龍 夢(mèng)，樊慧敏，江 遙，夏洪麗，程 俊，喻大鵬，夏立群,4，魯義善,4

( 1.廣東海洋大學(xué) 深圳研究院，廣東省水生動(dòng)物健康評(píng)估工程技術(shù)研究中心，深圳市海水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種苗健康評(píng)價(jià)公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，廣東 深圳 518120； 2.深圳市大鵬新區(qū)科技創(chuàng)新服務(wù)中心，廣東 深圳 518120； 3.中國(guó)科學(xué)院 水生生物研究所，湖北 武漢 430072； 4.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

氣單胞菌屬(Aeromonas)是一類(lèi)革蘭氏陰性短桿菌，在自然界中廣泛分布，是養(yǎng)殖水生動(dòng)物暴發(fā)性傳染病的重要病原菌，其中部分種類(lèi)也是人—畜—魚(yú)共患病原菌。在環(huán)境脅迫或條件合適的情況下，氣單胞菌可引起魚(yú)類(lèi)，如青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiusauratus)等，貝類(lèi)及蝦、蟹類(lèi)等發(fā)病[1]。氣單胞菌屬根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育所需溫度范圍及是否有動(dòng)力分為兩大類(lèi)，即嗜溫有動(dòng)力氣單胞菌和嗜冷無(wú)動(dòng)力氣單胞菌。嗜溫有動(dòng)力氣單胞菌包括嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、舒氏氣單胞菌(A.schubertii)等，嗜冷無(wú)動(dòng)力氣單胞菌僅包含殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)1種細(xì)菌[2]。氣單胞菌可單獨(dú)或幾種細(xì)菌混合感染致病，引發(fā)出血性敗血癥、腸炎、腹水病、癤瘡病等[3-5]。其中以出血性敗血癥危害魚(yú)的種類(lèi)最多、范圍最大、流行季節(jié)最長(zhǎng)及造成的損失最大，對(duì)我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖造成持續(xù)性的威脅[6-7]。

目前，我國(guó)對(duì)氣單胞菌病的控制方法主要有抗生素、化學(xué)藥物和疫苗等，但大量使用藥物帶來(lái)的藥物殘留、耐藥基因傳播以及耐藥菌的產(chǎn)生等問(wèn)題，已嚴(yán)重危及環(huán)境和人體健康，而針對(duì)氣單胞菌的疫苗當(dāng)前我國(guó)批準(zhǔn)的僅有嗜水氣單胞菌滅活疫苗[8-10]。生物防治是利用拮抗菌抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，使有害微生物的密度低于其致病密度，從而達(dá)到防控疾病的目的。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的病原菌拮抗菌包括芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌、酵母菌等。其中芽孢桿菌以具有耐高溫，耐酸堿，抗擠壓，能分泌產(chǎn)生氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)這些符合益生菌的優(yōu)點(diǎn)以及分布范圍極其廣泛而受到重點(diǎn)關(guān)注，應(yīng)用較為普遍的拮抗菌株有枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)等[11-14]。

已有研究表明，紅樹(shù)林沉積物中微生物種類(lèi)和活性豐富，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)物種[15-16]。鑒于深圳紅樹(shù)林沉積物的微生物目前尚未被系統(tǒng)研究和開(kāi)發(fā)，筆者以深圳東涌紅樹(shù)林沉積物作為菌種分離來(lái)源，運(yùn)用點(diǎn)種法和打孔法等篩選方法，篩選和分離6種常見(jiàn)病原性氣單胞菌的拮抗菌株，并對(duì)篩選獲得的2株抑菌活性較強(qiáng)、抑菌譜較廣的拮抗芽孢桿菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和生物學(xué)特性分析，運(yùn)用模式生物斑馬魚(yú)(Daniorerio)和氣單胞菌易感宿主鰱驗(yàn)證拮抗菌的生物安全性，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖氣單胞菌病的生物防治及相關(guān)生物制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅樹(shù)林沉積物，采集于廣東深圳東涌紅樹(shù)林。試驗(yàn)用鰱(體長(zhǎng)8～10 cm，體質(zhì)量9～11 g)、斑馬魚(yú)(體長(zhǎng)1.5～3.0 cm，體質(zhì)量2～3 g)均購(gòu)自廣州市花都區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。拮抗菌篩選用指示菌包括6種水產(chǎn)氣單胞菌：鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧(Channaargus)源舒氏氣單胞菌HYK1、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌(A.media)4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210。目標(biāo)拮抗菌抑菌譜測(cè)定用指示菌除以上6種氣單胞菌外，還包括黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)源愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)HSA-1、鰱源類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)LL1、鰱源耶爾森菌(Yersiniaruckeri)YR1、羅非魚(yú)(Oreochromis)源無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)WC1535等。這些菌株均分離自患病魚(yú)體，并為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 氣單胞菌拮抗菌的分離與篩選

