畢光耀，丁怡寧，王 麗，胡賽文，李賀敏，雷 明，張占江，夏 至*

洋金花與木本曼陀羅葉綠體基因組特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析

畢光耀1，丁怡寧1，王 麗2，胡賽文1，李賀敏1，雷 明3，張占江3，夏 至1*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 方城縣柳河農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣區(qū)域站，河南 方城 473200 3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023

以洋金花和木本曼陀羅為材料，分析其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和特征，基于葉綠體組數(shù)據(jù)探討洋金花和木本曼陀羅及茄科其他物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。利用華大MGISEQ-2000PE150測(cè)序平臺(tái)，雙末端測(cè)序策略對(duì)基因組DNA建庫(kù)測(cè)序，用NOVOPlasty組裝葉綠體基因組，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組全長(zhǎng)為155 934 bp和155 939 bp，分別包含131和130個(gè)基因，GC值32.3%，具有典型的四分區(qū)域結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、1對(duì)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeats，IR）和1個(gè)小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC），各區(qū)域序列長(zhǎng)度分別為86 354、86 278、25 609、25 720、18 362、18 221 bp。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，洋金花與曼陀羅屬的曼陀羅構(gòu)成1單系分支，具有100%支持率，而木本曼陀羅屬與曼陀羅屬構(gòu)成單系分支，具有100%支持率。結(jié)果支持洋金花隸屬于曼陀羅屬，與曼陀羅親緣關(guān)系較近，木本的木曼陀羅屬?gòu)穆恿_屬分出，獨(dú)立為一個(gè)屬。洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組信息為后期分子鑒定和群體遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

洋金花；木本曼陀羅；葉綠體全基因組；組裝；系統(tǒng)發(fā)育

藥用植物洋金花L.來(lái)源于茄科（Solanaceae）曼陀羅屬L.，為一年生草本[1]，在《中國(guó)藥典》2020年版中以干燥花入藥，中藥材名為洋金花[2]。洋金花有效成分為東莨菪堿，臨床具有平喘止咳、解痙定痛的功效。用于哮喘咳嗽、皖腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、小兒慢驚及外科麻醉[2]。木本曼陀羅(L.) Lagerh.隸屬于木曼陀羅屬L.，原產(chǎn)于南美洲，我國(guó)引入栽培?！吨袊?guó)植物志》將木曼陀羅屬作為一個(gè)組放在曼陀羅屬[1]，2者系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一直存在爭(zhēng)議。近年來(lái)，基于分子條形碼序列的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果支持木曼陀羅屬為一個(gè)獨(dú)立的屬[3]。曼陀羅屬植物在我國(guó)分布范圍廣，生態(tài)適應(yīng)幅度大，導(dǎo)致該屬植物在形態(tài)上產(chǎn)生很多變異，種內(nèi)的遺傳變異十分顯著，且該屬植物花部特征相似，不易區(qū)分[4]，形態(tài)鑒別困難。中藥材洋金花常見的偽品來(lái)源于其近緣種曼陀羅L.和毛曼陀羅Miller的花[5]。此外木本曼陀羅(L.) Lagerh.的花東莨菪堿含量較高，也常被誤用作洋金花使用[4]，嚴(yán)重影響洋金花中醫(yī)臨床用藥安全。近年來(lái)，有關(guān)洋金花的研究主要集中在化學(xué)成分分析和藥理學(xué)研究等方面[6-7]，藥用植物洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組組裝、特征和系統(tǒng)進(jìn)化分析未見報(bào)道。

