泌產(chǎn)生氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)這些符合益生菌的優(yōu)點以及分布范圍極其廣泛而受到重點關(guān)注，應(yīng)用較為普遍的拮抗菌株有枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)等[11-14]。

已有研究表明，紅樹林沉積物中微生物種類和活性豐富，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢物種[15-16]。鑒于深圳紅樹林沉積物的微生物目前尚未被系統(tǒng)研究和開發(fā)，筆者以深圳東涌紅樹林沉積物作為菌種分離來源，運用點種法和打孔法等篩選方法，篩選和分離6種常見病原性氣單胞菌的拮抗菌株，并對篩選獲得的2株抑菌活性較強、抑菌譜較廣的拮抗芽孢桿菌進行系統(tǒng)鑒定和生物學特性分析，運用模式生物斑馬魚(Daniorerio)和氣單胞菌易感宿主鰱驗證拮抗菌的生物安全性，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖氣單胞菌病的生物防治及相關(guān)生物制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅樹林沉積物，采集于廣東深圳東涌紅樹林。試驗用鰱(體長8～10 cm，體質(zhì)量9～11 g)、斑馬魚(體長1.5～3.0 cm，體質(zhì)量2～3 g)均購自廣州市花都區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。拮抗菌篩選用指示菌包括6種水產(chǎn)氣單胞菌：鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧(Channaargus)源舒氏氣單胞菌HYK1、團頭魴(Megalobramaamblycephala)源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌(A.media)4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210。目標拮抗菌抑菌譜測定用指示菌除以上6種氣單胞菌外，還包括黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)源愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)HSA-1、鰱源類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)LL1、鰱源耶爾森菌(Yersiniaruckeri)YR1、羅非魚(Oreochromis)源無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)WC1535等。這些菌株均分離自患病魚體，并為本實驗室保存菌株。

1.2 氣單胞菌拮抗菌的分離與篩選

1.2.1 細菌的分離純化

2019年9月13日于深圳東涌紅樹林采集表層沉積物(深度5～10 cm)，放入裝有冰袋的保溫箱并于12 h內(nèi)帶回實驗室處理。取3 g沉積物加入無菌海水定容至30 mL(稀釋10倍)作為母液，進而對母液進行10倍倍比稀釋，形成1、10-1、10-2、10-3、10-4等5個梯度，每個梯度取100 μL于2216E固體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，磷酸鐵0.01 g，牛肉膏1 g，海水1 L，pH 7.4～7.6)無菌均勻涂布，每個密度3個平行。置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～96 h，挑取形態(tài)、顏色不同的單菌落，在2216E平板上劃線純化，培養(yǎng)至長出單菌落后，再次挑取單菌落于2216E平板劃線純化至獲得形態(tài)顏色單一的單菌落，然后挑取單菌落于2216E液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)24～48 h，菌液中加入無菌甘油至終體積分數(shù)為20%，做好標記保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 拮抗菌的篩選

以鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧源舒氏氣單胞菌HYK1、團頭魴源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210等6株病原氣單胞菌作為指示菌，采用初篩和復(fù)篩的方法對以上紅樹林分離菌進行拮抗菌的篩選。

初篩：采用點種法對分離菌株進行初篩，將生長至對數(shù)期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，再分別吸取紅樹林分離菌菌液3.0 μL點種，等距離于同一平板重復(fù)點種3次，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，記錄出現(xiàn)明顯抑菌圈的菌株。

復(fù)篩：采用打孔法對上述有明顯抑菌圈的分離菌株進行復(fù)篩。同樣以6種氣單胞菌作為指示菌，將處于對數(shù)生長期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，用無菌打孔器在同一平皿上等距離打3個孔，孔徑約6 mm，每個孔中加入80 μL經(jīng)初篩發(fā)現(xiàn)有抑菌活性的拮抗菌菌液，然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察并測定抑菌圈直徑，選定目標拮抗菌。通過初篩和復(fù)篩，共獲得2株對指示菌均具有較好抑菌效果的拮抗菌，即AH10和AQ1。