1.2.1 細(xì)菌的分離純化

2019年9月13日于深圳東涌紅樹(shù)林采集表層沉積物(深度5～10 cm)，放入裝有冰袋的保溫箱并于12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理。取3 g沉積物加入無(wú)菌海水定容至30 mL(稀釋10倍)作為母液，進(jìn)而對(duì)母液進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)纬?、10-1、10-2、10-3、10-4等5個(gè)梯度，每個(gè)梯度取100 μL于2216E固體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，磷酸鐵0.01 g，牛肉膏1 g，海水1 L，pH 7.4～7.6)無(wú)菌均勻涂布，每個(gè)密度3個(gè)平行。置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～96 h，挑取形態(tài)、顏色不同的單菌落，在2216E平板上劃線純化，培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落后，再次挑取單菌落于2216E平板劃線純化至獲得形態(tài)顏色單一的單菌落，然后挑取單菌落于2216E液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)24～48 h，菌液中加入無(wú)菌甘油至終體積分?jǐn)?shù)為20%，做好標(biāo)記保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 拮抗菌的篩選

以鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧源舒氏氣單胞菌HYK1、團(tuán)頭魴源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210等6株病原氣單胞菌作為指示菌，采用初篩和復(fù)篩的方法對(duì)以上紅樹(shù)林分離菌進(jìn)行拮抗菌的篩選。

初篩：采用點(diǎn)種法對(duì)分離菌株進(jìn)行初篩，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，再分別吸取紅樹(shù)林分離菌菌液3.0 μL點(diǎn)種，等距離于同一平板重復(fù)點(diǎn)種3次，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，記錄出現(xiàn)明顯抑菌圈的菌株。

復(fù)篩：采用打孔法對(duì)上述有明顯抑菌圈的分離菌株進(jìn)行復(fù)篩。同樣以6種氣單胞菌作為指示菌，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌打孔器在同一平皿上等距離打3個(gè)孔，孔徑約6 mm，每個(gè)孔中加入80 μL經(jīng)初篩發(fā)現(xiàn)有抑菌活性的拮抗菌菌液，然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑，選定目標(biāo)拮抗菌。通過(guò)初篩和復(fù)篩，共獲得2株對(duì)指示菌均具有較好抑菌效果的拮抗菌，即AH10和AQ1。

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察

將菌株AH10和AQ1無(wú)菌劃線于2216E平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、濕潤(rùn)度等。挑取平板上的單菌落，經(jīng)涂片、固定和革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察拍照，同時(shí)，挑取單菌落用電鏡固定液固定，并于透射電子顯微鏡(日立,日本)下觀察拍照。

1.3.2 生理生化活性測(cè)定

將菌株AH10和AQ1分別接種至2216E固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)約12～24 h至菌液密度達(dá)1×108cfu/mL，用細(xì)菌生化鑒定試劑盒(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)進(jìn)行接觸酶、氧化酶、淀粉、苯丙氨酸、硫化氫、明膠、擴(kuò)散生長(zhǎng)、硝酸鹽還原、西蒙氏枸椽酸鹽、β-半乳糖苷酶、靛基質(zhì)、賴(lài)氨酸脫羧酶、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇和VP生理生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