葉綠體是植物最重要的細(xì)胞器之一，具有一整套用于光合作用、能量代謝、蛋白質(zhì)合成及氮、硫同化相關(guān)的基因，分布在大小為120～180 kb的環(huán)狀基因組上，具有結(jié)構(gòu)保守、母性遺傳等特點(diǎn)[8-9]。葉綠體基因組一般為閉環(huán)雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，陸生植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)通常由1個(gè)大單拷貝區(qū)域（large single copy，LSC）、1個(gè)短單拷貝區(qū)域（small single copy，SSC）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)域（inverted repeat，IR）組成[10]。葉綠體基因組擁有相對(duì)獨(dú)立的基因組和遺傳序列，并且不像核基因組一般有著復(fù)雜的重復(fù)序列，其基因序列保守，間隔區(qū)變異位點(diǎn)豐富，適宜的進(jìn)化速率能夠?yàn)橹参锊煌燃?jí)的親緣關(guān)系，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及遺傳多樣性研究提供較為可靠的信息[10]。

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)，測(cè)序平臺(tái)的不斷升級(jí)，一系列組裝和注釋軟件如plasmid SPAdes[11]、NOVOPlasty[12]、GetOrganelle[13]等的開發(fā)與更新，多種重要的藥用植物葉綠體基因組已完成測(cè)序和分析，如人參C. A. Meyer[14]、紅豆杉var.(Pilger) Florin[15]、三七(Burkill) F. H. Chen ex C. Chow & W. G. Huang.[16]、鐵皮石斛Kimura et Migo[17]、地黃(Gaert.) Libosch. ex Fisch. et Mey.[18]、射干(L.) Redouté[19]、連翹(Thunb.) Vahl[20]等的葉綠體全基因組序列的分析已有相關(guān)報(bào)道。本研究以洋金花和木本曼陀羅為材料，利用高通量測(cè)序方法測(cè)定其基因組DNA序列，并對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行組裝和注釋。分析藥用植物洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組序列特征，IR邊界特征，間隔區(qū)信息位點(diǎn)變異的特征，并對(duì)洋金花和木本曼陀羅及其近緣物種共22種（25個(gè)樣品）植物的葉綠體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，驗(yàn)證其系統(tǒng)的位置，探討曼陀羅屬與木曼陀羅屬的系統(tǒng)關(guān)系。為藥用植物洋金花及其近緣物種的種質(zhì)資源的鑒定、群體遺傳學(xué)和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

洋金花和木本曼陀羅新鮮葉片釆集于廣西壯族自治區(qū)藥用植物園（22°50′47.14′′N, 108°19′30.06′′E），憑證標(biāo)本號(hào)為XZ-2020-17和XZ-2020-16。葉片用硅膠干燥后，裝入取樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室，置于?80 ℃冰箱備用。樣品由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系高致明教授和夏至教授鑒定為茄科植物洋金花L.和木本曼陀羅(L.) Lagerh.，憑證標(biāo)本保存于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本館，NCBI的GenBank登錄號(hào)為OK040953和OK040952。其近緣物種葉綠體基因組序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)驗(yàn)材料詳細(xì)信息見表1。

1.2 DNA的提取和高通量測(cè)序

采用植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取樣品干燥新鮮葉片的總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。樣品送至華大生物科技公司后，進(jìn)行NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）檢測(cè)總DNA的純度和濃度。MGISEQ-2000 PE150測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序完成后，利用華大自主開發(fā)的過(guò)濾軟件SOAPnuke過(guò)濾參數(shù)。（1）過(guò)濾接頭：測(cè)序read匹配上adapter序列的25%或者以上則刪除整條read；（2）過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)：如果測(cè)序read中質(zhì)量值低于20的堿基占整條read的30%或者以上則刪除整條read；（3）去N：如果測(cè)序read中N含量占整條read的1%或者以上，則刪除整條read；（4）獲得clean reads。數(shù)據(jù)以FASTQ格式儲(chǔ)存，用于后續(xù)的拼接和注釋。