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察

將菌株AH10和AQ1無菌劃線于2216E平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、濕潤度等。挑取平板上的單菌落，經(jīng)涂片、固定和革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察拍照，同時，挑取單菌落用電鏡固定液固定，并于透射電子顯微鏡(日立,日本)下觀察拍照。

1.3.2 生理生化活性測定

將菌株AH10和AQ1分別接種至2216E固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)約12～24 h至菌液密度達1×108cfu/mL，用細菌生化鑒定試劑盒(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)進行接觸酶、氧化酶、淀粉、苯丙氨酸、硫化氫、明膠、擴散生長、硝酸鹽還原、西蒙氏枸椽酸鹽、β-半乳糖苷酶、靛基質(zhì)、賴氨酸脫羧酶、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇和VP生理生化指標的檢測。

1.3.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16S rRNA基因序列克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析：采用瑞真生物細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌菌株基因組DNA，以其為模板用細菌16S rRNA基因通用引物 (27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)和gyrB基因引物(UP-1S: GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，UP-2Sr：AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCC)進行目的基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳和凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，呈現(xiàn)單一的目的條帶，約為1.5 kb(16S rRNA基因)和0.7 kb(gyrB基因)。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序獲得序列在美國國家生物技術(shù)信息中心中經(jīng)BLAST同源性比較分析，并利用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗菌生長特性分析

將密度為1×108cfu/mL的AH10和AQ1菌液以1∶100(體積比)的比例轉(zhuǎn)接至100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，分別在24、28、32、37 ℃下恒溫搖床中以200 r/min培養(yǎng)18 h，每隔2 h取250 μL菌液于96孔酶標板小孔中，每個樣品設(shè)3個平行，于酶標儀中測定D(600 nm)；按上述方法，將一定密度的菌液按比例轉(zhuǎn)接至初始pH為3、5、7、9、11的2216E液體培養(yǎng)基中，在測定的最適溫度下200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)；按上述方法，將一定密度的菌液按比例轉(zhuǎn)接至初始NaCl質(zhì)量分數(shù)為0‰、5‰、20‰、35‰、50‰、65‰、80‰的2216E液體培養(yǎng)基中，在測定的最適溫度和pH下以200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)，以確定最適生長NaCl質(zhì)量分數(shù)。

1.5 拮抗菌抑菌譜測定

采用打孔法對AH10和AQ1對常見魚類致病菌的抑菌譜進行測定，所用指示菌包括：鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧源舒氏氣單胞菌HYK1、團頭魴源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210、黃顙魚源愛德華氏菌HSA-1、鰱源類志賀鄰單胞菌LL1、鰱源耶爾森菌YR1、羅非魚源無乳鏈球菌WC1535等。分別吸取對數(shù)生長期[D(600 nm)=0.3～0.4]指示菌菌液100 μL均勻涂布到BHI固體培養(yǎng)基上，用無菌打孔器在同一平皿上等距離打3個孔，孔直徑約6 mm，每個孔中加入80 μL拮抗菌(AH10或AQ1)菌液[D(600 nm)=0.3～0.4]，然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察并測定抑菌圈直徑。

1.6 拮抗菌生物安全性分析

1.6.1 拮抗菌的耐藥性測定

將AH10和AQ1菌液密度稀釋至1×107cfu/mL，取200 μL稀釋菌液，均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，用K-B紙片擴散法檢測AH10和AQ1對9大類29種抗生素的敏感性，包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類、林可酰胺類、磺胺類和氯霉素類。根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》判定拮抗菌對各種抗生素的耐藥性。

1.6.2 拮抗菌對斑馬魚的致病性

試驗用斑馬魚體長1.5～3.0 cm，體質(zhì)量2～3 g，設(shè)3個試驗組和1個對照組，每組設(shè)3個平行，分別在裝有5 L曝氣自來水的塑料缸中放入斑馬魚20尾，水溫22～24 ℃。試驗組分別腹腔注射50 μL密度為8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，對照組注射相同體積的磷酸緩沖鹽溶液，連續(xù)10 d觀察并記錄斑馬魚的存活狀態(tài)。