16S rRNA基因序列克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析：采用瑞真生物細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌菌株基因組DNA，以其為模板用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物 (27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)和gyrB基因引物(UP-1S: GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，UP-2Sr：AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCC)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，呈現(xiàn)單一的目的條帶，約為1.5 kb(16S rRNA基因)和0.7 kb(gyrB基因)。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心中經(jīng)BLAST同源性比較分析，并利用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 拮抗菌生長(zhǎng)特性分析

將密度為1×108cfu/mL的AH10和AQ1菌液以1∶100(體積比)的比例轉(zhuǎn)接至100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，分別在24、28、32、37 ℃下恒溫?fù)u床中以200 r/min培養(yǎng)18 h，每隔2 h取250 μL菌液于96孔酶標(biāo)板小孔中，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，于酶標(biāo)儀中測(cè)定D(600 nm)；按上述方法，將一定密度的菌液按比例轉(zhuǎn)接至初始pH為3、5、7、9、11的2216E液體培養(yǎng)基中，在測(cè)定的最適溫度下200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)；按上述方法，將一定密度的菌液按比例轉(zhuǎn)接至初始NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0‰、5‰、20‰、35‰、50‰、65‰、80‰的2216E液體培養(yǎng)基中，在測(cè)定的最適溫度和pH下以200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，以確定最適生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 拮抗菌抑菌譜測(cè)定

采用打孔法對(duì)AH10和AQ1對(duì)常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)致病菌的抑菌譜進(jìn)行測(cè)定，所用指示菌包括：鰱源嗜水氣單胞菌4LNC202、烏鱧源舒氏氣單胞菌HYK1、團(tuán)頭魴源維氏氣單胞菌IH317、鰱源中間氣單胞菌4LNC214、鮭源殺鮭氣單胞菌BG、鰱源豚鼠氣單胞菌4LNC210、黃顙魚(yú)源愛(ài)德華氏菌HSA-1、鰱源類(lèi)志賀鄰單胞菌LL1、鰱源耶爾森菌YR1、羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌WC1535等。分別吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[D(600 nm)=0.3～0.4]指示菌菌液100 μL均勻涂布到BHI固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌打孔器在同一平皿上等距離打3個(gè)孔，孔直徑約6 mm，每個(gè)孔中加入80 μL拮抗菌(AH10或AQ1)菌液[D(600 nm)=0.3～0.4]，然后將平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.6 拮抗菌生物安全性分析

1.6.1 拮抗菌的耐藥性測(cè)定

將AH10和AQ1菌液密度稀釋至1×107cfu/mL，取200 μL稀釋菌液，均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)AH10和AQ1對(duì)9大類(lèi)29種抗生素的敏感性，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、糖肽類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、磺胺類(lèi)和氯霉素類(lèi)。根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》判定拮抗菌對(duì)各種抗生素的耐藥性。

1.6.2 拮抗菌對(duì)斑馬魚(yú)的致病性

試驗(yàn)用斑馬魚(yú)體長(zhǎng)1.5～3.0 cm，體質(zhì)量2～3 g，設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，分別在裝有5 L曝氣自來(lái)水的塑料缸中放入斑馬魚(yú)20尾，水溫22～24 ℃。試驗(yàn)組分別腹腔注射50 μL密度為8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，對(duì)照組注射相同體積的磷酸緩沖鹽溶液，連續(xù)10 d觀察并記錄斑馬魚(yú)的存活狀態(tài)。

1.6.3 拮抗菌對(duì)鰱的致病性

試驗(yàn)用鰱體長(zhǎng)8～10 cm，體質(zhì)量9～11 g，設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，分別在裝有10 L曝氣自來(lái)水的塑料缸中放入10尾鰱，水溫22～24 ℃。試驗(yàn)組分別腹腔注射100 μL密度為8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，對(duì)照組注射相同體積的磷酸緩沖鹽溶液，連續(xù)10 d觀察并記錄鰱的存活狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌的分離和篩選

自深圳東涌紅樹(shù)林沉積物中共分離純化細(xì)菌62株，經(jīng)初篩，有9株菌對(duì)至少1種指示菌具有拮抗活性。對(duì)這9株菌進(jìn)行復(fù)篩，篩選到2株對(duì)嗜水氣單胞菌、舒氏氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌6種氣單胞菌指示菌均具有拮抗活性且拮抗活性較強(qiáng)的分離菌，將這2株拮抗菌命名為AH10和AQ1。

