程 朗，陳紅玲，徐蓓蓓，武進雨，趙蘇源

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

石榴果實美味可口，含有豐富的營養(yǎng)成分，石榴的根、花、果實、果皮、種子等均可作為藥材[1]，石榴皮具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲等一些藥理作用[2]，石榴皮中含有豐富的化學(xué)成分，主要有鞣質(zhì)、沒食子酸、黃酮類及多糖類物質(zhì)，含有生物堿、甾類、蛋白質(zhì)類化合物等[3]。石榴皮多糖具有生物活性免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、抗菌抗病毒[6]等臨床醫(yī)學(xué)作用，還有降血脂、降血糖[7]、保護肝臟等保健作用。石榴皮中黃酮、多酚類物質(zhì)研究較為廣泛，如研究總黃酮[8]、多酚含量[9]及抗氧化能力等。然而，關(guān)于優(yōu)化多糖提取過程的報道卻很少。其中，安徽懷遠生產(chǎn)的石榴最為出名[10]，每年有大量石榴及相關(guān)制品產(chǎn)出，因此會產(chǎn)出大量的石榴皮渣和石榴種子等副產(chǎn)品，為避免資源浪費，可充分利用被丟棄的石榴皮進行深入研究。采用響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多糖提取工藝，最終能夠有效地提高石榴皮多糖得率，為開發(fā)利用石榴皮提供試驗依據(jù)，提高石榴皮資源的利用價值。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

懷遠石榴，購自安徽懷遠縣當?shù)厮袌觥?/p>

試劑：纖維素酶、果膠酶、葡萄糖標準溶液，上海源葉生物科技有限公司提供；無水乙醇、氫氧化鈉、蒽酮、濃硫酸、均為國產(chǎn)分析純，國藥集團提供。

1.2 試驗儀器

XM-250UVF 型超聲波清洗機，小美超聲儀器昆山有限公司產(chǎn)品；Multiscan Go 型多功能酶標儀，美國Thermo 公司產(chǎn)品；1706 型高速臺式冷凍離心機，德國Hettich 公司產(chǎn)品；JRA-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；BSA124S 型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；pH818型pH 計，?，攦x表產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

稱取石榴皮粉末→稱取纖維素酶、果膠酶→加入蒸餾水→調(diào)節(jié)pH 值→復(fù)合酶解提取→滅酶（80℃，15 min）→超聲輔助處理→離心取上清液（轉(zhuǎn)速5 500 r/min，時間10 min）→4 倍量醇沉→低溫靜置過夜→離心（轉(zhuǎn)速5 500 r/min，時間10 min）→取沉淀得到多糖待測品[16]。

2.2 操作要點

①酶解。稱取1 g 石榴皮粉，加入復(fù)合酶0.3 g（纖維素酶與果膠酶之比為1∶1），根據(jù)不同料液比，加入不同量的蒸餾水，用1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至6，放置在50 ℃水浴中酶解。②滅酶。在80 ℃水浴中滅酶15 min。③超聲。根據(jù)設(shè)定的不同超聲時間、溫度、功率，放至超聲清洗機里進行超聲處理。④測糖。對超聲處理液進行離心處理，取上清液，加入4 倍量體積的80%乙醇溶液，4 ℃下過夜，離心取沉淀，最后用蒸餾水溶解沉淀，采用蒽酮-硫酸法測糖的含量。

2.3 多糖含量的測定

結(jié)合蒽酮-濃硫酸法[11]測定初始提取物中多糖含量。標準曲線的繪制：精密量取1 mg/L 標準葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6 mL 分別置于試管中，加蒸餾水至2 mL，從中移取1 mL 置具塞比色管中，分別加入2 mg/mL 蒽酮-硫酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）1 mL，混勻，沸水浴10 min，冰水浴冷卻至室溫，在波長620 nm 處測吸光度。橫坐標、縱坐標分別為葡萄糖濃度和吸光度，以此繪制標準曲線[12]。得到標準曲線線性回歸方程為Y=0.008 1X+0.082 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7。

多糖得率的測定：取1 mL 經(jīng)稀釋后的多糖溶液，按照上述方法，反應(yīng)完成后，于波長620 nm 下進行吸光度的測定，代入標準曲線方程，計算多糖得率[13]。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.4 單因素試驗設(shè)計

2.4.1 不同料液比對多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，按照不同料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60）加入蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.2 不同酶解時間對多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下按照不同酶解時間（30，60，90，120，150 min）酶解，結(jié)束后在80 ℃滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.3 不同酶解pH 值對多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，按照不同酶解pH 值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）進行調(diào)節(jié)，在50 ℃酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.4 不同酶解溫度對多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，按照不同酶解溫度（30，40，50，60，70 ℃）酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.5 不同超聲溫度對多糖得率的影響

