王 震，柳 馳，任偉超，張美琦，劉秀波*，馬 偉, 3, 4*

? 藥材與資源 ?

紅花變豆菜葉綠體基因組組裝與序列特征分析研究

王 震1，柳 馳2#，任偉超1，張美琦1，劉秀波1*，馬 偉1, 3, 4*

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 開(kāi)姆尼茨工業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，德國(guó) 開(kāi)姆尼茨 09111 3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 4. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

以紅花變豆菜新鮮葉片為試驗(yàn)材料，通過(guò)高通量測(cè)序手段，對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行組裝和序列特征分析，為進(jìn)一步開(kāi)展變豆菜屬植物的進(jìn)化和遺傳發(fā)育提供指導(dǎo)方法。實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程執(zhí)行，包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序等流程，使用已報(bào)道的變豆菜的葉綠體基因組作為參考序列，得到紅花變豆菜完整的葉綠體基因組序列并對(duì)其進(jìn)行組裝、特征序列分析和進(jìn)化分析。紅花變豆菜葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度155 700 bp，包括1個(gè)大的單拷貝區(qū)（large single copy，LSC，85 979 bp），1個(gè)小的單拷貝區(qū)（small single copy，SSC，17 053 bp），1對(duì)相反的序列（inverted repeats sequence，IR，26 333 bp）；共注釋到130個(gè)基因，其中蛋白編碼的基因86個(gè)，tRNA基因36個(gè)，rRNA基因8個(gè)，AT含量占葉綠體基因組的61.83%；共檢測(cè)到1個(gè)正向長(zhǎng)重復(fù)序列（forward repeat sequence），3個(gè)回文長(zhǎng)重復(fù)序列（palindromic repeat sequence）；此外，還檢測(cè)到了168個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）位點(diǎn)；與蛋白編碼基因?qū)?yīng)的密碼子偏好使用A/T堿基，編碼異亮氨酸的密碼子（I）使用次數(shù)最高，編碼半胱氨酸的密碼子（C）使用次數(shù)最低；最后與7種已報(bào)道的傘形科植物葉綠體基因組和2個(gè)外類(lèi)群物種通過(guò)最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)紅花變豆菜與變豆菜和直刺變豆菜親緣關(guān)系最為密切。紅花變豆菜的葉綠體基因組數(shù)據(jù)為傘形科植物研究提供了更為詳細(xì)完善的資料，為該物種葉綠體基因工程和系統(tǒng)進(jìn)化分析提供參考依據(jù)。

紅花變豆菜；葉綠體基因組；高通量測(cè)序；系統(tǒng)進(jìn)化；最大似然法

紅花變豆菜Fr. Schmidt是傘形科（Apiaceae）變豆菜屬多年生草本植物，是一種可食用的山野菜，具有一定的藥用價(jià)值，變豆菜屬全世界約40余種[1]。其生長(zhǎng)在山間林下，陰濕及腐殖質(zhì)較多的地方，海拔200～470 m，主要產(chǎn)地在我國(guó)的東北地區(qū)，另外，蒙古、朝鮮、日本北部也有分布[2]。變豆菜屬植物在中國(guó)約有18種，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[3]，薄片變豆菜Hance又叫血經(jīng)草，具有治療跌打損傷和風(fēng)寒感冒等功效[4]，天藍(lán)變豆菜Franch.、直刺變豆菜S. Moor和川滇變豆菜Wolff ex Kretsch均為有名的地方藥材，具有活血化瘀和止咳化痰的藥效，同屬的紅花變豆菜也可能會(huì)具有相應(yīng)的藥用價(jià)值[5]。變豆菜屬植物主要基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，如從花粉形態(tài)[6]和果實(shí)微形態(tài)出發(fā)進(jìn)行分類(lèi)，但是部分品種只從形態(tài)學(xué)鑒定很難區(qū)分，導(dǎo)致其傳統(tǒng)分類(lèi)發(fā)展緩慢，因此需要尋找新的方法來(lái)對(duì)其鑒定手段進(jìn)行補(bǔ)充。