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

分離菌株AH10接種于2216E固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約為1.0～3.0 mm，菌落不透明、干燥、呈乳白色、中間較厚、形狀接近圓形、表面粗糙、邊緣缺刻狀(圖1a)，革蘭氏染色呈紫色(圖1b)。顯微鏡下觀察到細(xì)菌呈短桿狀，透射電鏡下觀察到菌體完整形態(tài)，具有細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)(圖1c)。

分離菌株AQ1接種于2216E固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約為1.0～2.5 mm，菌落不透明、濕潤(rùn)、具有黏性、呈乳白偏黃色、向上隆起、圓形、邊緣整齊規(guī)則(圖1d)，革蘭氏染色呈藍(lán)紫色(圖1e)。顯微鏡下觀察到細(xì)菌呈短桿狀，透射電鏡下觀察到菌體完整形態(tài)，具有細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)(圖1f)。

圖1 菌株AH10(a、b、c)和AQ1(d、e、f)的菌體表型Fig.1 The phenotypes of strains AH10 (a, b, c) and AQ1 (d, e, f)a、d.在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；b、e.革蘭氏染色；c、f.透射電鏡下的菌體形態(tài).a,d.colonial morphologies on 2216E agar plate; b, e.gram staining under microscope; c, f.mycelial morphologies under transmission electron microscopy.

以上結(jié)果表明，菌株AH10和AQ1均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。

2.2.2 生理生化特性

菌株AH10和AQ1的生理生化結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株AH10和AQ1能夠利用蔗糖、葡萄糖和淀粉，不能利用半乳糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇，接觸酶反應(yīng)、明膠試驗(yàn)、硝酸鹽還原呈陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)、苯丙氨酸、硫化氫、賴(lài)氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性。菌株AH10與AQ1的不同之處在于：AH10能夠利用西蒙氏枸椽酸鹽，β-半乳糖苷酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性；AQ1不能利用西蒙氏枸椽酸鹽，β-半乳糖苷酶試驗(yàn)陰性。參照文獻(xiàn)[17]和[18]，初步鑒定菌株AH10和AQ1為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

表1 菌株AH10 和AQ1的生理生化特征

2.2.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析

通過(guò)16S rRNA基因克隆和測(cè)序獲得AH10和AQ1的16S rRNA基因序列，經(jīng)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心BLAST同源性比較分析，取同源性較高的基因序列通過(guò)MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2a可見(jiàn)：菌株AQ1與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34單獨(dú)聚為一支；菌株AH10與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YS52，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)MD33，暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)SCSIO 05746聚為一大支，但未能與某一種芽孢桿菌單獨(dú)聚為一支。為準(zhǔn)確鑒定AH10分類(lèi)地位，運(yùn)用菌株AH10的gyrB基因及其同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。由圖2b可見(jiàn)，菌株AH10與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)D3單獨(dú)聚為一支。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征以及16S rRNA和gyrB基因的分子鑒定結(jié)果，確定分離菌株AH10和AQ1分別為解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 菌株AH10和AQ1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1a.菌株AH10和AQ1基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；b.菌株AH10基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).a.16S rRNA phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1； b.gyrB gene phylogenetic tree of strain AH10.

2.3 拮抗菌生長(zhǎng)特性

溫度、pH和鹽度與解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1的生長(zhǎng)關(guān)系見(jiàn)圖3。2菌株在24～37 ℃下均能生長(zhǎng)，隨著溫度的升高，生長(zhǎng)速度明顯增快，在32 ℃時(shí)達(dá)到峰值，之后有所下降，最適生長(zhǎng)溫度為28～32 ℃。2株菌在pH為5～7時(shí)能夠正常生長(zhǎng)，但過(guò)高或者過(guò)低的pH都將嚴(yán)重影響菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，最適pH為5～7。鹽度與菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1的生長(zhǎng)成負(fù)相關(guān)，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0‰～50‰間，拮抗菌的生長(zhǎng)速度隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低，高于65‰時(shí)生長(zhǎng)被完全抑制，其最適生長(zhǎng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0‰～20‰。

