田文國，陳金鵬，王春芳，劉 毅，蓋曉紅，劉全國，田成旺，陳常青

基于網絡藥理學和分子對接探究腸炎寧顆粒治療功能性腹瀉和腹瀉型腸易激綜合征的作用機制

田文國1, 2，陳金鵬2, 3, 4，王春芳1, 2，劉 毅2, 3, 4，蓋曉紅2, 3, 4，劉全國5，田成旺2, 3, 4*，陳常青2, 3, 4*

1. 天津中醫(yī)藥大學，天津 301617 2. 天津藥物研究院，天津 300462 3. 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462 4. 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300462 5. 海南葫蘆娃藥業(yè)集團股份有限公司，海南 海口 570216

運用網絡藥理學和分子對接方法探究腸炎寧顆粒治療功能性腹瀉（functional diarrhea，F(xiàn)D）和腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）的作用機制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、文獻檢索腸炎寧顆粒5味藥材的成分；SwissADME平臺篩選腸炎寧顆?；钚猿煞?；SwissTargetPrediction平臺反向靶標預測腸炎寧顆?；钚猿煞肿饔冒悬c；GeneCards數(shù)據(jù)庫預測FD和IBS-D靶點；Venny 2.1.0獲取腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的交集靶點；STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡后導入Cytoscape 3.9.1軟件獲取核心靶點；OmicsBean數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；Cytoscape 3.9.1軟件構建“藥材-活性成分-靶點”及“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡；Schr?dinger-Maestro對關鍵活性成分和核心靶點進行分子對接。從腸炎寧顆粒中篩選得到治療FD和IBS-D的活性成分30個，其中10個關鍵活性成分為甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素；24個核心靶點為蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其主要涉及內分泌抵抗、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、前列腺癌等通路。分子對接表明關鍵活性成分與核心靶點均可自發(fā)結合。腸炎寧顆?？赡芡ㄟ^多成分、多靶點和多通路，降低內臟敏感、減少炎性反應、調節(jié)腸道菌群，從而治療FD和IBS-D。

腸炎寧顆粒；功能性腹瀉；腹瀉型腸易激綜合征；網絡藥理學；甲基異茜草素；槲皮素；4′,5-二羥基黃酮；山柰酚；鞣花酸；焦性沒食子酸；金圣草黃素；咖啡酸；木犀草素；芹菜素

功能性腹瀉（functional diarrhea，F(xiàn)D）是臨床上消化系統(tǒng)常見的一種疾病，以持續(xù)性或反復發(fā)作性水樣便或松散便，腹痛或腹脹癥狀不明顯，排便次數(shù)增多為主要臨床特征[1]。腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）作為腸易激綜合征的1個亞型，是一種表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹痛并伴隨腹瀉的疾病[2]。FD和IBS-D的發(fā)生都不具有典型的胃腸道器質性病變，一般FD患者以腹瀉為主而腹痛為次，IBS-D患者以腹痛為主而腹瀉輕微[3]。FD與IBS-D具有病情復雜、病程較長、遷延難愈的特點，長期患病對患者生活、工作造成了極大影響，且兩者在病情發(fā)展的過程中可相互轉化[4]。目前臨床治療FD與IBS-D主要以止瀉、止痛為主，但療效欠佳，且不良反應多，無法長期使用，因此亟需療效確切的治療藥物。

中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的特點，其臨床療效顯著。腸炎寧顆粒為現(xiàn)代中藥制劑，主要由金毛耳草、地錦草、樟樹根、楓樹葉、香薷組成，其中金毛耳草為君藥，性平味苦，具有清熱祛濕、止瀉的功效；地錦草與楓樹葉均為臣藥，可增強君藥的功效，并能起到清熱解毒、利濕止瀉的作用；樟樹根具有祛風止痛的功效；香薷具有祛濕和中的功效，諸藥合用便可起到清熱利濕、行氣的功效[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)[6]，上述5味中藥中含有多種有效成分，包括黃酮類、環(huán)烯醚萜苷、鞣質類等，這些成分具有抗菌、抗炎、止血、抗氧化、增強免疫力等作用。但目前關于腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的作用機制尚不明確，相關研究亦不多見。

網絡藥理學這一概念由英國Hopkins教授于2007年提出[7]，近些年已成為中藥藥效物質基礎與作用機制研究的熱門工具[8-10]。網絡藥理學可基于系統(tǒng)生物學理論研究藥物，從多成分、多靶點、多通路探究藥物的作用機制，通過網絡藥理學不同層次的網絡構建，建立“藥材-成分-靶點-通路”的網絡模型，在揭示中藥復方的復雜作用機制方面起著重要作用，可全面研究復雜藥物對疾病的影響和干預。因此，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術初步探討腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的作用機制，以期為腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的進一步研究及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腸炎寧顆粒中藥材成分庫的建立