取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著按照不同超聲溫度（40，50，60，70，80 ℃），功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.6 不同超聲時間對多糖得率的影響

取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下按照不同超聲時間（30，40，50，60，70 min）處理。

2.4.7 不同超聲功率對多糖提取率的影響

2.4.8 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響較大的因素，以多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken 設(shè)計原理，通過響應(yīng)面分析法對提取條件進行優(yōu)化設(shè)計。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 不同料液比對多糖得率的影響

由于溶劑的比例會影響溶液的黏度和濃度，從而影響多糖的傳質(zhì)擴散。因此，選取5 個不同水平的料液比進行影響多糖得率的考查。

不同料液比對多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對多糖得率的影響

由圖2 可知，在料液比1∶20～1∶30（g∶mL）時，多糖得率逐步增大。繼續(xù)增加料液比，多糖得率開始逐漸下降，這是由于溶劑過多，不利于多糖的濃縮[14]。并且在后續(xù)乙醇浸提時，乙醇用量也隨之增加，從而導(dǎo)致在離心處理時會浪費更多提取物。因此，料液比最適比例為1∶30（g∶mL）。

3.1.2 不同酶解時間對多糖得率的影響

渥巴錫之仲兄作為人質(zhì)死于阿斯特拉罕，史載明確。具體拘禁之地、死亡之地，未留下史載，但人質(zhì)不是普通的囚犯，將薩賴安置在作為當年阿斯特拉罕衙署所在地的小克里姆林宮、居住在這座白色大樓里，似也不失是一種合理的推測。若如此，小克里姆林宮也是土爾扈特人又一處傷心之地。

由于底物用量固定，酶解時間會有一個最適值。因此，選取5 個不同的酶解時間梯度進行多糖得率的考查。

不同酶解時間對多糖得率的影響見圖3。

圖3 不同酶解時間對多糖得率的影響

由圖3 可知，在30～60 min 內(nèi)，多糖得率逐漸升高。當酶解時間達到1 h 時，多糖得率最大，而隨時間逐漸加長，多糖得率不再有上升的趨勢，這可能是由于在反應(yīng)初期階段，酶與一定量的底物已經(jīng)完全反應(yīng)，后期增加反應(yīng)時間也無法繼續(xù)提高得率。因此，最適酶解時間定為60 min。

3.1.3 不同酶解pH 值對多糖得率的影響

纖維素酶和果膠酶的最適酶解pH 值為中性偏酸。因此，選取5 個不同的酶解pH 值梯度進行影響多糖得率的考查。

不同酶解pH 值對多糖得率的影響見圖4。

圖4 不同酶解pH 值對多糖得率的影響

由圖4 可知，當酶解pH 值到達6 時，多糖得率最高，隨后開始降低，這是由于pH 值已經(jīng)超過上述2 種酶的最適pH 值，造成酶活降低，從而影響多糖得率。因此，酶解最適pH 值為6。

3.1.4 不同酶解溫度對多糖得率影響

酶活性對溫度的要求較高，因此設(shè)置5 個不同的酶解溫度梯度考查其對多糖得率的影響。

不同酶解溫度對多糖得率的影響見圖5。

圖5 不同酶解溫度對多糖得率的影響

由圖5 可知，在溫度為50 ℃時，酶分解能力最佳，多糖得率達到峰值，隨后溫度升高，2 種酶開始逐漸失活，多糖得率也開始降低。因此，最適酶解溫度為50 ℃。

3.1.5 不同超聲時間對多糖得率的影響

超聲時間的長短對提取得率也有一定影響，因此設(shè)置5 個不同的超聲時間梯度考查其對多糖得率的影響。

不同超聲時間對多糖得率的影響見圖6。

圖6 不同超聲時間對多糖得率的影響

由圖6 可知，超聲時間為30～60 min 時，多糖得率數(shù)值隨時間增加而逐漸攀升，當達到60 min 后，多糖得率開始下降，這可能是由于超聲波長時間的機械振動和切割作用[15]，導(dǎo)致其中多糖成分遭到破壞。從而造成多糖得率降低。因此，超聲處理最佳時間為55～65 min。

3.1.6 不同超聲溫度對多糖得率的影響

合適的超聲溫度可以保護樣品中的有效成分免遭破壞。

不同超聲溫度對多糖得率的影響見圖7。

圖7 不同超聲溫度對多糖得率的影響

由圖7 可知，在超聲溫度為40～70 ℃時，多糖得率隨溫度升高而逐漸增大，而多糖是活性物質(zhì)，當溫度進一步升高時，其結(jié)構(gòu)可能會遭到破壞，多糖得率反而降低。因此，最適超聲溫度為65～75 ℃。