1.6.3 拮抗菌對鰱的致病性

試驗用鰱體長8～10 cm，體質(zhì)量9～11 g，設(shè)3個試驗組和1個對照組，每組設(shè)3個平行，分別在裝有10 L曝氣自來水的塑料缸中放入10尾鰱，水溫22～24 ℃。試驗組分別腹腔注射100 μL密度為8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，對照組注射相同體積的磷酸緩沖鹽溶液，連續(xù)10 d觀察并記錄鰱的存活狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌的分離和篩選

自深圳東涌紅樹林沉積物中共分離純化細菌62株，經(jīng)初篩，有9株菌對至少1種指示菌具有拮抗活性。對這9株菌進行復(fù)篩，篩選到2株對嗜水氣單胞菌、舒氏氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌6種氣單胞菌指示菌均具有拮抗活性且拮抗活性較強的分離菌，將這2株拮抗菌命名為AH10和AQ1。

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

分離菌株AH10接種于2216E固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約為1.0～3.0 mm，菌落不透明、干燥、呈乳白色、中間較厚、形狀接近圓形、表面粗糙、邊緣缺刻狀(圖1a)，革蘭氏染色呈紫色(圖1b)。顯微鏡下觀察到細菌呈短桿狀，透射電鏡下觀察到菌體完整形態(tài)，具有細胞壁等結(jié)構(gòu)(圖1c)。

分離菌株AQ1接種于2216E固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約為1.0～2.5 mm，菌落不透明、濕潤、具有黏性、呈乳白偏黃色、向上隆起、圓形、邊緣整齊規(guī)則(圖1d)，革蘭氏染色呈藍紫色(圖1e)。顯微鏡下觀察到細菌呈短桿狀，透射電鏡下觀察到菌體完整形態(tài)，具有細胞壁等結(jié)構(gòu)(圖1f)。

圖1 菌株AH10(a、b、c)和AQ1(d、e、f)的菌體表型Fig.1 The phenotypes of strains AH10 (a, b, c) and AQ1 (d, e, f)a、d.在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；b、e.革蘭氏染色；c、f.透射電鏡下的菌體形態(tài).a,d.colonial morphologies on 2216E agar plate; b, e.gram staining under microscope; c, f.mycelial morphologies under transmission electron microscopy.

以上結(jié)果表明，菌株AH10和AQ1均為革蘭氏陽性桿菌。

2.2.2 生理生化特性

菌株AH10和AQ1的生理生化結(jié)果見表1。由表1可知，菌株AH10和AQ1能夠利用蔗糖、葡萄糖和淀粉，不能利用半乳糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇，接觸酶反應(yīng)、明膠試驗、硝酸鹽還原呈陽性，氧化酶反應(yīng)、苯丙氨酸、硫化氫、賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)試驗呈陰性。菌株AH10與AQ1的不同之處在于：AH10能夠利用西蒙氏枸椽酸鹽，β-半乳糖苷酶試驗呈陽性；AQ1不能利用西蒙氏枸椽酸鹽，β-半乳糖苷酶試驗陰性。參照文獻[17]和[18]，初步鑒定菌株AH10和AQ1為芽孢桿菌屬細菌。

表1 菌株AH10 和AQ1的生理生化特征

2.2.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析

通過16S rRNA基因克隆和測序獲得AH10和AQ1的16S rRNA基因序列，經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心BLAST同源性比較分析，取同源性較高的基因序列通過MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2a可見：菌株AQ1與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34單獨聚為一支；菌株AH10與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YS52，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)MD33，暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)SCSIO 05746聚為一大支，但未能與某一種芽孢桿菌單獨聚為一支。為準確鑒定AH10分類地位，運用菌株AH10的gyrB基因及其同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。由圖2b可見，菌株AH10與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)D3單獨聚為一支。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征以及16S rRNA和gyrB基因的分子鑒定結(jié)果，確定分離菌株AH10和AQ1分別為解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 菌株AH10和AQ1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1a.菌株AH10和AQ1基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹；b.菌株AH10基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹.a.16S rRNA phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1； b.gyrB gene phylogenetic tree of strain AH10.

