李 暢，王 浩，賀千羽，郭向宇，姜彤偉*，郭 焱*

槲皮素通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡抑制A549細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究

李 暢1，王 浩2，賀千羽1，郭向宇1，姜彤偉1*，郭 焱1*

1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117 2. 集安市醫(yī)院，吉林 集安 134200

基于鐵死亡信號(hào)通路探究槲皮素對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。CCK-8法篩選槲皮素作用于A549細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度；平板克隆法檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞集落形成能力的影響；利用試劑盒檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平的影響；采用Western blotting檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白及線粒體凋亡蛋白表達(dá)的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）、脂質(zhì)過(guò)氧化物水平及細(xì)胞凋亡的影響。聯(lián)合鐵死亡抑制劑（Ferrostatin-1）或ROS清除劑-乙酰半胱氨酸（-acetylcysteine，NAC）檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)GSH水平及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與對(duì)照組比較，槲皮素顯著抑制A549細(xì)胞存活率，且呈時(shí)間和劑量相關(guān)性（＜0.01）；槲皮素呈劑量相關(guān)性地抑制A549細(xì)胞集落形成（＜0.01），顯著降低A549細(xì)胞內(nèi)GSH水平（＜0.01），上調(diào)細(xì)胞內(nèi)mtROS及脂質(zhì)過(guò)氧化物水平（＜0.05、0.01），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（＜0.01）；顯著促進(jìn)鐵死亡相關(guān)蛋白p53表達(dá)（＜0.05、0.01），并抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（recombinant glutathione peroxidase 4，GPX4）及胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）蛋白表達(dá)（＜0.01）；顯著促進(jìn)線粒體凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-9、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和B淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），并抑制抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)（＜0.01）。與槲皮素組比較，槲皮素＋NAC組與槲皮素＋Ferrostatin-1組均不同程度恢復(fù)槲皮素引起的細(xì)胞存活率下降（＜0.05、0.001），F(xiàn)errostatin-1可顯著上調(diào)GPX4及SLC7A11蛋白表達(dá)水平（＜0.05），并回調(diào)GSH水平（＜0.05）。槲皮素能夠抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)鐵死亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡的生物學(xué)效應(yīng)。

非小細(xì)胞肺癌；槲皮素；鐵死亡；細(xì)胞增殖；線粒體活性氧；脂質(zhì)過(guò)氧化物

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居腫瘤首位，5年生存率不到20%[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%[2]。現(xiàn)有的治療方法主要是外科手術(shù)以及放療、化療治療，但放化療具有不良反應(yīng)多、耐受性等問(wèn)題[3]。中藥因具有毒性較小、不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)勢(shì)逐步成為研究重點(diǎn)，中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖是當(dāng)前尋找有效癌癥治療的一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

槲皮素是植物中廣泛存在的天然黃酮類化合物，是貫葉連翹L.的主要有效成分[4]，具有止咳、平喘、抗病毒、抗氧化等藥理活性[5]。研究表明，槲皮素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒活性[6]，在內(nèi)科疾病、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有一定治療作用[7]，同時(shí)在肺癌中也有良好的治療作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)槲皮素及其衍生物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-dependent/activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)人肺癌A549細(xì)胞凋亡[8]。表明槲皮素是一種潛在的抗腫瘤藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，但槲皮素對(duì)NSCLC的干預(yù)效果仍需進(jìn)一步的研究。

2012年，Dixon等[9]首次報(bào)道了鐵死亡這一新型細(xì)胞死亡方式，其特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加超過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的代償，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡。鐵死亡在形態(tài)、生化、遺傳和功能上明顯不同于細(xì)胞壞死、凋亡和自噬，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和耐藥等密切相關(guān)[10]。鐵是人體內(nèi)重要的微量元素，過(guò)量的鐵會(huì)催化芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS，從而促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致鐵死亡，同時(shí)鐵代謝生物學(xué)過(guò)程中鐵可從各個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控鐵死亡[11]。研究報(bào)道，鐵代謝失調(diào)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，NSCLC可能通過(guò)鐵代謝途徑發(fā)生鐵死亡[12]。同時(shí)在腎癌、結(jié)直腸癌及乳腺癌等腫瘤研究中已證實(shí)調(diào)控鐵死亡可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[13]。此外，槲皮素具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵蛋白積累并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵代謝失常的作用，最終引起機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)失衡[14]。因此，本研究基于鐵死亡通路，以A549細(xì)胞為研究對(duì)象，探究槲皮素對(duì)A549細(xì)胞增殖以及鐵死亡的影響，進(jìn)而探討槲皮素通過(guò)誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生鐵死亡生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，以期為其臨床治療NSCLC提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)C28J11Y116820）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)2148389）購(gòu)自以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AG29719232）、胰蛋白酶（批號(hào)2403077）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS緩沖液（批號(hào)I30FD0151）購(gòu)自上海生工公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)BCCD8942）、-乙酰半胱氨酸（-acetylcysteine，NAC，批號(hào)WXBC5687V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)092221220118）、CCK-8細(xì)胞活力試劑盒（批號(hào)031821210930）、FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡試劑盒（批號(hào)092120210513）購(gòu)自上海碧云天公司；MitoSoxTM Red線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）檢測(cè)探針（批號(hào)2286876）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200616）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)01621098）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（recombinant glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（批號(hào)334286）、胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）抗體（批號(hào)334063）購(gòu)自上海Abmart生物醫(yī)藥公司；β-actin抗體（批號(hào)ab8227）、p53抗體（批號(hào)GR146370-9）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗體（批號(hào)GR247561-2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)GR196071-15）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)GR151406-19）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)00101520）、Caspase-9抗體（批號(hào)00097424）購(gòu)自美國(guó)Proteintech生物公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)214800915）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)219761108）購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司；Liperfluo細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè)探針（批號(hào)TM607）購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司；鐵死亡特異性抑制劑（Ferrostatin-1，批號(hào)148475）購(gòu)自上海陶素藥業(yè)有限公司。