腸炎寧顆粒由金毛耳草、地錦草、樟樹根、楓香樹葉、香薷5味中藥組成。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[11]篩選地錦草、香薷2味中藥的成分，對于TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄的金毛耳草、樟樹根及楓香樹葉通過相關參考文獻，查找其所含成分。

1.2 腸炎寧顆粒活性成分及靶點篩選

通過Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）數(shù)據(jù)庫[12]檢索腸炎寧中藥成分的Canonical SMILES結構，將中藥成分的Canonical SMILES結構導入SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/）[13]進行口服生物利用度及類藥性分析。將Pharmacokinetics項下GI absorption滿足High，同時Druglikeness項下Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge滿足2個Yes以上的成分作為候選活性成分，將候選活性成分的Canonical SMILES結構導入SwissTargetPrediction平臺（http://www. swisstargetprediction.ch/）[14]，選擇物種為“Homo sapiens”，條件設為“Probability＞0.3”，進行腸炎寧顆粒候選活性成分靶點預測。

1.3 FD和IBS-D疾病靶點預測

在GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]數(shù)據(jù)庫中以“diarrhea irritable bowel syndrome”和“functional diarrhea”為關鍵詞檢索疾病相關的靶點，取Relevance score＞4作為FD和IBS-D候選疾病靶點。

1.4 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“藥材-活性成分-靶點”網絡構建

將在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到的FD和IBS-D靶點與腸炎寧顆粒候選靶點在Venny 2.1.0（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）[16]中生成韋恩圖，映射篩選出共同靶點。根據(jù)“腸炎寧顆粒5味中藥材”“腸炎寧顆?；钚猿煞帧币约啊澳c炎寧顆?；钚猿煞种委烣D和IBS-D的作用靶點”，在Excel表格中建立“藥材-活性成分”“活性成分-靶點”的相互對應關系，導入Cytoscape 3.9.1軟件中構建腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“藥材-活性成分-靶點”網絡。

1.5 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建及核心靶點篩選

為探究腸炎寧顆粒相關靶點與FD和IBS-D的相互作用，將交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫（https://cn. stringdb.org/cgi/input?sessionId=bgKEhiAlcSw4& input_ page_show_search=on）[17]，物種設置為“Homo Sapiens”，構建PPI網絡，設定置信度為0.9，隱藏游離靶標，下載TSV格式文件并導入Cytoscape 3.9.1，繪制PPI網絡圖。運用“Network Analyze”進行拓撲參數(shù)分析，根據(jù)節(jié)點連接度值＞中位數(shù)篩選核心靶點。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

運用Omicsbean平臺（http://www.omicsbean. cn/）[18]對腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D核心靶點進行GO功能以及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF），篩選GO功能富集分析前10項結果制成柱狀圖進行可視化；篩選KEGG通路富集分析前10條通路制成氣泡圖進行可視化。

1.7 腸炎寧顆粒“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡構建

根據(jù)腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點所對應的關鍵活性成分以及核心靶點做KEGG富集通路預測結果，在Excel表格中建立“關鍵活性成分-核心靶點”和“核心靶點-通路”的相互對應關系，導入Cytoscape 3.9.1軟件中構建腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡。

1.8 分子對接

關鍵活性成分作為小分子配體，通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜索關鍵活性成分CAS號，從Chem3D19.0中導出，對其執(zhí)行能量最低計算保存為mol2格式。核心靶點作為受體，從Protein Data Bank（PBD）數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）[19]下載核心靶點蛋白的PDB格式三維結構（核心靶點蛋白遵循：人源蛋白，分辨率及優(yōu)先選擇具有原始配體）。將數(shù)據(jù)導入Schr?dinger2020Maestro12.4軟件對核心靶點蛋白去水與關鍵活性成分做分子對接。

2 結果

2.1 腸炎寧顆粒中藥材活性成分

如表1所示，共篩選得到腸炎寧顆粒在SwissTargetPrediction平臺有作用靶點的活性成分88個，金毛耳草5個、地錦草10個、樟樹根6個、楓香樹葉13個、香薷60個。其中金毛耳草、香薷含有共有活性成分1個，為槲皮素；地錦草、楓香樹葉含有共有活性成分1個，為山柰酚；地錦草、香薷含有共有活性成分2個，為亞麻子油酸及軟脂酸；樟樹根、香薷含有共有活性成分2個，為桉葉油醇及黃樟素。