表1 植物樣品來(lái)源

1.3 葉綠體基因組的組裝和注釋

葉綠體基因組的拼接釆用NOVOPlasty-master[12]程序，插入片段大小設(shè)為150 bp。過(guò)濾后的reads用Geneious 11.0.3[21]拼接軟件組裝成重疊群，并對(duì)組裝中的簡(jiǎn)并堿基，進(jìn)行人工修正。利用Geneq-Annotation of Organellar（https:// chlorobox.mpimp golm.mpg.de/geseq.html），結(jié)合NCBI上已報(bào)道的曼陀羅L.（GenBank登錄號(hào)NC_018117）注釋結(jié)果對(duì)洋金花和木本曼陀羅葉綠體全基因組進(jìn)行基因注釋，參數(shù)為默認(rèn)值，最后進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。tRNA用ANAGORNV1.2.38（https://chlorobox.mpimp golm. mpg.de/geseq.html）預(yù)測(cè)。注釋完成后，提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/），GenBank登錄號(hào)為OK040953和OK040952。利用在線工具OGDRAW-DRAW Organelle Genome Maps（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/ OGDraw. html）繪制葉綠體結(jié)構(gòu)圖。

1.4 葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴(kuò)張分析

IR區(qū)域在葉綠體基因中具有高度保守性，IR邊界的膨脹和收縮被認(rèn)為是被子植物葉綠體全基因組大小變化的主要機(jī)制[20]。其中被子植物葉綠體基因組長(zhǎng)度為120～180 kb。在植物進(jìn)化過(guò)程中，IR/SC邊界不同程度的擴(kuò)張和收縮是導(dǎo)致邊界和基因組長(zhǎng)度多樣性的原因[22]。本研究使用Geneious 11.0.3[21]軟件獲得茄科10個(gè)屬11種藥用植物葉綠體基因組的IRa/IRb、LSC和SSC和邊界基因的序列長(zhǎng)度，進(jìn)行比較分析，探討茄科植物葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴(kuò)張?zhí)卣?。并使用Adobe illustrator軟件繪制11種茄科植物葉綠體基因組IR邊界對(duì)比圖。

1.5 葉綠體基因組基因間隔區(qū)信息位點(diǎn)分析

在近緣物種中葉綠體基因間隔區(qū)往往比葉綠體基因編碼區(qū)具有更高的變異位點(diǎn)，常被用來(lái)分析屬間、屬內(nèi)種間物種親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究基于茄科10個(gè)屬22種植物的葉綠體基因組序列特征，利用Geneious 11.0.3[21]的MAFFT[23]功能進(jìn)行多重比較，導(dǎo)出Fasta格式文件，后用Phylosuite vl.2.1[24]提取22個(gè)物種葉綠體基因組32個(gè)共有的間隔區(qū)，統(tǒng)計(jì)這些間隔區(qū)的信息位點(diǎn)百分率，為下一步構(gòu)建茄科物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供分子標(biāo)記。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于本研究新報(bào)道的洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組，同時(shí)選取NCBI已報(bào)道的茄科物種葉綠體基因組共22個(gè)（25個(gè)樣品），以近緣的旋花科（Convolvulaceae）植物蕹菜Forsk為外類群（表1）。利用Phylosuite vl.2.1[24]軟件基于MAFFT[23]參數(shù)設(shè)置進(jìn)行多重比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育分析采用最大似然法（maximum likelihood，ML），利用CIPRES Science Gateway服務(wù)器（http://www. phylo.org/）中RAxML（version 8.2）軟件[25]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Bootstrap（BS，1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。系統(tǒng)發(fā)育樹導(dǎo)出后利用FigTree version 1.4.2進(jìn)行查看。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征