葉綠體普遍存在于陸地植物、藻類(lèi)和部分原生生物當(dāng)中，是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器[7]，功能包括產(chǎn)生色素、合成糖和某些氨基酸等[8]。被子植物中，葉綠體基因組相對(duì)保守，絕大多數(shù)為雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)小的單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）、1個(gè)大的單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）以及2個(gè)編碼相同，方向相反的序列（inverted repeats sequence，IR）IRa和IRb[9]。相對(duì)于核基因組，葉綠體基因組具有結(jié)構(gòu)保守、堿基變異速率適中、易于測(cè)序等多種優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于各植物類(lèi)群的系統(tǒng)進(jìn)化研究[10]?；诒菊n題組前期對(duì)紅花變豆菜葉綠體基因組的研究[11]，對(duì)其序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步挖掘分析，對(duì)組裝后的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)重復(fù)序列分析、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）位點(diǎn)、密碼子偏好性以及與其他傘形科植物使用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析近緣物種親緣關(guān)系，為紅花變豆菜的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育研究提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的紅花變豆菜樣本于2020年8月20日采集自中國(guó)黑龍江省伊春市（N47°81′08′′，E128°90′97′′）。樣品保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，樣品標(biāo)本號(hào)為YCL20190507007，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)馬偉研究員鑒定為傘形科變豆菜屬植物紅花變豆菜Fr. Schmidt。將采集的紅花變豆菜新鮮幼嫩的葉片，通過(guò)液氮速凍，并進(jìn)行研磨，于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用CTAB法提取紅花變豆菜的全基因組DNA。

1.2.2 測(cè)序 總DNA樣品經(jīng)武漢貝納科技服務(wù)有限公司檢測(cè)合格后，用機(jī)械打斷的方法（超聲波）將DNA片段化，然后對(duì)片段化的DNA進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測(cè)序接頭，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文（NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?），建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina NovaSeq進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序得到的序列，通過(guò)SOAPnuke（version：1.3.0）軟件進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為去除N堿基含量超過(guò)5%的reads、去除低質(zhì)量（質(zhì)量值≤5）堿基數(shù)目達(dá)到50%的reads和去除有adapter污染的reads，最終得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）。

1.2.3 葉綠體基因組組裝 使用SPAdes（version：3.13.0；參數(shù)：?k 127）[12]軟件進(jìn)行基因組拼接，選用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣參考植物變豆菜葉綠體基因組（MK208987.1）與拼接結(jié)果進(jìn)blastn（version：BLAST 2.2.30＋；參數(shù)：?evalue 1×10?5）比對(duì)，后續(xù)使用Gapcloser（Version：1.12）對(duì)gap（含N序列）進(jìn)行補(bǔ)洞。

1.2.4 葉綠體基因組特征分析 利用專(zhuān)門(mén)針對(duì)葉綠體的注釋軟件CPGAVAS2（http://47.96.249.172: 16019/analyzer/annotate）[13]進(jìn)行基因注釋并繪圖紅花變豆菜葉綠體基因組物理圖；使用VMATCH（http://www.vmatch.de/）軟件（參數(shù)：minimal repeat size 30 bp）查找葉綠體基因組中的散在長(zhǎng)重復(fù)序列片段；采用MISA軟件[版本：1.0；默認(rèn)參數(shù)；對(duì)應(yīng)的各個(gè)重復(fù)單元（unit size）的最少重復(fù)次數(shù)分別為1-8、2-4、3-4、4-3、5-3、6-3]對(duì)葉綠體進(jìn)行SSR檢測(cè)；使用CodonW（Version：1.4.4）對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)估算相對(duì)同義密碼子的使用頻率；通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載6種傘形科植物，包括變豆菜L.（MK208987）、明日葉L.（MW125613）、隔山香L.（MT501096）、遼藁本L.（MN652885）、防風(fēng)L.（MN857472）、白芷L.（KT963037）以及2種非傘形科植物玉米L.（NC001666）和擬南芥L.（NC000932）的葉綠體基因組序列，使用MAFFT[14]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，最后使用MEGA X[14]軟件基于ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花變豆菜葉綠體基因組測(cè)序及結(jié)構(gòu)解析

基于課題組已報(bào)道的研究發(fā)現(xiàn)，紅花變豆菜的葉綠體基因組大小為155 700 bp，具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)：包括1個(gè)LCS區(qū)（85 979 bp），1個(gè)SCC區(qū)（17 053 bp）和2個(gè)反向互補(bǔ)的IRs區(qū)（26 333 bp），GC含量為61.83%[14]。