表1 腸炎寧顆粒中活性成分

續(xù)表1

2.2 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D作用靶點篩選

通過將腸炎寧顆?；钚猿煞諧anonical SMILES結構導入SwissTargetPrediction平臺，選擇物種為“Homo sapiens”，條件設為“Probability＞0.3”，預測得到了不重復的靶點共計171個。通過Genecards數(shù)據(jù)庫以“functional diarrhea”為關鍵詞搜索到Relevance score＞4的相關靶點2007個，以“diarrhea irritable bowel syndrome”為關鍵詞搜索到Relevance score＞4的相關靶點1970個，將在Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索得到的FD和IBS-D靶點與腸炎寧顆粒全方候選靶點在Venny 2.1.0中生成韋恩圖，映射篩選出77個共有靶點，作為腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用靶點，見圖1。

圖1 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D靶點的Venn圖

2.3 腸炎寧顆粒“藥材-活性成分-靶點”網絡構建

利用Cytoscape 3.9.1軟件處理得到“藥材-活性成分-靶點”網絡，見圖2，運用“Network Analyze”進行拓撲分析，該網絡有112個節(jié)點、282條邊，各節(jié)點表示藥材、成分、靶點，各節(jié)點間的邊代表“藥材-成分”“成分-靶點”之間的對應關系，網絡中平均相鄰節(jié)點數(shù)為5.212，網絡密度0.051，網絡異質性為1.504，網絡中心度0.424。表明腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D是基于多成分、多靶點的復雜協(xié)同作用。

2.4 藥物與疾病靶點交集PPI分析

將腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的77個作用靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，進行PPI網絡構建，設定置信度為0.9，隱藏游離靶標，下載TSV格式文件并導入Cytoscape 3.9.1，繪制PPI網絡圖見圖3。運用“Network Analyze”進行拓撲分析，發(fā)現(xiàn)此網絡中共有55個節(jié)點，130條邊，節(jié)點代表靶點，每條邊則代表靶點互作關系，節(jié)點的大小與顏色代表靶點的度值，節(jié)點越大，顏色越深，表明作用越關鍵。以節(jié)點連接度值＞中位數(shù)為核心靶點，經計算度值中位數(shù)為4，其中原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）、磷脂酰肌醇-3激酶調節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、雌激素受體1（estrogen receptor，ESR1）、酪氨酸激酶Fyn（tyrosine kinase Fyn，F(xiàn)YN）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、細胞周期蛋白依賴激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2，PTK2）、糖原合成酶激酶3B（glycogen synthase kinase 3B，GSK3B）、細胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、CDK4、CDK6、CCND1、極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFRB）、CDK2、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase，PIK3CG）、拓撲異構酶2α（topoisomerase 2α，TOP2A）、erb-b2受體酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、激酶插入域受體（kinase insert domain receptor，KDR）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）24個核心靶點的度值中位數(shù)值大于4。

圖3 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D潛在作用靶點PPI網絡

2.5 GO功能富集分析

利用OmicsBean分析平臺對24個核心靶點進行GO功能注釋分析，共得BP 285個條目（＜0.05），CC 270個條目（＜0.05），MF 225個條目（＜0.05），按值排序，選取排名前10的項目進行可視化展示，繪制GO功能注釋分析柱狀圖，見圖4。其中，BP主要涉及大分子代謝過程的正調控、對含氧化合物的反應等；CC主要涉及細胞質基質、細胞核等；MF主要涉及激酶活性、作用于蛋白質的催化活性等。

圖4 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點GO功能富集分析(前10)

2.6 KEGG通路富集分析

利用OmicsBean分析平臺對24個核心靶點進行KEGG通路富集分析，共獲得105條信號通路（＜0.05），選取排名前10的通路進行可視化處理，繪制KEGG信號通路氣泡圖，見圖5。其中rich factor表示相關基因中位于該通路的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該通路的基因總數(shù)的比值，該值越大代表富集程度越高。分析富集的通路發(fā)現(xiàn)，主要有內分泌抵抗通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路等。

2.7 腸炎寧顆?！瓣P鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡構建

根據(jù)24個核心靶點對應出具有治療FD和IBS-D的腸炎寧顆粒關鍵活性成分有10個，其中金毛耳草2個，為甲基異茜草素、槲皮素；地錦草3個，為4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸；楓香樹葉2個，為焦性沒食子酸、山柰酚；香薷5個，為金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素、槲皮素。金毛耳草和香薷含有共有成分1個，為槲皮素；地錦草和楓香樹葉含有共有成分1個，為山柰酚。利用Cytoscape 3.9.1軟件得到腸炎寧顆粒24個核心靶點的“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡，見圖6。運用“Network Analyze”進行拓撲分析，該網絡有139個節(jié)點、576邊，網絡中各節(jié)點代表關鍵活性成分、核心靶點、信號通路，各節(jié)點間邊表示“關鍵活性成分-核心靶點”“核心靶點-通路的相互作用”，網絡中平均相鄰節(jié)點數(shù)為8.259，網絡密度為0.060，網絡異質性為1.437，網絡中心度為0.579，網絡結果顯示存在1個分子與多個核心靶點蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同1個靶點蛋白的現(xiàn)象，同時也顯示了1個核心靶點可對應多條信號通路，表明腸炎寧顆粒可能通過多成分、多靶點、多通路治療FD與IBS-D，初步闡釋了腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的主要藥效物質基礎和作用機制。