2.3 拮抗菌生長特性

溫度、pH和鹽度與解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1的生長關(guān)系見圖3。2菌株在24～37 ℃下均能生長，隨著溫度的升高，生長速度明顯增快，在32 ℃時達到峰值，之后有所下降，最適生長溫度為28～32 ℃。2株菌在pH為5～7時能夠正常生長，但過高或者過低的pH都將嚴重影響菌株的生長狀態(tài)，最適pH為5～7。鹽度與菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1的生長成負相關(guān)，在NaCl質(zhì)量分數(shù)0‰～50‰間，拮抗菌的生長速度隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的升高而降低，高于65‰時生長被完全抑制，其最適生長NaCl質(zhì)量分數(shù)為0‰～20‰。

圖3 菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1在不同pH、鹽度和溫度下的生長曲線(平均值±標準差)Fig.3 The growth curves of B. amyloliquefaciens AH10 and B. velezensis AQ1 under different pH, salinities and temperatures (means±SD)

2.4 拮抗菌抗菌譜

解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對10種指示菌的抗菌譜結(jié)果見圖4。解淀粉芽孢桿菌AH10除對耶爾森菌YR1和無乳鏈球菌WC1535無拮抗活性外，對其他8種指示菌均有較強的拮抗活性，其中：對類志賀鄰單胞菌LL1的拮抗活性最強，抑菌圈直徑達24 mm；對6種氣單胞菌的抑菌圈直徑為14～23 mm。貝萊斯芽孢桿菌AQ1除對無乳鏈球菌WC1535無拮抗活性外，對剩下9種指示菌均有較強拮抗活性，其中：對殺鮭氣單胞菌BG的拮抗活性最強，抑菌圈直徑達32 mm；對6種氣單胞菌的抑菌圈直徑為24～32 mm。

2.5 拮抗菌對抗生素的抗性測定

解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對28種抗生素的抗性結(jié)果見表2。解淀粉芽孢桿菌AH10僅對四環(huán)素耐藥，對鏈霉素和呋喃妥因中度敏感，對青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星等25種抗生素高度敏感；菌株貝萊斯芽孢桿菌AQ1對四環(huán)素和頭孢他啶2種抗生素耐藥，對鏈霉素和呋喃妥因中度敏感，對青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬古霉素等24種抗生素高度敏感。

表2 菌株AH10和AQ1的藥敏特性

2.6 拮抗菌對斑馬魚和鰱的致病性

菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對斑馬魚和鰱的致病性結(jié)果顯示：分別以2×105、2×106、2×107cfu/g劑量的菌液腹腔注射斑馬魚，連續(xù)觀察7 d，斑馬魚游動、攝食正常，未出現(xiàn)游動緩慢、打圈、離群獨游、腹腔或體表出血等病理或死亡現(xiàn)象，并且對照組也未出現(xiàn)不正?；蛩劳霈F(xiàn)象；分別以8×104、8×105、8×106cfu/g劑量的菌液腹腔注射鰱，連續(xù)觀察7 d，鰱游動、攝食正常，未出現(xiàn)游動緩慢、打圈、離群獨游、腹腔或體表出血等病理或死亡現(xiàn)象，且對照組也未出現(xiàn)異?；蛩劳霈F(xiàn)象。該試驗結(jié)果說明解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對斑馬魚的半致死劑量>2.0×107cfu/g，對鰱的半致死劑量>8.0×106cfu/g，表明2株菌對斑馬魚和鰱的生物安全性良好。