1.3 儀器

FORMA3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；BD Accuri C6TM流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Infinite M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；1645050型蛋白質(zhì)電泳儀、Mini-PROTEAN?Tetra Cell Systems電泳槽、Trans-Blot?SD System半干轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 槲皮素母液的配制

精密稱取槲皮素10 mg溶于3.3 mL DMSO中，配成濃度為10 mmol/L的槲皮素母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，于4 ℃避光保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以5×103/孔接種到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含槲皮素終濃度為0、50、100、150、200、250、300 μmol/L的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔吸光度（）值，以培養(yǎng)基為空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算槲皮素對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），根據(jù)IC50值設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）和槲皮素低、中、高劑量（100、150、200 μmol/L）組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)14 d，直至形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，結(jié)晶紫染色10 min，棄掉染液，PBS清洗2次，拍照。加入DMSO溶解結(jié)晶紫，采用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處各孔值。

2.5 細(xì)胞內(nèi)GSH水平測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組（不加藥物）和槲皮素低、中、高劑量（100、150、200 μmol/L）組，加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基處理24 h，收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH水平。

2.6 Western blotting檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)和線粒體凋亡蛋白表達(dá)的影響

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉3 h，加入相應(yīng)一抗孵育過(guò)夜；TBST充分洗膜后，加入二抗，室溫孵育40 min，TBST充分洗膜，加入顯影液曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.7 細(xì)胞內(nèi)mtROS水平測(cè)定

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入1 mL MitoSox（2 μmol/L），37 ℃避光孵育20 min，PBS洗滌3次，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.8 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物水平測(cè)定

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，用Liperfluo熒光探針染液（10 μmol/L）重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，用PBS將細(xì)胞重懸后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.9 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，1000 r/min離心3 min，PBS洗滌3次，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V/FITC混勻，再加入碘化丙啶（PI）染液，37 ℃避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.10 Ferrostatin-1及NAC與槲皮素聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以5×103/孔接種到96孔板中。設(shè)置對(duì)照組（不含藥物）、槲皮素（200 μmol/L）組、Ferrostatin-1（1 μmol/L）組、槲皮素＋Ferrostatin-1組、NAC（5 mmol/L）組和槲皮素＋NAC組。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組僅加入DMEM培養(yǎng)基，各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的等體積培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定細(xì)胞存活率。

2.11 Ferrostatin-1與槲皮素聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)及GSH水平的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組（不含藥物）、槲皮素（200 μmol/L）組、Ferrostatin-1（1 μmol/L）組和槲皮素＋Ferrostatin-1組，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法測(cè)定鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH水平。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

為檢測(cè)槲皮素對(duì)A549細(xì)胞活力的影響并確定藥物作用濃度，采用不同濃度槲皮素分別處理細(xì)胞24、48、72 h，其IC50分別為160、77.47、63.58 μmol/L。如圖1所示，與對(duì)照組比較，槲皮素（100、150、200 μmol/L）組在24、48、72 h時(shí)的細(xì)胞存活率均明顯降低（＜0.01），且呈時(shí)間和劑量相關(guān)性。從48 h開(kāi)始，與對(duì)照組比較，給藥組細(xì)胞的增殖活力受到明顯抑制，由于作用48、72 h細(xì)胞死亡較多，因此選擇藥物作用24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物最佳作用時(shí)間。參考以上結(jié)果，確定24 h為槲皮素的作用時(shí)間，100、150、200 μmol/L為槲皮素的作用劑量。