圖5 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點KEGG通路富集分析(前10)

圖6 “關鍵活性成分-核心靶點-信號通路”網絡

2.8 分子對接結果

利用Schr?dinger2020Maestro12.4軟件將10個關鍵活性成分（甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素）與PPI網絡圖中24個核心蛋白（SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、CDK1、PTK2、GSK3B、CCNA2、EGFR、CDK4、CDK6、CCND1、AURKA、PDGFRB、CDK2、APP、PIK3CG、TOP2A、ERBB2、MMP2、MMP9、KDR、SYK）進行分子對接。配體和受體結合能越低，結合越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，一般認為，結合能小于0表示兩者間可以自發(fā)結合，小于?20.93 kJ/mol說明有較好的結合活性，小于?29.30 kJ/mol表示有強烈的結合活性[20]。如表2所示，10個關鍵活性成分和24個核心蛋白均可以自發(fā)結合。其中木犀草素與16個核心靶點有強烈的結合活性，甲基異茜草素與15個核心靶點有強烈的結合活性，槲皮素與15個核心靶點有強烈的結合活性，鞣花酸與15個核心靶點有強烈的結合活性，芹菜素與14個核心靶點有強烈的結合活性，山柰酚與14個核心靶點有強烈的結合活性，4′,5-二羥基黃酮與13個核心靶點有強烈的結合活性，咖啡酸與6個核心靶點有強烈的結合活性。選取10個關鍵活性成分與各自對應打分最高的核心蛋白可視化，其結合模式見圖7。甲基異茜草素與CDK4通過氫鍵作用和氨基酸殘基VAL A:83結合，通過疏水鍵與PHE A:80結合，結合能為?40.17 kJ/mol；槲皮素與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046結合，結合能為?44.77 kJ/mol；4′,5-二羥基黃酮與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基APS A:1046結合，通過疏水鍵與PHE A:1047結合，結合能為?41.00 kJ/mol；山柰酚與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046結合，通過疏水鍵與PHE A:1047結合，結合能為?46.02 kJ/mol；鞣花酸與CDK4通過氫鍵作用和氨基酸殘基VAL A:83結合，結合能為?39.33 kJ/mol；焦性沒食子酸與CDK2通過氫鍵作用和氨基酸殘基LEU A:83結合，結合能為?28.03 kJ/mol；金圣草黃素與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、ASP A:1046結合，結合能為?43.93 kJ/mol；咖啡酸與TOP2A通過氫鍵作用和氨基酸殘基GLY B:164、MG B:904、ARG B:162、LYS B:378、SER B:149結合，結合能為?40.58 kJ/mol；木犀草素與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、ASP A:1046結合，結合能為?45.19 kJ/mol；芹菜素與KDR通過氫鍵作用和氨基酸殘基ASP A:1046結合，通過疏水鍵與PHE A:1047結合，結合能為?45.19 kJ/mol。

表2 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的關鍵活性成分與核心蛋白結合能

圖7 10個關鍵活性成分與各自對應打分最高的核心靶點分子對接

3 討論

近年來，F(xiàn)D和IBS-D等腸病已成為我國乃至全球范圍內的流行病，嚴重降低了患者生活質量，同時也增加了其經濟負擔，且目前FD和IBS-D的病因和發(fā)病機制尚未完全明確。研究認為FD和IBS-D是性別、年齡、遺傳、免疫、環(huán)境等因素及其相互疊加作用的結果[21-23]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為心理因素、免疫功能異常、內臟高敏感性、腸道菌群失調、消化系統(tǒng)感染、腦腸軸、自主神經功能與其發(fā)病相關[24-25]，現(xiàn)在常用抗生素、吸附劑和調節(jié)腸道內環(huán)境等方式治療FD和IBS-D，短期療效尚可，但停藥后復發(fā)率高且不良反應明顯[26-28]。中醫(yī)學認為FD和IBS-D的發(fā)病的病因主要為外邪侵襲及飲食內傷，同時情志不遂、勞倦及久病體虛等也是重要影響因素[29-30]。腸炎寧顆粒屬于中成藥，具有清熱利濕、止瀉行氣的功效[31]，常用于治療FD和IBS-D等腸性疾病，但其作用機制尚無系統(tǒng)性研究。