后續(xù)通過(guò)對(duì)紅花變豆菜葉綠體基因組物理圖譜的繪制（圖1）及進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，測(cè)序有效數(shù)據(jù)Q20值為97.41%、Q30值為92.84%，根據(jù)比對(duì)覆蓋度發(fā)現(xiàn)變豆菜（MK208987.1）為最優(yōu)參考序列，其覆蓋度為96.44%，不含有g(shù)ap。IRs、LSC和SSC 4個(gè)區(qū)域的GC值都存在一定的差異，IRs區(qū)域的CG值最高，為42.92%；SSC區(qū)域的CG值最低，為32.56%，LCS區(qū)域的CG值介于二者之間，為36.39%（表1）。

葉綠體基因組圖譜上4個(gè)環(huán)。從中心向外，第1圈顯示紅弧和綠弧分別連接的正向重復(fù)和反向重復(fù)；第2圈顯示用短杠標(biāo)記的串聯(lián)重復(fù)；第3圈為簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR；第4圈顯示質(zhì)體上的基因結(jié)構(gòu)；基因的顏色是根據(jù)他們的功能分類(lèi)來(lái)區(qū)分

2.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)基本特征分析

基于課題組已報(bào)道的研究發(fā)現(xiàn)，紅花變豆菜葉綠體基因組共成功注釋了130個(gè)基因，其中蛋白編碼的基因86個(gè)，tRNA基因36個(gè)，rRNA基因8個(gè)[11]。

通過(guò)對(duì)以上結(jié)果進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其基因編碼功能可以分為4類(lèi)（表2），第1類(lèi)是與自我復(fù)制有關(guān)的基因，分為5個(gè)組，分別是tRNA基因、核糖體小亞基、核糖體大亞基、RNA聚合酶亞基和核糖體RNA基因，成員數(shù)量分別為26、12、9、4和4個(gè)；第2類(lèi)為與光合作用相關(guān)的基因，細(xì)分為7組，分別是光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)II、ATP合成亞基、細(xì)胞色素亞基、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基、NADPH乳酸脫氫酶亞基和依賴(lài)ATP蛋白酶P基因亞基，成員數(shù)量分別為5、15、6、6、1、11和1個(gè)；第3類(lèi)為其他功能基因，包括成熟酶、外膜蛋白基因、C型細(xì)胞色素合成基因和乙酰輔酶A羧化酶亞基各1個(gè)；第4類(lèi)為4個(gè)未知功能的基因，還需要進(jìn)一步研究，以確定其功能。

2.3 長(zhǎng)重復(fù)序列分析

所有的長(zhǎng)重復(fù)序列包括3種類(lèi)型，包括正向重復(fù)序列（forward repeat sequence）、回文重復(fù)序列（palindromic repeat sequence）和串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat sequence），這些長(zhǎng)重復(fù)序列可能具有促進(jìn)葉綠體基因組重排的功能，并且可以增加其居群遺傳多樣性[16]。在紅花變豆菜葉綠體基因組中共發(fā)現(xiàn)了1個(gè)正向重復(fù)序列，3個(gè)回文重復(fù)序列，并未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列。其中1個(gè)正向重復(fù)序列和2個(gè)回文重復(fù)序列非常短，分別為34、34、30 bp，1個(gè)回文重復(fù)序列非常長(zhǎng)，為26 333 bp，是葉綠體基因組的IR區(qū)域。利用這些重復(fù)序列，可以為以后開(kāi)發(fā)種群進(jìn)化標(biāo)記研究提供基礎(chǔ)。