3.1.7 不同超聲功率對多糖得率的影響

不同超聲功率輔助提取細胞中多糖物質(zhì)溶出的效果不同。

不同超聲功率對多糖得率的影響見圖8。

圖8 不同超聲功率對多糖得率的影響

由圖8 可知，超聲功率在225 W 以下時，隨著超聲功率增大，石榴皮多糖的提取效果越來越好，當超聲功率超過225 W 后，多糖得率開始逐漸降低，因此，最適超聲功率為200～250 W。

3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

3.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計

根據(jù)對單因素試驗數(shù)據(jù)的分析，選取對石榴皮多糖得率影響較為顯著的3 個榴皮多糖得率影響較為顯著的3 個因素，即超聲時間、超聲溫度、超聲功率，通過響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多糖的最佳提取工藝。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計

3.2.2 響應(yīng)面結(jié)果及其方差分析

響應(yīng)面設(shè)計的試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計的試驗結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合[15]，得到響應(yīng)面擬合方程：

式中：Y——石榴皮總多糖得率，%。

擬合二次多項式模型方差分析見表3。

由表3 可知，此模型（Model）的F 值為23.37，均方差p=0.000 2＜0.01，說明該試驗響應(yīng)面擬合方程回歸模型極為顯著；失擬項p=0.200 8＞0.05，說明失擬度在統(tǒng)計意義上不顯著，即表明模型擬合度較好，綜合以上分析，說明可使用該模型對石榴皮總多糖得率進行分析和預(yù)測。另外，由表3 還可知，模型的一次項A、B、C 及二次項A2、B2、C2的p 值均小于0.01，為極顯著水平，交互項AB 的p 值小于0.05，達到顯著水平，其余項均不顯著。根據(jù)F 值的大小，各因素對石榴皮多糖的影響順序依次為超聲溫度（B）＞超聲時間（A）＞超聲功率（C）。

表3 擬合二次多項式模型方差分析

3.2.3 響應(yīng)面三維圖形分析

根據(jù)試驗結(jié)果，用響應(yīng)面軟件分析得到三維曲面圖及等高線圖。通過觀察曲面的傾斜程度和等高線的形狀分析各因素變量間的交互作用。

超聲時間和超聲溫度對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖9，超聲時間和超聲功率對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖10，超聲溫度和超聲功率對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖11。

圖9 超聲時間和超聲溫度對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

圖10 超聲時間和超聲功率對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

圖11 超聲溫度和超聲功率對多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

由圖9 可知，曲面圖曲線彎曲程度高，說明超聲時間和超聲溫度對響應(yīng)值影響大，等高線形狀呈橢圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說明超聲時間和超聲溫度的交互作用影響顯著。

由圖10 可知，曲面圖曲線彎曲程度較圖9 來說，彎曲程度不是很高，說明超聲時間和超聲功率對響應(yīng)值影響不大，等高線形狀已開始接近圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說明超聲時間和超聲溫度的交互作用影響不顯著。

由圖11 可知，曲面圖曲線彎曲程度較前兩張圖來說，彎曲程度不是很高，說明超聲溫度和超聲功率對響應(yīng)值影響不大，等高線形狀約近于圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說明超聲功率和超聲溫度的交互作用影響不顯著。

3.2.4 模型的優(yōu)化與驗證結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面模型的優(yōu)化，得到了提取石榴皮多糖條件的最佳方案為超聲時間60.87 min，超聲溫度71.61 ℃，超聲功率223.98 W，在此條件下，得到理想的最佳多糖得率為7.618%?？紤]到實際操作條件的可行性，對試驗最佳方案進行如下調(diào)整：超聲時間為61 min，超聲溫度為72 ℃，超聲功率為225 W。根據(jù)調(diào)整后方案進行驗證試驗，設(shè)置3 組平行，得到石榴皮多糖得率平均值為7.53%，與理論值7.618%相比，相對誤差為0.088%，結(jié)果與理論值非常接近，說明模型擬合效果較好，結(jié)果可靠性較高。

4 結(jié)論

采用纖維素酶和果膠酶協(xié)同處理石榴皮粉末樣品進行多糖提取，可以有效地使植物細胞分離、破裂，從而提高石榴皮多糖得率。同時，結(jié)合超聲波加速提取技術(shù)，并運用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到優(yōu)化后的提取工藝條件為料液比1∶30（g∶mL），pH 值6，酶解時間1 h，酶解溫度50 ℃，超聲時間61 min，超聲溫度72 ℃，超聲功率225 W。在此提取條件下，石榴皮總多糖得率為7.53%。與優(yōu)化前的單因素試驗結(jié)果相比，石榴皮多糖得率明顯得到提高。與傳統(tǒng)單一的提取方法相比，此優(yōu)化方法實用可靠，可用于石榴皮多糖提取。