測(cè)序結(jié)果去除接頭和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，組裝和注釋后得到洋金花和木本曼陀羅的完整葉綠體基因組。結(jié)果表明，洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組均為共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀分子（圖1）。洋金花和木本曼陀羅的葉綠體全基因組長(zhǎng)度分別為155 934 bp（表2）和155 939 bp（表2），其中LSC長(zhǎng)度分別為86 354 bp和86 278 bp，SSC分別為18 362 bp和18 221 bp，二者的2個(gè)IR長(zhǎng)度分別為25 609 bp和25 720 bp。洋金花和木本曼陀羅的葉綠體全基因組中GC含量分別為37.9%、37.8%。在LSC區(qū)域中GC含量皆為35.9%，SSC區(qū)域中GC含量分別為32.3%和32.1%，IRs區(qū)域中GC含量相同，皆為43.1%。洋金花和木本曼陀羅的葉綠體全基因組分別注釋131和130個(gè)基因，洋金花包括85個(gè)蛋白編碼基因（protein coding genes，PCGs），38個(gè)tRNA以及8個(gè)rRNA，其中LSC區(qū)完全包含58個(gè)PCGs和23個(gè)tRNA，SSC區(qū)包含11個(gè)PCGs和1個(gè)tRNA，IRs區(qū)域內(nèi)包含11個(gè)PCGs和14個(gè)tRNA以及全部（8個(gè)）的rRNA，另外、、基因分別橫跨LSC/IRb、LSC/IRb、IRb/SSC和SSC/IRa邊界。而木本曼陀羅包括85個(gè)PCGs，37個(gè)tRNA以及8個(gè)rRNA，其中LSC區(qū)完全包含58個(gè)PCGs和22個(gè)tRNA，SSC區(qū)包含10個(gè)PCGs和1個(gè)tRNA，IRs區(qū)域內(nèi)包含12個(gè)PCGs和14個(gè)tRNA以及全部（8個(gè)）的rRNA，另外、、、基因分別橫跨LSC/IRb、LSC/IRb、IRb/SSC和SSC/IRa、IRb/SSC邊界。詳細(xì)信息見表2。

圖1 洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組

表2 洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組堿基組成及特征

2.2 洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組的組成和特征分析

洋金花葉綠體基因組共包括131個(gè)基因，非重復(fù)基因113個(gè)，其中85個(gè)PCGs、8個(gè)rRNA基因與38個(gè)tRNA基因。其中，PCGs中與自我復(fù)制相關(guān)基因除rRNA基因和tRNA基因外（表3），還包括13個(gè)核糖體小亞基基因、11個(gè)核糖體大亞基基因和4個(gè)RNA聚合酶亞基基因；光合作用相關(guān)的基因有45個(gè)，包括12個(gè)NADH脫氫酶基因、5個(gè)光系統(tǒng)I基因、14個(gè)光系統(tǒng)II基因、6個(gè)細(xì)胞色素復(fù)合物編碼基因、6個(gè)ATP合酶基因、1個(gè)二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因和1個(gè)依賴ATP的蛋白酶單元p基因；此外還有4個(gè)其他功能基因及8個(gè)未知功能基因。在tRNA中、、、、、、各有2個(gè)拷貝；4個(gè)rRNA均有2個(gè)拷貝，分別位于反向重復(fù)區(qū)IRa和IRb。核糖體蛋白大小亞基編碼的基因中，、、和這3個(gè)基因均有2個(gè)拷貝，其余為1個(gè)拷貝。NADH脫氫酶亞基中的基因及未知功能蛋白基因和的拷貝數(shù)均為2。內(nèi)含子在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，洋金花葉綠體基因組中有15個(gè)基因有內(nèi)含子。其中，、、、、、、、、、、、、、、各有1個(gè)內(nèi)含子，而、具2個(gè)內(nèi)含子?；蛭挥诨騼?nèi)，整個(gè)編碼區(qū)為內(nèi)含子的一部分，存在序列共用現(xiàn)象；基因的3′端與基因的5′端，基因的3′端與基因的5′端、的3′端與的5′端重疊。木本曼陀羅和洋金花相比在tRNA上缺少了，其他基因組成與洋金花一致。