本研究運用網絡藥理學和分子對接技術探索腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用機制，以口服生物利用度和類藥性為篩選標準，共得到腸炎寧顆粒活性成分88個，根據(jù)“藥材-成分-靶點”網絡分析篩選出腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的活性成分30個及作用靶點77個，根據(jù)“關鍵活性成分-核心靶點-通路”網絡分析，最終擬合腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的主要活性成分有甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素。槲皮素是一種天然的黃酮醇，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌和抗菌等多種生物活性[32-33]。5-羥色胺作為一種廣泛存在人體中樞神經及胃腸道中的腦腸肽，參與內臟疼痛及胃腸道動力，與FD和IBS-D與密切相關[34]。研究表明，槲皮素可降低結腸5-羥色胺水平，減輕炎癥誘導型腸易激綜合征大鼠的內臟高敏感性及內臟運動反應[35]；槲皮素可通過增強細胞間緊密連接，調節(jié)腸道免疫反應，維系腸道微生態(tài)穩(wěn)定，進而保護腸道黏膜屏障功能[36]。山柰酚是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗癌等作用[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素和山柰酚均可通過調控Ca2+通道，抑制大鼠結腸縱肌的自發(fā)收縮，進而達到解痙作用[39]。鞣花酸是一種廣泛存在于植物中的天然多酚，大量文獻報道鞣花酸在清除自由基、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗過敏、抗衰老以及抗氧化等方面有突出作用[40-41]。鞣花酸對腸道上皮細胞具有顯著的保護作用，能夠促進腸道內容物中營養(yǎng)物質的吸收，防止腸道中的致病菌在腸道上皮細胞中定殖[42]，而且其最大優(yōu)點是其作為親營養(yǎng)素的一種，不影響腸道菌群，并且沒有停藥期[43]。此外，鞣花酸還可通過降低血液炎癥因子表達，進而產生改善小腸上皮細胞炎癥水平[44]。木犀草素是一種具有多種藥理活性的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等活性[45-46]。研究表明，木犀草素在調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和治療慢性炎癥性腸病中起著重要作用，可以減少小腸內容物的體積和重量，從而發(fā)揮止瀉作用[47-48]。在10個主要活性成分中，金毛耳草占2個，地錦草占3個，楓香樹葉占2個，香薷占5個，由此推測金毛耳草、地錦草、楓香樹葉和香薷可能是腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心中藥。

通過構建PPI網絡圖，篩選得出腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點有SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等，體現(xiàn)出了中藥治療的多靶點特點。AKT1作為Akt的亞型，可參與免疫、代謝、生殖等多種生物過程[49]，研究表明，Akt是治療腸易激綜合征的焦點分子，而AKT1作為Akt的同源基因，推測其應與腸易激綜合征有密切聯(lián)系[50-51]。MMP2和MMP9在炎癥因子表達等方面起著重要作用，有研究顯示MMP2和MMP9在腸道局部損傷和腸道炎癥中表達水平顯著升高[52]。

GO功能富集結果顯示腸炎寧顆粒作用于FD和IBS-D的核心靶點影響生物過程主要包括大分子代謝過程的正調控、對含氧化合物的反應、蛋白質磷酸化、動物器官發(fā)育、對有機物質的反應、細胞對有機物質的反應、氮化合物代謝過程的正調控、對內源性刺激的反應、轉移酶活性的反應、對氮化合物的反應等，表明這些生物過程可能在FD和IBS-D的發(fā)生和發(fā)展中體現(xiàn)了重要作用。

KEGG通路富集分析結果顯示，內分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌癥、膀胱癌等通路可能是腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的潛在信號通路。EGFR可介導PI3K/Akt信號通路，在細胞凋亡和細胞發(fā)育中起關鍵作用[53]。PI3K是細胞內磷脂酰肌醇的激酶，激活后的PI3K通過質膜上產生的第2信使磷脂酰肌醇三磷酸與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt結合，從Akt轉移至細胞膜并改變其構象。研究表明，可通過抑制PI3K/Akt信號通路的活化，從而減輕腸道炎癥反應，達到保護腸道黏膜的作用[54]。