3 討 論

3.1 拮抗菌的來源

拮抗菌的來源在拮抗菌的篩選和應(yīng)用上是非常重要的一環(huán)，目前大部分報道的水產(chǎn)益生菌和拮抗菌產(chǎn)品均來源于魚類腸道、周邊水環(huán)境、底泥等[19-20]，來源的局限性阻礙了水產(chǎn)界拮抗菌和益生菌的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)速度，因而擴大來源，將目光轉(zhuǎn)向微生物種類和活性豐富的海洋及極端環(huán)境，是獲得更多新穎活性拮抗菌或益生菌的關(guān)鍵。紅樹林是熱帶或亞熱帶地區(qū)海洋和陸地環(huán)境之間的高產(chǎn)生態(tài)系統(tǒng)，其生長環(huán)境具有鹽脅迫、高礦物組成、強還原性、強酸性、頻繁潮汐、強風、高溫、缺氧等特征，沉積物中的微生物種類豐富并進化出了特殊的生理代謝系統(tǒng)[21-23]。從紅樹林中挖掘具有活性的代謝產(chǎn)物已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點[24-25]。金善釗[26]自紅樹林沉積物中分離篩選到草本植物菊芋的貯藏致病菌拮抗菌，為解決菊芋貯藏保鮮問題奠定了基礎(chǔ)；胡芮[27]自紅樹林沉積物中篩選到2株纖維素降解芽孢桿菌；孫超等[28]自漳州九龍江河口紅樹林沉積物中分離到降解纖維素、幾丁質(zhì)和木質(zhì)素的厭氧細菌等。這充分表明，紅樹林沉積物中微生物活性潛力較大，是進行功能微生物篩選和開發(fā)的重要來源。目前尚無自紅樹林中分離水產(chǎn)病原菌拮抗菌的報道。筆者首次以深圳東涌紅樹林沉積物為來源，篩選水產(chǎn)養(yǎng)殖中6種常見病原氣單胞菌的拮抗菌，結(jié)果顯示，自東涌紅樹林沉積物獲得的62株細菌中有9株菌對至少1種氣單胞菌展示出抑菌活性，其中2株(解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1)對6種氣單胞菌均具有較強的抑菌作用。該試驗結(jié)果表明，深圳東涌紅樹林沉積物中的芽孢桿菌種類豐富，這與已有研究結(jié)果[15-16]一致，說明東涌紅樹林沉積物是篩選水產(chǎn)病原菌拮抗菌的理想和重要環(huán)境來源。

3.2 拮抗芽孢桿菌的鑒定

通過表型鑒定、生理生化和生物信息學分析，筆者將菌株AQ1和AH10分別鑒定為貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

貝萊斯芽孢桿菌最初分離自西班牙馬拉加省貝萊斯河流的河口中，能夠水解淀粉和酪蛋白，可利用糖原、乳糖、甲基α-D-糖苷和D-棉子糖產(chǎn)酸，不能利用D-松二糖、精氨酸和鄰硝基酚-β-半乳糖苷[29]。菌株AQ1的生理生化特征與其具有顯著相似性。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株AQ1在基因水平上與貝萊斯芽孢桿菌高度同源，與貝萊斯芽孢桿菌FJAT-45028、JJ-D34單獨聚為一支[30-31]?；谏砩卣骷胺肿舆z傳分析，鑒定菌株AQ1為貝萊斯芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，與枯草芽孢桿菌在形態(tài)和生理生化特性上相似，于1987年被Priest等[32]正式命名，其顯著特性就是能夠水解淀粉和明膠，是α淀粉酶和蛋白酶的常用生產(chǎn)菌株。鑒于解淀粉芽孢桿菌形態(tài)、培養(yǎng)特征多樣而復(fù)雜，并且其與貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌等在16S rRNA基因水平上具有較高相似性，因此傳統(tǒng)的分類學方法，包括形態(tài)、生理生化特征、細胞壁組成和16S rRNA序列等難以有效對芽孢桿菌菌種進行準確鑒定[33-34]。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展和基因測序成本的不斷降低，保守管家基因或基因組序列進化分析被廣泛用于分離芽孢桿菌的鑒定與分類，常用的保守基因有g(shù)yrA、gyrB和rpoB等[35-37]。筆者同時利用16S rRNA和gyrB基因?qū)闍H10進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)合形態(tài)和生理生化特性，最終鑒定菌株AH10為解淀粉芽孢桿菌[38]。試驗結(jié)果證實，gyrB基因的鑒定準確性遠高于16S rRNA基因。