3.2 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，隨著槲皮素組濃度升高，細(xì)胞克隆形成數(shù)均顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性，表明槲皮素能夠抑制A549細(xì)胞集落形成能力，即抑制A549細(xì)胞增殖。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖2 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞克隆形成能力的影響(, n = 3)

3.3 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響

鐵死亡的發(fā)生伴隨著GSH水平下降。如圖3所示，與對(duì)照組比較，各劑量的槲皮素組細(xì)胞內(nèi)GSH水平均顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.4 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，各劑量的槲皮素組細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平均明顯下降（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。p53、SLC7A11及GPX4為鐵死亡相關(guān)蛋白，表明槲皮素可調(diào)控鐵死亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)從而激活鐵死亡。

圖3 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響(, n = 3)

圖4 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.5 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)mtROS水平的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，各劑量的槲皮素組細(xì)胞內(nèi)mtROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性，表明槲皮素能夠激活細(xì)胞內(nèi)mtROS的產(chǎn)生。

3.6 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，150、200 μmol/L槲皮素組細(xì)胞內(nèi)Liperfluo脂質(zhì)過(guò)氧化物熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性，表明槲皮素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

圖5 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)mtROS水平的影響(, n = 3)

圖6 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的影響(, n = 3)

3.7 Ferrostatin-1及NAC與槲皮素聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

分別聯(lián)合Ferrostatin-1及NAC處理細(xì)胞，觀察200 μmol/L槲皮素處理下各抑制劑對(duì)槲皮素引起的細(xì)胞活力下降恢復(fù)效果。如圖7所示，不同小分子抑制劑對(duì)槲皮素所致的細(xì)胞活力下降均有恢復(fù)作用（＜0.05、0.001），進(jìn)一步說(shuō)明槲皮素誘導(dǎo)A549細(xì)胞的死亡方式為鐵死亡。

3.8 Ferrostatin-1與槲皮素聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)及GSH水平的影響

如圖8-A所示，與槲皮素組比較，F(xiàn)errostatin-1顯著上調(diào)槲皮素誘導(dǎo)的SLC7A11與GPX4蛋白表達(dá)水平降低（＜0.05）。如圖8-B所示，與槲皮素組比較，F(xiàn)errostatin-1顯著回調(diào)槲皮素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)GSH水平降低（＜0.05）。

與槲皮素組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001，圖8同

圖8 Ferrostatin-1與槲皮素聯(lián)合處理對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)(A) 及GSH水平(B) 的影響(, n = 3)

3.9 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞凋亡及線粒體凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，槲皮素組細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。如圖10所示，與對(duì)照組比較，槲皮素組Caspase-9、Caspase-3、Bax和Cyt C蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），表明槲皮素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

圖9 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

圖10 槲皮素對(duì)A549細(xì)胞線粒體凋亡蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

近30年來(lái)，肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)且發(fā)生率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤。癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)，這是制約肺癌手術(shù)后生存率提高的主要原因[15]。本研究評(píng)估了槲皮素對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡的作用，并探討了鐵死亡被誘導(dǎo)后槲皮素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。

近年研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有廣譜抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制主要集中在誘導(dǎo)自噬、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面，并對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌有較好的抑制作用[16-18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)槲皮素處理后，A549細(xì)胞存活率顯著降低，且呈劑量相關(guān)性，同時(shí)細(xì)胞克隆形成能力下降亦呈劑量相關(guān)性，以上結(jié)果表明槲皮素可抑制A549細(xì)胞增殖。

鐵死亡發(fā)生時(shí)主要表現(xiàn)為線粒體縮小、膜致密增厚、SLC7A11與GPX4蛋白活性降低、GSH含量消耗和mtROS過(guò)量積累造成細(xì)胞膜上脂質(zhì)過(guò)氧化物升高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)槲皮素處理后，A549細(xì)胞中GSH水平降低，mtROS與脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高，且呈劑量相關(guān)性，提示槲皮素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

p53蛋白在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮著重要的作用[20]，p53蛋白可通過(guò)抑制SLC7A11蛋白表達(dá)，從而抑制GSH活性，降低GPX4蛋白的表達(dá)并促進(jìn)鐵死亡[21]，GPX4失活導(dǎo)致致命性的代謝失衡是細(xì)胞內(nèi)鐵死亡的執(zhí)行者[22]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可誘導(dǎo)p53依賴性癌細(xì)胞鐵死亡，并與肺癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)槲皮素處理后，A549細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平升高，SLC7A11以及GPX4蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量相關(guān)性，提示槲皮素通過(guò)抑制p53/SLC7A11/GPX4通路，誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡。為進(jìn)一步探討鐵死亡通路是否影響槲皮素對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用，本研究首先對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行槲皮素預(yù)處理，然后聯(lián)合鐵死亡特異性抑制劑Ferrostatin-1和ROS清除劑NAC處理細(xì)胞。Ferrostatin-1作為一種親脂性自由基捕獲抗氧化劑，可以預(yù)防鐵死亡。研究報(bào)道，在肝癌細(xì)胞中，F(xiàn)errostatin-1與NAC可阻止二氫青蒿素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡[24]。結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用槲皮素組相比，槲皮素＋Ferrostatin-1組、槲皮素＋NAC組細(xì)胞活力均有恢復(fù)，提示鐵死亡可能影響槲皮素抑制A549細(xì)胞增殖。進(jìn)一步探討鐵死亡特異性抑制劑Ferrostatin-1對(duì)槲皮素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)GSH水平、SLC7A11及GPX4蛋白表達(dá)恢復(fù)的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)errostatin-1可恢復(fù)槲皮素導(dǎo)致的GSH水平下降以及SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)下調(diào)。