表1 紅變豆菜葉綠體基因組堿基組成

表2 紅花變豆菜葉綠體基因組注釋基因

2.4 SSR位點(diǎn)分析

SSR又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記、微衛(wèi)星序列標(biāo)記[17-18]。SSR表示由基因組中1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA序列，廣泛存在于基因組的各個(gè)區(qū)域，且側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，可用于個(gè)體或物種之間的多態(tài)性研究[19]。通過(guò)對(duì)紅花變豆菜葉綠體基因組的分析，共發(fā)現(xiàn)了168個(gè)SSR位點(diǎn)，分為4個(gè)類(lèi)型，包括復(fù)雜重復(fù)類(lèi)型112個(gè)，其數(shù)量最多；3個(gè)堿基重復(fù)類(lèi)型2個(gè)，其數(shù)量最少；2個(gè)堿基重復(fù)類(lèi)型47個(gè)；4個(gè)堿基重復(fù)類(lèi)型7個(gè)，沒(méi)有單堿基重復(fù)類(lèi)型。97.60%的SSR位點(diǎn)都含有A/T的堿基，僅有4個(gè)SSR位點(diǎn)由G/C堿基組成，說(shuō)明A/T堿基具有堿基偏好性，這可能跟紅花變豆菜葉綠體基因組中A/T堿基含量占比高（61.82%）有關(guān)聯(lián)，造成這種偏好性的原因可能與解鏈難易程度有關(guān)。

2.5 密碼子偏好性分析

紅花變豆菜葉綠體基因組中86個(gè)蛋白由21 963個(gè)密碼子共同編碼（表3）。由AUU編碼的異亮氨酸數(shù)量最多，為876個(gè)；由UGC編碼的半光氨酸數(shù)量最少，僅有60個(gè)。3種終止密碼子UAA、UAG和UGA在紅花變豆菜的葉綠體基因組中使用，其在同義密碼子中的占比為50%、25%和25%。通過(guò)對(duì)86個(gè)蛋白編碼基因序列分析，得出了同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）[20]，RSCU是對(duì)同義密碼子使用偏好的評(píng)估，通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，由UUA編碼的亮氨酸使用最頻繁，偏好性最大；由AGC編碼的絲氨酸使用頻率最低，偏好性最?。挥蒛GG編碼的色氨酸和由AUG編碼的甲硫氨酸無(wú)偏好性。

2.6 紅花變豆菜與其他7種傘形科植物葉綠體基因組的比較分析

本研究基于近些年報(bào)道的直刺變豆菜[21]、變豆菜[22]、明日葉[23]、隔山香[24]、遼藁本[25]、防風(fēng)[26]和白芷[27]共7種傘形科植物與紅花變豆菜的葉綠體序列長(zhǎng)度、編碼基因數(shù)量及組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較（表4）。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，傘形科內(nèi)8種植物葉綠體基因組的長(zhǎng)度為146 918～155 919 bp，并且都是由典型的四分體結(jié)構(gòu)組成；其大拷貝區(qū)和小拷貝區(qū)的序列長(zhǎng)度差異不大；除了遼藁本的反向重復(fù)序列長(zhǎng)度為明日葉和防風(fēng)的2倍，其他7種反向重復(fù)序列長(zhǎng)度差異也不大；從編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量來(lái)看，紅花變豆菜編碼的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，可能其葉綠體在生長(zhǎng)過(guò)程中能行使更多的功能。紅花變豆菜相比與變豆菜與直刺變豆菜相比，編碼的蛋白最多和SSC區(qū)序列最長(zhǎng)。除此之外，這8種傘形科植物的葉綠體基因組基因順序和結(jié)構(gòu)與大多數(shù)已報(bào)道的被子植物葉綠體基因組相似，這說(shuō)明在植物進(jìn)化過(guò)程中，葉綠體基因序列具有高度的保守性[28]。

表3 紅花變豆菜葉綠體基因組密碼子使用情況

表4 傘形科內(nèi)8種植物葉綠體基因組特征比較

2.7 葉綠體基因組全序列的聚類(lèi)分析

葉綠體基因組的聚類(lèi)分析對(duì)植物發(fā)育進(jìn)化研究具有重要意義[28]。通過(guò)對(duì)紅花變豆菜與其他7種傘形科植物葉綠體基因組序列長(zhǎng)度，基因結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白分析，發(fā)現(xiàn)其并未有太大差異，于是通過(guò)ML法對(duì)其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并加入玉米和擬南芥的葉綠體基因組序列作為外類(lèi)群，對(duì)紅花變豆菜進(jìn)行進(jìn)化分析，以確定其在傘形科植物中的進(jìn)化位置（圖2）。本課題組發(fā)現(xiàn)不同科的植物分為不同的進(jìn)化分支，8種傘形科植物聚在了1個(gè)分支上；說(shuō)明植物科間關(guān)系明確；在這個(gè)大的分支基礎(chǔ)上，紅花變豆菜與變豆菜和直刺變豆菜聚到了1個(gè)小分支上，并且自展值為100，說(shuō)明這3個(gè)物種在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系最為接近。