圖3 菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1在不同pH、鹽度和溫度下的生長(zhǎng)曲線(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Fig.3 The growth curves of B. amyloliquefaciens AH10 and B. velezensis AQ1 under different pH, salinities and temperatures (means±SD)

2.4 拮抗菌抗菌譜

解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對(duì)10種指示菌的抗菌譜結(jié)果見(jiàn)圖4。解淀粉芽孢桿菌AH10除對(duì)耶爾森菌YR1和無(wú)乳鏈球菌WC1535無(wú)拮抗活性外，對(duì)其他8種指示菌均有較強(qiáng)的拮抗活性，其中：對(duì)類(lèi)志賀鄰單胞菌LL1的拮抗活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)24 mm；對(duì)6種氣單胞菌的抑菌圈直徑為14～23 mm。貝萊斯芽孢桿菌AQ1除對(duì)無(wú)乳鏈球菌WC1535無(wú)拮抗活性外，對(duì)剩下9種指示菌均有較強(qiáng)拮抗活性，其中：對(duì)殺鮭氣單胞菌BG的拮抗活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)32 mm；對(duì)6種氣單胞菌的抑菌圈直徑為24～32 mm。

2.5 拮抗菌對(duì)抗生素的抗性測(cè)定

解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對(duì)28種抗生素的抗性結(jié)果見(jiàn)表2。解淀粉芽孢桿菌AH10僅對(duì)四環(huán)素耐藥，對(duì)鏈霉素和呋喃妥因中度敏感，對(duì)青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星等25種抗生素高度敏感；菌株貝萊斯芽孢桿菌AQ1對(duì)四環(huán)素和頭孢他啶2種抗生素耐藥，對(duì)鏈霉素和呋喃妥因中度敏感，對(duì)青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬(wàn)古霉素等24種抗生素高度敏感。

表2 菌株AH10和AQ1的藥敏特性

2.6 拮抗菌對(duì)斑馬魚(yú)和鰱的致病性

菌株解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對(duì)斑馬魚(yú)和鰱的致病性結(jié)果顯示：分別以2×105、2×106、2×107cfu/g劑量的菌液腹腔注射斑馬魚(yú)，連續(xù)觀察7 d，斑馬魚(yú)游動(dòng)、攝食正常，未出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、打圈、離群獨(dú)游、腹腔或體表出血等病理或死亡現(xiàn)象，并且對(duì)照組也未出現(xiàn)不正?；蛩劳霈F(xiàn)象；分別以8×104、8×105、8×106cfu/g劑量的菌液腹腔注射鰱，連續(xù)觀察7 d，鰱游動(dòng)、攝食正常，未出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、打圈、離群獨(dú)游、腹腔或體表出血等病理或死亡現(xiàn)象，且對(duì)照組也未出現(xiàn)異常或死亡現(xiàn)象。該試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1對(duì)斑馬魚(yú)的半致死劑量>2.0×107cfu/g，對(duì)鰱的半致死劑量>8.0×106cfu/g，表明2株菌對(duì)斑馬魚(yú)和鰱的生物安全性良好。