表3 洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組編碼的基因

a和b分別表示含有1個(gè)和2個(gè)內(nèi)含子；c表示含有2個(gè)拷貝基因；d表示木本曼陀羅缺少該基因

a and b represent one and two introns, respectively; c indicates that it contains two copies of genes; d indicates thatlacks this gene

2.3 茄科部分物種葉綠體全基因組特征比較分析

茄科植物葉綠體基因組特征的比較分析見表4，洋金花和木本曼陀羅及其近緣物種（共22個(gè)物種）葉綠體基因組的序列長(zhǎng)度范圍介于155 004～157 390 bp，其中，黑果枸杞的葉綠體全基因組長(zhǎng)度最短（155 004 bp），絨毛辣椒的葉綠體基因組最長(zhǎng)（157 390 bp）。洋金花的葉綠體基因組長(zhǎng)度為155 934 bp，木本曼陀羅的葉綠體基因組長(zhǎng)度為155 939 bp，位于茄科其他20個(gè)物種的葉綠體基因組長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。洋金花和木本曼陀羅及其近緣物種（共22個(gè)物種）葉綠體基因組GC含量的范圍為37.6%～37.9%，山莨菪的GC含量最低（37.6%），洋金花的GC值最高為37.9%，而木本曼陀羅GC含量為37.8%。利用Geneious 11.0.3軟件獲取洋金花和木本曼陀羅及其近緣物種（共22個(gè)物種）葉綠體基因組的IR、LSC和SSC區(qū)序列。結(jié)果表明，IR區(qū)的序列長(zhǎng)度范圍介于25 342～25 904 bp，其中的IR區(qū)最短（25 342 bp），顛茄的IR區(qū)最長(zhǎng)（25 904 bp），洋金花的IR區(qū)的長(zhǎng)度為25 609 bp，木本曼陀羅的IR區(qū)的長(zhǎng)度為25 720 bp，2者均位于茄科其他20個(gè)物種IR區(qū)長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。LSC區(qū)序列長(zhǎng)度范圍介于85 737～87 688 bp，其中洋芋的LSC區(qū)長(zhǎng)度最短（85 737 bp），絨毛辣椒的LSC區(qū)長(zhǎng)度最長(zhǎng)（87 688 bp），洋金花的LSC區(qū)的長(zhǎng)度為86 354 bp，木本曼陀羅的LSC長(zhǎng)度為86 278 bp，都介于茄科其他20個(gè)物種LSC區(qū)長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。SSC區(qū)序列長(zhǎng)度范圍介于17 487～18 642 bp，其中山莨菪的SSC區(qū)最短（17 487 bp），的SSC區(qū)最長(zhǎng)（18 642 bp），洋金花SSC區(qū)長(zhǎng)度為18 362 bp，木本曼陀羅SSC區(qū)長(zhǎng)度為18 221 bp，二者介于茄科其他20個(gè)物種SSC區(qū)長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。