另有研究表明，槲皮素可抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[25]。結(jié)果顯示，槲皮素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。線粒體形態(tài)與鐵死亡進(jìn)展存在重要的聯(lián)系，Cyt C表達(dá)于線粒體內(nèi)膜，可作為線粒體損傷的標(biāo)志物。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，Cyt C釋放至胞質(zhì)觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)槲皮素處理后，Cyt C、Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白表達(dá)均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低。提示槲皮素可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)線粒體凋亡蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明槲皮素激活肺癌細(xì)胞鐵死亡過(guò)程中有線粒體凋亡途徑的參與。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，可能不僅局限于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，鐵死亡在槲皮素抗肺癌作用機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。但鐵死亡與細(xì)胞凋亡在共同抑制肺癌細(xì)胞活性中是否存在相互作用及聯(lián)系仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of quercetin on inhibiting proliferation of A549 cells via induction of ferroptosis

LI Chang1, WANG Hao2, HE Qian-yu1, GUO Xiang-yu1, JIANG Tong-wei1, GUO Yan1

1. School of Clinical Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2. Ji’an Hospital, Ji’an 134200, China

To explore the effect and mechanism of quercetin on proliferation of human non-small cell lung cancer A549 cells based on ferroptosis signaling pathway.CCK-8 method was used to screen the experimental concentration of quercetin on A549 cells; The effect of quercetin on colony forming ability of A549 cells was detected by plate cloning method; The effect of quercetin on glutathione (GSH) level in A549 cells was detected by kit; Western blotting was used to detect the effect of quercetin on the expressions of ferroptosis related protein and mitochondrial apoptosis protein in A549 cells; The effects of quercetin on mitochondrial reactive oxygen species (mtROS), lipid peroxide level and apoptosis in A549 cells were detected by flow cytometry. Combined with ferroptosis inhibitor (Ferrostatin-1) or ROS scavenger-acetylcysteine (NAC), the effects of quercetin on GSH level and expressions of ferroptosis related proteins in A549 cells were detected.Compared with control group, quercetin significantly inhibited the survival rate of A549 cells, with a time-dose correlation (< 0.01). Quercetin inhibited the colony formation of A549 cells in a dose-dependent manner (< 0.01), significantly decreased GSH level in A549 cells (< 0.01), up-regulated mtROS and lipid peroxide levels in A549 cells (< 0.05, 0.01), and induced apoptosis (< 0.01); Quercetin significantly promoted the expression of ferroptosis related protein p53 (< 0.05, 0.01), and inhibited the expressions of glutathione peroxidase 4 (GPX4) and soluble carrier family 7 member 11 (SLC7A11) (< 0.01); Quercetin significantly promoted expressions of mitochondrial apoptosis related proteins such as cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3), Caspase-9, cytochrome c (Cyt C) and B cell lymphoma-2 (Bcl-2) related X protein (Bax) (< 0.05, 0.01), and inhibited the protein expression of anti-apoptotic factor Bcl-2 (< 0.01). Compared with quercetin group, quercetin + NAC group and quercetin + Ferrostatin-1 group recovered the decrease of cell survival rate caused by quercetin to varying degrees (< 0.05, 0.001), and ferrostatin-1 could significantly up-regulated GPX4 and SLC7A11 protein expressions (< 0.05), and regulated the level of GSH (< 0.05).Quercetin can inhibit the proliferation of A549 cells and induce ferroptosis, and then lead to cell apoptosis, which has the biological effect of inducing ferroptosis in A549 cells.

non-small cell lung; quercetin; ferroptosis; cell proliferation; mitochondrial reactive oxygen species; lipid peroxides

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7112 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.014

2022-08-14

吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（YDZJ202201ZYTS151）；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際合作項(xiàng)目（3191101705）；吉林省科學(xué)技術(shù)廳（20210204029YY）

李 暢，女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)相關(guān)研究。E-mail: lichang970330@163.com

姜彤偉，男，博士，教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail: tw2008.ok@163.com

郭 焱，女，博士，教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail: ccguoyan@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]