分子對接結果顯示，腸炎寧顆粒的10個主要活性成分與24個核心靶點平均結合能為?29.30 kJ/mol，結合能力最高的為KDR與山柰酚，結合能為?46.02 kJ/mol；結合能力最低的為CCND1與山柰酚，結合能為?15.48 kJ/mol，表明腸炎寧顆粒主要活性成分和核心受體蛋白可穩(wěn)定結合，其中KDR、SRC、TOP2A、CDK4、SYK與主要活性成分對接結果較好，提示其可能為腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D關鍵靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，腸炎寧顆粒主要活性成分甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素等可能通過與SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等蛋白相結合，進一步調節(jié)內分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌癥、膀胱癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗等通路，從而增強腸屏障功能、降低內臟敏感、減少炎性反應、調節(jié)腸道菌群等治療FD和IBS-D。從系統(tǒng)生物學角度對腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用機制進行預測結果的分析，符合中醫(yī)運用復方中藥多靶點、多途徑、多系統(tǒng)，整體調理機體、防治疾病的特點，但網絡藥理學研究方法存在一定的局限性，本研究作為一種預測，是在分子機制層面并結合參考文獻進行的預測探討，后期仍需采用實驗驗證的方法進一步驗證理論分析的準確性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 陳興慧, 劉力, 唐旭東, 等. 溫陽止瀉湯治療功能性腹瀉脾腎陽虛證臨床研究 [J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥, 2017, 37(4): 21-24.

[2] Lembo A, Rao S S C, Heimanson Z,. Abdominal pain response to rifaximin in patients with irritable bowel syndrome with diarrhea [J]., 2020, 11(3): e00144.

[3] 曾恩錦, 唐旭東, 王鳳云, 等. 腹瀉型腸易激綜合征和功能性腹瀉辨治探討 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2021, 28(3): 16-18.

[4] 周麗, 徐派的, 張紅星. 腸道菌群與常見功能性胃腸病相關性的研究進展 [J]. 華中科技大學學報: 醫(yī)學版, 2020, 49(6): 756-760.

[5] 鐘成梁, 李新民, 馬斯風, 等. 腸炎寧顆粒治療小兒急性水樣便腹瀉(濕熱證) 的多中心臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2018, 33(8): 1995-2000.

[6] 張蕾, 呂健, 謝雁鳴. 腸炎寧顆粒治療小兒消化不良有效性和安全性的系統(tǒng)評價與Meta分析 [J]. 中國全科醫(yī)學, 2022, 25(14): 1765-1771.

[7] Hopkins A L. Network pharmacology [J]., 2007, 25(10): 1110-1111.

[8] 孟凡翠, 湯立達. 中藥網絡藥理學研究中存在的問題與發(fā)展展望 [J]. 中草藥, 2020, 51(8): 2232-2237.

[9] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網絡藥理學評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[10] Liu C X, Cheng Y Y, Guo D E,. A new concept on quality marker for quality assessment and process control of Chinese medicines [J]., 2017, 9(1): 3-13.

[11] Ru J L, Li P, Wang J N,. TCMSP: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[12] Kim S, Thiessen P A, Bolton E E,. PubChem substance and compound databases [J]., 2016, 44(D1): D1202-D1213.

[13] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules [J]., 2017, 7: 42717.

[14] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: Updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules [J]., 2019, 47(W1): W357-W364.

[15] Stelzer G, Rosen N, Plaschkes I,. The GeneCards suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses [J]., 2016, 54: 1.30.1-1.30.1.30.33.

[16] 孫元芳, 李冰冰, 關永霞, 等. 基于網絡藥理學和分子對接技術探討柴銀顆粒抗冠狀病毒感染潛在分子機制 [J]. 中草藥, 2020, 51(19): 4999-5009.

[17] Szklarczyk D, Morris J H, Cook H,. The STRING database in 2017: Quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible [J]., 2017, 45(D1): D362-D368.

[18] 周稼榮, 劉毅, 陳金鵬, 等. 基于網絡藥理學的夏黃顆粒治療阿片類藥物所致便秘的作用機制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(23): 6015-6022.

[19] Burley S K, Berman H M, Kleywegt G J,. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive [J]., 2017, 1607: 627-641.

[20] 單萍, 姚漢云, 王莉, 等. 基于網絡藥理學和分子對接的蘇合香丸治療缺血性卒中的機制探究 [J]. 藥物評價研究, 2022, 45(7): 1294-1311.

[21] 張夢陽. 毫火針治療腹瀉型腸易激綜合征脾虛濕盛證臨床療效觀察 [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學, 2021.

[22] 吳宇玲. 調腸克敏方治療IBS-D的臨床試驗和期中分析 [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學, 2021.

[23] 史林林, 劉力, 劉智斌, 等. 針藥結合治療功能性腹瀉 [J]. 中醫(yī)學報, 2019, 34(9): 1993-1996.

[24] 劉先秒, 陳佩嬋, 鄭振. 補充益生菌對功能性腹瀉患者焦慮抑郁狀態(tài)的影響 [J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2021, 33(4): 454-457.