表4 茄科22種植物葉綠體基因組的特征

2.4 茄科10個(gè)屬11個(gè)物種葉綠體全基因組邊界的特征

選取茄科10個(gè)屬11個(gè)物種的葉綠體全基因組，比較分析洋金花和木本曼陀羅葉綠體基因組與茄科其他物種在進(jìn)化過(guò)程中IR/SC邊界的擴(kuò)張和收縮情況（圖2）。茄科10個(gè)屬11個(gè)物種葉綠體全基因組的IR-LSC和IR-SSC邊界比較顯示，IR/SC邊界具有高度的保守性，其LSC/IRb邊界（JLB），SSC/IRb邊界（JSB）、SSC/IRa邊界（JSA）和LSC/IRa邊界（JLA）的側(cè)翼基因完全相同，但邊界基因的擴(kuò)張程度存在一定的差異。茄科11個(gè)物種中，9個(gè)物種JLB邊界全部位于基因內(nèi)，其中洋金花和木本曼陀羅的JLB邊界擴(kuò)張范圍，位于9個(gè)物種之內(nèi)。但煙草和碧冬茄的基因卻全部位于LSC區(qū)域，距JLB邊界有5 bp。JSB邊界擴(kuò)張范圍顯示，茄科物種的側(cè)翼基因完全相同，均為和基因，洋金花和木本曼陀羅的SSC/IRb邊界（JSB）與洋芋，辣椒和曼陀羅一致，存在基因于基因重疊現(xiàn)象。JSA邊界的擴(kuò)張范圍顯示，SSC和IRa區(qū)域基因完全相同，均為基因，基因在IRa區(qū)長(zhǎng)度范圍為995～1440 bp，在SSC區(qū)長(zhǎng)度范圍為4205～4726 bp。其中洋金花和木本曼托羅的基因在SSC區(qū)域?yàn)?527 bp和4422 bp，在IRa區(qū)域?yàn)?101 bp和1049 bp，位于茄科11個(gè)物種JSA邊界擴(kuò)張范圍之內(nèi)。JLA邊界擴(kuò)張范圍顯示，其側(cè)翼基因完全相同，均為（位于IRa區(qū)）和（位于LSC區(qū)）2個(gè)基因。其中11個(gè)物種的和2個(gè)基因距JLA邊界堿基長(zhǎng)度范圍變異不大，分別為56～166 bp和4～30 bp。洋金花和木本曼陀羅的和2個(gè)基因距JLA邊界的序列長(zhǎng)度為136、124 bp和8、7 bp，位于11個(gè)物種JLA邊界擴(kuò)張范圍之內(nèi)。

圖2 洋金花和木本曼陀羅及其近緣種的葉綠體全基因組邊界

2.5 茄科葉綠體基因組基因間隔區(qū)信息位點(diǎn)分析

根據(jù)茄科10個(gè)屬22種植物的32個(gè)葉綠體基因組間隔區(qū)信息序列特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5），在32個(gè)共同的葉綠體基因間隔區(qū)中，變異位點(diǎn)百分率變化范圍為3.49%～18.70%，最高的為基因間隔區(qū)，其變異位點(diǎn)百分率為18.70%。信息位點(diǎn)超過(guò)10%的基因間隔區(qū)有11個(gè)，分別為、、、、、、、、、、。這些變異位點(diǎn)百分率較高的葉綠體基因間隔區(qū)，能提供足夠多的信息位點(diǎn)，為茄科屬間和種間物種進(jìn)化關(guān)系及分子鑒定提供較高的分辨率。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取洋金花和木本曼陀羅及其近緣物種共22種（25個(gè)樣品）葉綠體全基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以旋花科植物蕹菜Forsk作為外類群，利用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果顯示取樣茄屬、辣椒屬、枸杞屬、曼陀羅屬、煙草屬、碧冬茄屬的單系性都得到100%支持。24個(gè)分枝節(jié)點(diǎn)中有22個(gè)的支持率都為100%，另外2個(gè)為98%和99%，聚類結(jié)果較為可靠。洋金花和曼陀羅以100%支持率聚在一起，它們所在的曼陀羅屬與木曼陀羅屬聚在1支，且有100%的支持率。

表5 茄科22個(gè)物種的32個(gè)葉綠體基因間隔區(qū)矩陣位點(diǎn)信息

圖3 基于葉綠體全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

中藥材洋金花作為我國(guó)藥典收載的藥材之一，與其近緣物種木本曼陀羅均富含東莨菪堿，具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究完成了藥用植物洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組的測(cè)序，組裝與注釋。結(jié)果表明，藥用植物洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組，均具有典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)（圖1），包括1個(gè)LSC區(qū)、1對(duì)IR區(qū)和1個(gè)SSC區(qū)，長(zhǎng)度分別為155 934 bp和155 939 bp。其葉綠體基因組長(zhǎng)度位于茄科其他20個(gè)物種葉綠體基因組長(zhǎng)度范圍之內(nèi)。洋金花和木本曼陀羅的葉綠體全基因組分別包含131和130個(gè)基因，洋金花包括85個(gè)PCGs，38個(gè)tRNA以及8個(gè)rRNA，木本曼陀羅和洋金花相比，在tRNA上缺少了基因，其余基因組成一樣。