3 討論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紅花變豆菜葉綠體基因組進(jìn)行重測(cè)序，并以已報(bào)道植物變豆菜葉綠體基因組為參考，成功組裝出其完整的葉綠體基因組。相對(duì)于傳統(tǒng)意義上葉綠體基因組序列的獲取，如紫荊澤蘭L.[29]和菝葜L.[30]都是采用先從植物樣本中分離出葉綠體，然后對(duì)其葉綠體進(jìn)行DNA提取，最終再通過(guò)測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)葉綠體基因組序列的獲取，該方法復(fù)雜繁瑣、不易操作，不利于大范圍使用。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紅花變豆菜全基因組DNA進(jìn)行重測(cè)序，省略了先分離植物葉綠體再提取葉綠體DNA的復(fù)雜操作過(guò)程[31]，只需提取紅花變豆菜全基因組DNA，進(jìn)行高通量測(cè)序，選取已報(bào)道植物變豆菜葉綠體基因組序列作為參考基因組，將其所測(cè)得的全基因組序列與參考葉綠體基因組序列進(jìn)行BLASTN比對(duì)，提取出關(guān)聯(lián)的葉綠體raw reads，使用過(guò)濾軟件SOAPnuke對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量序列過(guò)濾得到clean reads，再利用SPAdes軟件對(duì)這些序列進(jìn)行組裝及優(yōu)化，最后使用GapCloser軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)洞，最終得到完整的紅花變豆菜葉綠體基因組序列。本研究使用的方法相較于傳統(tǒng)方法，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟、降低了試驗(yàn)所需的時(shí)間、減少了實(shí)驗(yàn)成本，并且該方法實(shí)用性廣，限制條件少，為大量植物測(cè)序葉綠體基因組提供了可能。

圖2 基于葉綠體全基因組10個(gè)物種的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果

變豆菜屬L.在克朗奎斯特系統(tǒng)（Cronquist system）、哈欽松系統(tǒng)、恩格勒系統(tǒng)（Engler system）、被子植物發(fā)育系統(tǒng)（angiosperm phylogeny group，APG）以及《中國(guó)植物志》等各個(gè)國(guó)家的植物分類(lèi)體系中都被分為一個(gè)自然的類(lèi)群，歸屬于傘形科（Apiaceae）、變豆菜亞科（Saniculoideae Drude）[32]。其中一些變豆菜屬植物具有一定的藥用價(jià)值，如變豆菜具有治療風(fēng)濕、咳嗽和激活血液循環(huán)的功效，直刺變豆菜具有祛風(fēng)止咳、活血通絡(luò)和清熱解毒的功效，也是一味著名的民族藥，收錄于《四川省中草藥標(biāo)準(zhǔn)(試行稿)》。中國(guó)變豆菜屬植物約有18種，屬于特有的為12種，但是鑒定困難，種間屬間易混淆，極其不利于此類(lèi)植物的發(fā)展與利用。針對(duì)其分類(lèi)已經(jīng)有相關(guān)的研究，包括通過(guò)形態(tài)學(xué)研究和分子系統(tǒng)學(xué)研究[34]。本研究通過(guò)對(duì)紅花變豆菜葉綠體基本組進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)挖掘，分析了紅花變豆菜的長(zhǎng)重復(fù)序列、SSR位點(diǎn)和密碼子偏好性，為變豆菜屬植物研究提供了更為詳細(xì)、完善的資料, 為該物種葉綠體基因工程和系統(tǒng)進(jìn)化分析提供參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Wyk B E V, Tilney P M, Magee A R. African Apiaceae: A Synopsis of the Apiaceae/umbelliferae of sub-Saharan Africa and Madagascar [M]. Pretoria: Briza Academic Books, 2013: 288.

[2] Vandelook F, Assche J V. Deep complex morphophysiological dormancy in(Apiaceae) fits a recurring pattern of dormancy types in genera with an Arcto-Tertiary distribution [J]., 2008, 86: 1370-1377.