3 討 論

3.1 拮抗菌的來(lái)源

拮抗菌的來(lái)源在拮抗菌的篩選和應(yīng)用上是非常重要的一環(huán)，目前大部分報(bào)道的水產(chǎn)益生菌和拮抗菌產(chǎn)品均來(lái)源于魚(yú)類(lèi)腸道、周邊水環(huán)境、底泥等[19-20]，來(lái)源的局限性阻礙了水產(chǎn)界拮抗菌和益生菌的發(fā)現(xiàn)及開(kāi)發(fā)速度，因而擴(kuò)大來(lái)源，將目光轉(zhuǎn)向微生物種類(lèi)和活性豐富的海洋及極端環(huán)境，是獲得更多新穎活性拮抗菌或益生菌的關(guān)鍵。紅樹(shù)林是熱帶或亞熱帶地區(qū)海洋和陸地環(huán)境之間的高產(chǎn)生態(tài)系統(tǒng)，其生長(zhǎng)環(huán)境具有鹽脅迫、高礦物組成、強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、頻繁潮汐、強(qiáng)風(fēng)、高溫、缺氧等特征，沉積物中的微生物種類(lèi)豐富并進(jìn)化出了特殊的生理代謝系統(tǒng)[21-23]。從紅樹(shù)林中挖掘具有活性的代謝產(chǎn)物已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[24-25]。金善釗[26]自紅樹(shù)林沉積物中分離篩選到草本植物菊芋的貯藏致病菌拮抗菌，為解決菊芋貯藏保鮮問(wèn)題奠定了基礎(chǔ)；胡芮[27]自紅樹(shù)林沉積物中篩選到2株纖維素降解芽孢桿菌；孫超等[28]自漳州九龍江河口紅樹(shù)林沉積物中分離到降解纖維素、幾丁質(zhì)和木質(zhì)素的厭氧細(xì)菌等。這充分表明，紅樹(shù)林沉積物中微生物活性潛力較大，是進(jìn)行功能微生物篩選和開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。目前尚無(wú)自紅樹(shù)林中分離水產(chǎn)病原菌拮抗菌的報(bào)道。筆者首次以深圳東涌紅樹(shù)林沉積物為來(lái)源，篩選水產(chǎn)養(yǎng)殖中6種常見(jiàn)病原氣單胞菌的拮抗菌，結(jié)果顯示，自東涌紅樹(shù)林沉積物獲得的62株細(xì)菌中有9株菌對(duì)至少1種氣單胞菌展示出抑菌活性，其中2株(解淀粉芽孢桿菌AH10和貝萊斯芽孢桿菌AQ1)對(duì)6種氣單胞菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用。該試驗(yàn)結(jié)果表明，深圳東涌紅樹(shù)林沉積物中的芽孢桿菌種類(lèi)豐富，這與已有研究結(jié)果[15-16]一致，說(shuō)明東涌紅樹(shù)林沉積物是篩選水產(chǎn)病原菌拮抗菌的理想和重要環(huán)境來(lái)源。

3.2 拮抗芽孢桿菌的鑒定

通過(guò)表型鑒定、生理生化和生物信息學(xué)分析，筆者將菌株AQ1和AH10分別鑒定為貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

貝萊斯芽孢桿菌最初分離自西班牙馬拉加省貝萊斯河流的河口中，能夠水解淀粉和酪蛋白，可利用糖原、乳糖、甲基α-D-糖苷和D-棉子糖產(chǎn)酸，不能利用D-松二糖、精氨酸和鄰硝基酚-β-半乳糖苷[29]。菌株AQ1的生理生化特征與其具有顯著相似性。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株AQ1在基因水平上與貝萊斯芽孢桿菌高度同源，與貝萊斯芽孢桿菌FJAT-45028、JJ-D34單獨(dú)聚為一支[30-31]。基于生理生化特征及分子遺傳分析，鑒定菌株AQ1為貝萊斯芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，與枯草芽孢桿菌在形態(tài)和生理生化特性上相似，于1987年被Priest等[32]正式命名，其顯著特性就是能夠水解淀粉和明膠，是α淀粉酶和蛋白酶的常用生產(chǎn)菌株。鑒于解淀粉芽孢桿菌形態(tài)、培養(yǎng)特征多樣而復(fù)雜，并且其與貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌等在16S rRNA基因水平上具有較高相似性，因此傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)方法，包括形態(tài)、生理生化特征、細(xì)胞壁組成和16S rRNA序列等難以有效對(duì)芽孢桿菌菌種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[33-34]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和基因測(cè)序成本的不斷降低，保守管家基因或基因組序列進(jìn)化分析被廣泛用于分離芽孢桿菌的鑒定與分類(lèi)，常用的保守基因有g(shù)yrA、gyrB和rpoB等[35-37]。筆者同時(shí)利用16S rRNA和gyrB基因?qū)闍H10進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)合形態(tài)和生理生化特性，最終鑒定菌株AH10為解淀粉芽孢桿菌[38]。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，gyrB基因的鑒定準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于16S rRNA基因。