[25] Isken O, Langerwisch U, Sch?nherr R,. Functional characterization of bovine viral diarrhea virus nonstructural protein 5A by reverse genetic analysis and live cell imaging [J]., 2014, 88(1): 82-98.

[26] 周丹, 謝欣城, 朱元東. 匹維溴銨、蒙脫石散及雙歧桿菌四聯(lián)活菌片治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床療效 [J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2022, 60(13): 31-33.

[27] 萬麗珠. 針刺聯(lián)合參苓白術湯輔助西藥治療脾虛型功能性腹瀉患者的效果 [J]. 中國民康醫(yī)學, 2022, 34(1): 85-87.

[28] 田帝, 王垂杰. 中西醫(yī)治療功能性腹瀉研究進展 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2019, 21(11): 222-224.

[29] 張思沅. 解郁健脾飲治療肝郁脾虛型腹瀉型腸易激綜合征臨床療效觀察 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學, 2020.

[30] 高瑩, 王垂杰. 功能性腹瀉辨證論治及辨病論治的臨床研究進展 [J]. 按摩與康復醫(yī)學, 2019, 10(5): 57-59.

[31] 吳育強, 吳玉菡, 林果, 等. 腸炎寧顆粒質量標準控制研究 [J]. 中國醫(yī)藥導刊, 2018, 20(10): 619-622.

[32] Lesjak M, Beara I, Simin N,. Antioxidant and anti-inflammatory activities of quercetin and its derivatives [J]., 2018, 40: 68-75.

[33] Kumar V D, Verma P R P, Singh S K. Morphological andantibacterial efficacy of quercetin loaded nanoparticles against food-borne microorganisms [J]., 2016, 66: 638-650.

[34] 李杰. 電針不同穴位組合對功能性腹瀉大鼠空腸腸嗜鉻細胞和5-HT的影響研究 [D]. 咸陽: 陜西中醫(yī)藥大學, 2016.

[35] Qin H Y, Zang K H, Zuo X,. Quercetin attenuates visceral hypersensitivity and 5-hydroxytryptamine availability in postinflammatory irritable bowel syndrome rats: Role of enterochromaffin cells in the colon [J]., 2019, 22(7): 663-671.

[36] 梅華迪, 李袁飛, 馬現(xiàn)永, 等. 槲皮素對動物腸道黏膜屏障功能的影響及其調控機制 [J]. 動物營養(yǎng)學報, 2022, 34(9): 5475-5488.

[37] Imran M, Salehi B, Sharifi-Rad J,. Kaempferol: A key emphasis to its anticancer potential [J]., 2019, 24(12): E2277.

[38] Dabeek W M, Marra M V. Dietary quercetin and kaempferol: Bioavailability and potential cardiovascular-related bioactivity in humans [J]., 2019, 11(10): 2288.

[39] Nigusse T, Zhang L, Wang R,. Flavonoids in a crude extract ofinhibit rat intestinal contraction via blocking Ca2+channels [J]., 2019, 31(7): e13602.

[40] Li J, Wang G L, Hou C,. Punicalagin and ellagic acid from pomegranate peel induce apoptosis and inhibits proliferation in human HepG2 hepatoma cells through targeting mitochondria [J]., 2019, 30(1): 897-912.

[41] Singh B, Singh J P, Kaur A,. Antimicrobial potential of pomegranate peel: A review [J]., 2019, 54(4): 959-965.

[42] Kilic I, Ye?ilo?lu Y, Bayrak Y. Spectroscopic studies on the antioxidant activity of ellagic acid [J]., 2014, 130: 447-452.

[43] Galano A, Francisco Marquez M, Pérez-González A. Ellagic acid: An unusually versatile protector against oxidative stress [J]., 2014, 27(5): 904-918.

[44] 鄭志, 姜林娟, 朱瑜, 等. 鞣花酸對DSS誘導的潰瘍性腸炎小鼠的改善及對COX2/p38/JNK/ERK/IκB-α/NF-κB和iNOS/3-NT/CYP2E1信號通路的作用 [J]. 食品與藥品, 2022, 24(4): 295-300.

[45] 楊悌, 張代玲, 萬啟軍, 等. 木犀草素對結腸癌細胞生長的影響及作用機制研究 [J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志, 2022, 26(12): 84-90.

[46] 胡澤香, 佟雷, 耿艷萌, 等. 木犀草素的藥理活性及其制劑研究進展 [J]. 中醫(yī)臨床研究, 2022, 14(10): 141-145.

[47] Wardill H R, Bowen J M, van Sebille Y Z A,. TLR4-dependent claudin-1 internalization and secretagogue-mediated chloride secretion regulate irinotecan-induced diarrhea [J]., 2016, 15(11): 2767-2779.