[3] 謝文遠(yuǎn), 馬丹丹, 陳鋒, 等. 黃花變豆菜: 浙江變豆菜屬(傘形科)一新種 [J]. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2019, 18(1): 9-12.

[4] 四川省中草藥標(biāo)準(zhǔn)(試行稿) [S]. 1979: 10.

[5] 周小江. 肺經(jīng)草的品質(zhì)研究[D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2000.

[6] 姚雪瑩, 陳志祥, 王奇志. 變豆菜屬11種植物的葉表皮微形態(tài)特征研究 [J]. 植物研究, 2019, 39(5): 683-691.

[7] 馬孟莉, 張薇, 孟衡玲, 等. 豆蔻屬藥用植物葉綠體基因組密碼子偏性分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(12): 3661-3670.

[8] 邢少辰, Clarke J L. 葉綠體基因組研究進(jìn)展 [J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2008, 35(1): 21-28.

[9] Zhang T W, Fang Y J, Wang X M,. The complete chloroplast and mitochondrial genome sequences of: Insights into the evolution of plant organellar genomes [J]., 2012, 7(1): e30531.

[10] Daniell H, Lin C S, Yu M,. Chloroplast genomes: Diversity, evolution, and applications in genetic engineering [J]., 2016, 17(1): 134.

[11] Wang Z, Ren W C, Yan S,. Characterization of the complete chloroplast genome ofF. Schmidt ex Maxim [J]., 2021, 6(7): 1999-2000.

[12] Bankevich A, Nurk S, Antipov D,. SPAdes: A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing [J]., 2012, 19(5): 455-477.

[13] Shi L C, Chen H M, Jiang M,. CPGAVAS2, an integrated plastome sequence annotator and analyzer [J]., 2019, 47(W1): W65-W73.

[14] Rozewicki J, Li S L, Amada K M,. MAFFT-DASH: Integrated protein sequence and structural alignment [J]., 2019, 47(W1): W5-W10.

[15] Kumar S, Stecher G, Li M,. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J]., 2018, 35(6): 1547-1549.

[16] Tourasse N J, Shtaida N, Khozin-Goldberg I,. The complete mitochondrial genome sequence of the green microalga()reveals a new type of palindromic repetitive repeat [J]., 2015, 16(1): 580.

[17] Farhangian-Kashani S, Azadi A, Khaghani S,. Association analysis and evaluation of genetic diversity in wheat genotypes using SSR markers [J]., 2021, 72(4): 441-452.

[18] Shioi S, Shimamoto A, Nakagami Y,. Precision length determination andsimulation in PCR of microsatellite repeat sequences [J]., 2021, 42(12/13): 1323-1332.

[19] 陳中蘇直, 田波, 蔡傳濤. 基于SSR分子標(biāo)記的滇重樓遺傳多樣性研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(9): 1834-1838.

[20] 周茜, 陳蕓, 王玉州, 等. 獨(dú)行菜LaBBX基因低溫表達(dá)響應(yīng)與密碼子偏性分析 [J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2021, 35(6): 1253-1262.

[21] Chen Z X, Yao X Y, Downie S R,. Assembling and analysis ofchloroplast genome [J]., 2019, 27(4): 366-372.

[22] Chen Z X, Yao X Y, Wang Q Z. The complete chloroplast genome of[J].DNA Part B, 2019, 4(1): 734-735.

[23] Yan W J, Yang T G, Qin R,. Complete chloroplast genome of(Umbelliferae) [J]., 2021, 6(2): 536-537.

[24] Liao C Y, Gao Q, Wu F. The chloroplast genome of(Apiaceae), an endemic medicinal plant to China [J]., 2020, 5(3): 3782-3783.

[25] Wang S J, Zhang T T, Xu L,. The complete chloroplast genome of(Umbelliferae,L.) [J]., 2020, 5(3): 3025-3027.

[26] Li L L, Geng M L, Li Y S,. Characterization of the complete plastome of(Turcz.) schischk [J]., 2020, 5(1): 786-787.

[27] Zhang R, Xu B H, Cao T Y. Characterization of the complete chloroplast genome of(Apiaceae) as an herb in China [J]., 2020, 5(1): 678-679.

[28] 朱婷婷, 張磊, 陳萬(wàn)生, 等. 1342個(gè)植物葉綠體基因組分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2017, 36(10): 4323-4333.