3.3 拮抗芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有廣譜抗菌及促植物生長(zhǎng)作用，能有效抑制多種植物病原菌，防控多種植物病害[30]。研究發(fā)現(xiàn)，從魚(yú)腸道等處分離的貝萊斯芽孢桿菌，不僅能夠拮抗病原菌，還對(duì)魚(yú)的生長(zhǎng)、免疫和抗病能力等有一定的促進(jìn)作用。Yi等[39]自鯉腸道中分離到1株貝萊斯芽孢桿菌JW，可拮抗嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)等水產(chǎn)病原菌，通過(guò)飼喂鯽，增強(qiáng)鯽的免疫力和對(duì)嗜水氣單胞菌的抗病力；王金燕等[40]自仿刺參(Apostichopusjaponicus)養(yǎng)殖池塘底泥中分離到的貝萊斯芽孢桿菌DY-6，能夠顯著拮抗假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)和多種弧菌等病原菌，并且投喂仿刺參可顯著降低仿刺參的發(fā)病率；高艷俠等[41]自羅非魚(yú)腸道中分離到貝萊斯芽孢桿菌LF01，其能夠抑制多種魚(yú)類(lèi)病原菌，投喂羅非魚(yú)后，能夠顯著增強(qiáng)羅非魚(yú)的免疫和抗病能力，同時(shí)降低愛(ài)德華氏菌和假單胞菌等有害菌在羅非魚(yú)腸道中的豐度，改善羅非魚(yú)腸道菌群益生菌的比例和多樣性[42]。與貝萊斯芽孢桿菌相似，解淀粉芽孢桿菌不僅是α淀粉酶重要生產(chǎn)菌株，還是常見(jiàn)的植物內(nèi)生益生菌，在玉米、大豆和甘蔗等農(nóng)作物中廣泛分布，通過(guò)自身分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗病能力[43]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，已有諸多研究報(bào)道了解淀粉芽孢桿菌的生物防治屬性，其拮抗作用非常明顯。朱芝秀等[44]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌對(duì)自病死中華鱉(Pelodiscussinensis)中分離到的4株維氏氣單胞菌有顯著的抑制作用，有望用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物維氏氣單胞菌的防治；傅超英等[45]自大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)及周邊環(huán)境中篩選出2株淀粉芽孢桿菌，其對(duì)溶藻弧菌(V.alginolyticus)、殺香魚(yú)假單胞菌(P.plecoglossicida)有良好拮抗作用，對(duì)創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcussp.)均有良好拮抗作用，安全性試驗(yàn)也表明，其對(duì)多種水產(chǎn)動(dòng)物不具有致病性。

上述研究報(bào)道的拮抗菌多對(duì)氣單胞菌中的2～4種具有拮抗作用，暫無(wú)對(duì)6種及以上的氣單胞菌同時(shí)具有抑菌活性的拮抗菌的報(bào)道。筆者分離獲得的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、類(lèi)志賀鄰單胞菌和舒氏氣單胞菌等6種水產(chǎn)病原氣單胞菌均展示出明顯的抑菌效果，且2株菌對(duì)斑馬魚(yú)和鰱的安全性良好。該發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中無(wú)可同時(shí)拮抗多種氣單胞菌的拮抗菌及相關(guān)微生物制劑的空白，為水產(chǎn)氣單胞菌病的生物防控提供了重要的微生物資源和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

氣單胞菌是我國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)最重要的病原菌之一，能誘發(fā)不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生多種疾病，常見(jiàn)的如出血性敗血癥和潰瘍性綜合征等。作為魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)疾病的主要病原菌，目前尚無(wú)針對(duì)多種氣單胞菌的有效生物防治方法。筆者獲得的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌對(duì)多達(dá)6種氣單胞菌均具有顯著抑菌效果，抑菌圈直徑分別達(dá)14～23 mm和24～32 mm，對(duì)溫度和鹽度有廣泛適應(yīng)性，為廣溫廣鹽菌株，對(duì)大多數(shù)抗生素高度敏感，且對(duì)魚(yú)無(wú)明顯致病性，安全可靠。因此，這2株菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有巨大應(yīng)用潛力和廣闊應(yīng)用前景。