3.3 拮抗芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有廣譜抗菌及促植物生長作用，能有效抑制多種植物病原菌，防控多種植物病害[30]。研究發(fā)現(xiàn)，從魚腸道等處分離的貝萊斯芽孢桿菌，不僅能夠拮抗病原菌，還對魚的生長、免疫和抗病能力等有一定的促進作用。Yi等[39]自鯉腸道中分離到1株貝萊斯芽孢桿菌JW，可拮抗嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)等水產(chǎn)病原菌，通過飼喂鯽，增強鯽的免疫力和對嗜水氣單胞菌的抗病力；王金燕等[40]自仿刺參(Apostichopusjaponicus)養(yǎng)殖池塘底泥中分離到的貝萊斯芽孢桿菌DY-6，能夠顯著拮抗假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)和多種弧菌等病原菌，并且投喂仿刺參可顯著降低仿刺參的發(fā)病率；高艷俠等[41]自羅非魚腸道中分離到貝萊斯芽孢桿菌LF01，其能夠抑制多種魚類病原菌，投喂羅非魚后，能夠顯著增強羅非魚的免疫和抗病能力，同時降低愛德華氏菌和假單胞菌等有害菌在羅非魚腸道中的豐度，改善羅非魚腸道菌群益生菌的比例和多樣性[42]。與貝萊斯芽孢桿菌相似，解淀粉芽孢桿菌不僅是α淀粉酶重要生產(chǎn)菌株，還是常見的植物內(nèi)生益生菌，在玉米、大豆和甘蔗等農(nóng)作物中廣泛分布，通過自身分泌的次級代謝產(chǎn)物來促進植物生長，增強植物的抗病能力[43]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，已有諸多研究報道了解淀粉芽孢桿菌的生物防治屬性，其拮抗作用非常明顯。朱芝秀等[44]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌對自病死中華鱉(Pelodiscussinensis)中分離到的4株維氏氣單胞菌有顯著的抑制作用，有望用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物維氏氣單胞菌的防治；傅超英等[45]自大黃魚(Larimichthyscrocea)及周邊環(huán)境中篩選出2株淀粉芽孢桿菌，其對溶藻弧菌(V.alginolyticus)、殺香魚假單胞菌(P.plecoglossicida)有良好拮抗作用，對創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcussp.)均有良好拮抗作用，安全性試驗也表明，其對多種水產(chǎn)動物不具有致病性。

上述研究報道的拮抗菌多對氣單胞菌中的2～4種具有拮抗作用，暫無對6種及以上的氣單胞菌同時具有抑菌活性的拮抗菌的報道。筆者分離獲得的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌和舒氏氣單胞菌等6種水產(chǎn)病原氣單胞菌均展示出明顯的抑菌效果，且2株菌對斑馬魚和鰱的安全性良好。該發(fā)現(xiàn)填補了目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中無可同時拮抗多種氣單胞菌的拮抗菌及相關(guān)微生物制劑的空白，為水產(chǎn)氣單胞菌病的生物防控提供了重要的微生物資源和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

氣單胞菌是我國養(yǎng)殖魚類最重要的病原菌之一，能誘發(fā)不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動物產(chǎn)生多種疾病，常見的如出血性敗血癥和潰瘍性綜合征等。作為魚類和貝類疾病的主要病原菌，目前尚無針對多種氣單胞菌的有效生物防治方法。筆者獲得的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌對多達6種氣單胞菌均具有顯著抑菌效果，抑菌圈直徑分別達14～23 mm和24～32 mm，對溫度和鹽度有廣泛適應(yīng)性，為廣溫廣鹽菌株，對大多數(shù)抗生素高度敏感，且對魚無明顯致病性，安全可靠。因此，這2株菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有巨大應(yīng)用潛力和廣闊應(yīng)用前景。