[29] Nie X J, Lv S Z, Zhang Y X,. Complete chloroplast genome sequence of a major invasive species, crofton weed () [J]., 2012, 7(5): e36869.

[30] Liu J, Qi Z C, Zhao Y P,. Complete cpDNA genome sequence ofand phylogenetic placement of Liliales: Influences of gene partitions and taxon sampling [J]., 2012, 64(3): 545-562.

[31] 王虹雨, 李錦萍, 張瑞峰, 等. 基于高通量技術(shù)的橢圓葉花錨葉綠體全基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析[J/OL]. 分子植物育種: [2022-10-21]. http://kns.cnki.net/kcms/ detail/46.1068.S.20210611.1420.012.html.

[32] 姚雪瑩. 直刺變豆菜的譜系地理學(xué)和遺傳多樣性研究 [D]. 泉州: 華僑大學(xué), 2020.

[33] 陳志祥, 姚雪瑩, Stephen R D, 等. 直刺變豆菜葉綠體全基因組及其特征 [J]. 生物多樣性, 2019, 27(4): 366-372.

[34] 楊晨, 陳志祥, 姚雪瑩, 等. 中國(guó)15種變豆菜屬植物的花粉形態(tài)及系統(tǒng)學(xué)分析 [J]. 植物研究, 2020, 40(6): 805-812.

Assembly and sequence analysis of chloroplast genome of

WANG Zhen1, LIU Chi2, REN Wei-chao1, ZHANG Mei-qi1, LIU Xiu-bo1, MA Wei1, 3, 4

1. College of Pharmaceutical Sciences, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. School of Information, Technical University of Kemnitz, Kemnitz 09111, Germany 3. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 4. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China

The chloroplast genome was assembled and the sequence characteristics analyzed with fresh leaves ofas the experimental materials through high-throughput sequencing, so as to provide guidance for the further development of the evolution and genetic development of.The experimental procedures were carried out according to Illumina's standard operating procedures, including the sample quality test, the construction of library, the quality test of the sample library and the sequencing of the library, the reported chloroplast genome ofwas used as a reference sequence, and the complete chloroplast genome ofwas obtained and assembled, and the assembly characteristic sequence analysis and evolutionary analysis were performed.The chloroplast genome ofhad a typical circular quadripartite structure with a size of 155 700 bp in length. In which a large single-copy (LSC) of 85 979 bp and a pair of inverted repeats (IRs) of 26 333 bp were disconnected by a small single-copy (SSC) of 17 053bp. A total of 130 genes were annotated, including 86 protein-coding genes (PCGs), 36 transfer RNA genes (tRNAs) and eight ribosomal RNA genes (rRNAs). AT content accounted for 61.83% of the chloroplast genome. One forward repeat sequence and three palindromic repeat sequences were detected. In addition, 168 simple sequence repeats (SSR) sites were detected. The codon corresponding to the protein coding gene preferred to use A/T base. The codon (I) encoding isoleucine had the highest frequency of use, while the codon (C) encoding cysteine had the lowest frequency. A phylogenetic tree with maximum likelihood (ML) was constructed based on the chloroplast genomes of seven reported Apiaceae species and two other species. It was found thatwere most closely related withand.The chloroplast genome ofprovides more detailed and complete data for the study of Apiaceae plants, and provides a reference basis for chloroplast genetic engineering and systematic evolution analysis of this species.

Fr. Schmidt; complete chloroplast genome; high-throughput sequencing; phylogeny; maximum likelihood

R282.12

A

0253 - 2670(2022)22 - 7183 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.022

2022-02-02

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目：名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)項(xiàng)目（2060302）；中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（SKL2020M0302）

王 震（1995—），男，碩士，研究方向?yàn)樗幱弥参锕こ?。Tel: (0451)87266827 E-mail: 1021707041@qq.com

馬 偉，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锕こ膛c中藥資源。Tel: (0451)87266827 E-mail: mawei@hljucm.net

劉秀波（1975—），教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锕こ?。Tel: 13796353268 E-mail: 358270831@qq.com

#共同第一作者：柳 馳（1991—），男，碩士，研究方向?yàn)樾畔⒎治觥el: (0451)87266827

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]