基于茄科10個(gè)屬11個(gè)物種的葉綠體全基因組IR邊界比較分析（圖2），洋金花和木本曼陀羅與茄科其他8個(gè)屬植物的葉綠體基因組IR邊界均具有高度的保守性。其LSC/IRb邊界（JLB），SSC/IRa邊界（JSA）和LSC/IRa邊界（JLA）的側(cè)翼基因完全相同，但邊界側(cè)翼基因的擴(kuò)張序列長(zhǎng)度存在差異，洋金花和木本曼陀羅的上述邊界側(cè)翼基因擴(kuò)張范圍，均為于茄科物種葉綠體基因組IR邊界的擴(kuò)張范圍之內(nèi)。洋金花和木本曼陀羅的SSC/IRb邊界（JSB）與洋芋、辣椒和曼陀羅一致，存在基因于基因重疊現(xiàn)象?；蚺c基因重疊現(xiàn)象同樣也出現(xiàn)在龍膽科藥用植物葉綠體基因組[26]。IR邊界比較分析結(jié)果表明洋金花和木本曼陀羅與茄科其他物種的葉綠體全基因組具有較高保守性，葉綠體基因組適合用來(lái)解決茄科屬級(jí)以上分類等級(jí)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

基于茄科10個(gè)屬22種植物的32個(gè)葉綠體基因組間隔區(qū)信息序列特征統(tǒng)計(jì)表明（表5），茄科的葉綠體基因組編碼區(qū)較為保守，在32個(gè)共同的葉綠體基因間隔區(qū)中，變異位點(diǎn)百分率變化范圍為3.49%～18.70%，變異位點(diǎn)百分率最高的為基因間隔區(qū)，其變異位點(diǎn)百分率為18.70%。本研究結(jié)果支持韓建萍等[3]結(jié)果，支持基因間隔區(qū)作為藥用植物洋金花與其偽品的DNA條形碼序列。此外，信息位點(diǎn)超過(guò)10%的葉綠體基因間隔區(qū)有11個(gè)，分別為、、、、、、、、、、。這些基因間隔區(qū)在茄科的屬間和種間提供了豐富的信息位點(diǎn)。由于葉綠體基因組在大多數(shù)被子植物中為母系遺傳，重組率低，核苷酸置換率適中[27]，進(jìn)一步結(jié)合雙親遺傳的核基因片段聯(lián)合分析，為茄科植物屬下物種雜交起源，多倍體物種的形成和系統(tǒng)進(jìn)化分析提供可靠的分子標(biāo)記片段。

為進(jìn)一步界定藥用植物洋金花和木本曼陀羅在茄科的系統(tǒng)位置，探討曼陀羅屬與木曼陀羅屬的系統(tǒng)關(guān)系，基于茄科22個(gè)物種（25個(gè)樣品）葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，茄科各屬植物均聚成有較高支持率的分枝。其中洋金花與曼陀羅構(gòu)成1單系分支（支持率100%），表明藥用植物洋金花隸屬于曼陀羅屬。木曼陀羅屬（木本曼托羅為代表）與曼陀羅屬（包括洋金花與曼陀羅為代表）組成1單系分支（支持率100%），二者互為姐妹群。木曼陀羅屬與曼陀羅屬的系統(tǒng)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，一種認(rèn)為木曼陀羅屬應(yīng)獨(dú)立成一屬，有的認(rèn)為應(yīng)作為曼陀羅屬的一個(gè)組[1]。Persoon把曼陀羅屬內(nèi)具有木本特性，光滑而不規(guī)則開裂蒴果的木本曼陀羅分出，成立木曼陀羅屬L.[28]。《中國(guó)植物志》認(rèn)為Persoon所提出的特征：光滑而不規(guī)則開裂的蒴果，在曼陀羅屬的另一個(gè)組中同樣是存在的，因此將它作為曼陀羅屬的一個(gè)組[1]。本研究的葉綠體基因組數(shù)據(jù)結(jié)果支持近年來(lái)分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果[3,29-30]，草本的曼陀羅屬和木本的木曼陀羅屬是2個(gè)獨(dú)立的屬。木曼陀羅屬具有一系列獨(dú)特形態(tài)特征（近裔共性）也支持分子數(shù)據(jù)的結(jié)果，如木本的習(xí)性、俯垂的花、俯垂的漿果且表面平滑等這些形態(tài)特征與曼陀羅屬有著顯著的區(qū)別。