[48] Pandit M, Acharya S, Gu Y,. Geranylgeranyl pyrophosphate amplifies Treg differentiation via increased IL-2 expression to ameliorate DSS-induced colitis [J]., 2021, 51(6): 1461-1472.

[49] 郝志曄. 中藥對伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉高危人群的臨床研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學, 2012.

[50] Kuo B, Bhasin M, Jacquart J,. Genomic and clinical effects associated with a relaxation response mind-body intervention in patients with irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease [J]., 2015, 10(4): e0123861.

[51] 盧鑫, 張馨月, 林逸婷, 等. 基于網絡藥理學-分子對接探討四逆散“異病同治”潰瘍性結腸炎和腸易激綜合征的作用機制 [J]. 中藥藥理與臨床, 2022, 38(4): 167-174.

[52] Lucafò M, Pugnetti L, Bramuzzo M,. Long non-coding RNA GAS5 and intestinal MMP2 and MMP9 expression: A translational study in pediatric patients with IBD [J]., 2019, 20(21): E5280.

[53] Pei T M, Meng F Z, Xiao P,. MUC13 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression via EGFR/ PI3K/AKT pathways [J]., 2020, 72(4): 761-773.

[54] 戰(zhàn)晶玉, 袁星星, 王炳予, 等. 連草瀉痢膠囊對潰瘍性結腸炎小鼠模型腸黏膜炎癥因子及TLR4/PI3K/Akt/ mTOR信號通路的影響 [J]. 海南醫(yī)學院學報, 2021, 27(24): 1872-1877.

Mechanism of Changyanning Granules in treatment of functional diarrhea and diarrhea irritable bowel syndrome based on network pharmacology and molecular docking

TIAN Wen-guo1, 2, CHEN Jin-peng2, 3, 4, WANG Chun-fang1, 2, LIU Yi2, 3, 4, GAI Xiao-hong2, 3, 4, LIU Quan-guo5, TIAN Cheng-wang2, 3, 4, CHEN Chang-qing2, 3, 4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Medicine, Tianjin 300462, China 4. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 5. Hainan Huluwa Pharmaceutical Group Co., Ltd., Haikou 570216, China

To explore the mechanism of Changyanning Granules (腸炎寧顆粒) in treatment of functional diarrhea (FD) and diarrhea irritable bowel syndrome (IBS-D) by using network pharmacology and molecular docking.The ingredients of five medicinal materials from Changyanning Granules were searched by TCMSP database and literature. SwissADME platform was used to screen the active ingredients of Changyanning Granules; SwissTargetPrediction platform was used to predict the targets of active ingredients of Changyanning Granules; GeneCards database was used to predict FD and IBS-D targets; Venny 2.1.0 was used to collect the intersection targets of Changyanning Granules in treating FD and IBS-D; STRING database was used to acquire protein-protein interaction (PPI) network and then import into Cytoscape 3.9.1 software to acquire the core targets; OmicsBean database was used to carry out gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on core targets; “Medicinal material-active ingredient-target” and “key active ingredient-core target-pathway” networks were constructed by Cytoscape 3.9.1 software; Schr?dinger-Maestro was used to perform molecular docking between key active components and core targets.Thirty active ingredients for treating FD and IBS-D were screened from Changyanning Granules, among which 10 key active ingredients were rubiadin, quercetin, 4′,5-dihydroxyflavone, kaempferol, ellagic acid, pyrogallol, chrysoeriol, caffeic acid, luteolin and apigenin. 24 core targets were protein kinase B1 (AKT1), epidermal growth factor receptor (EGFR), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, etc. KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved endocrine resistance, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway, prostate cancer and other pathways. Molecular docking indicated that key active ingredients could spontaneously combine with core targets.Changyanning Granules may reduce visceral sensitivity, reduce inflammatory reaction and regulate intestinal flora through multiple components, multiple targets and multiple pathways, so as to treat FD and IBS-D.

Changyanning Granules; functional diarrhea; diarrhea irritable bowel syndrome; network pharmacology; rubiadin; quercetin; 4′,5-dihydroxyflavone; kaempferol; ellagic acid; pyrogallol; chrysoeriol; caffeic acid; luteolin; apigenin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7135 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.017

2022-09-06

中-德中藥與植物藥創(chuàng)新研發(fā)國際合作基地醫(yī)藥國際合作專項（0610-2140NF020630）

田文國，碩士研究生，研究方向為藥物分析與質量標志物。E-mail: tian_wen_guo@163.com

田成旺，博士，研究員，主要從事中藥新藥研發(fā)及中藥質量標準、藥效物質基礎研究。E-mail: tiancw@tjipr.com

陳常青，研究員。E-mail: chencq@tjipr.com

[責任編輯 李亞楠]