近年來(lái)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的成本降低，基于葉綠體基因組序列作為超級(jí)條形碼對(duì)物種的分子鑒定應(yīng)用越來(lái)越廣泛[31]。洋金花作為常用中藥材之一，其商品中?；煊型瑢儆卸局参锫恿_的花，影響臨床用藥安全[3-4]。本研究首次報(bào)道藥用植物洋金花和木本曼陀羅的葉綠體基因組，豐富了曼陀羅屬及其近緣屬葉綠體基因組數(shù)據(jù)，比較分析這些近緣物種葉綠體基因組的特征和差異，為中藥材洋金花的精準(zhǔn)鑒定提供理論依據(jù)。此外，茄科植物是許多大宗蔬菜和藥用植物的來(lái)源，本研究結(jié)果不僅為曼陀羅屬藥用植物的提供分子鑒別，也為茄科植物的分子鑒定，遺傳多樣性及種質(zhì)資源保護(hù)研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Characterization and phylogenetic analysis of complete chloroplast genome ofand

BI Guang-yao1, DING Yi-ning1, WANG Li2, HU Sai-wen1, LI He-min1, LEI Ming3, ZHANG Zhan-jiang3, XIA Zhi1

1. College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China 2. Liuhe Agricultural Technology Extension Regional Station of Fangcheng County, Fangcheng 473200, China 3. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning 530023, China

To analyze the structure and feature of complete chloroplast genome of medicinal plantsand, so as to construct the phylogenetic relationship between the two species and their relatives.MGISEQ-2000PE150 was used to sequence the geomic DNA ofwith the paired-end strategyin Beijing Genomics Institute (China). The complete chloroplast genome was assembled using NOVO Plasty software, and sequence analysis was performed based on gene annotation results. Phylogenetic analyses were performed using Maximum-Likelihood (ML) methods.The complete chloroplast genome ofandwere 155 934 bp and 155 939 bp in length including 131 and 130 genes respectively, with a GC content of 32.3%. The chloroplast genome exhibited a typical quadripartite structure, including a large single copy region (LSC), a pair of inverted repeats (IR), and a small single copy (SSC), and the each region lengths of which were 86 354, 86 278, 25 609, 25720, 18 362, 18 221 bp, respectively. Phylogenetic analyses result indicated thatwas sister towith bootstrap 100%. The generaandformed one monophyletic group with bootstrap 100%.This study verified thatbelonged to the, and it was related to. The genusshould be separated from genus. The information of chloroplast genome provided foundation for subsequent studies on molecular identification and genetic diversity.

L.;(L.) Lagerh.; chloroplast genome; assembly; phylogenetic analysis

R282.12

A

0253 - 2670(2022)22 - 7191 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.023

2022-04-07

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102110137）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃（22A360010）；國(guó)家自然科學(xué)基金-河南聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1404302）

畢光耀（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源的分子鑒定。E-mail: 903592548@qq.com

夏 至，教授，主要從事中藥資源的分子鑒定及分子生藥學(xué)研究。E-mail: xiazhiemail@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]