郝彩琴 李 軍 陳海燕 冷曉紅

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科技學(xué)院，寧夏銀川 750002

柴胡為大宗中藥材，收載于2020 版《中華人民共和國藥典》中的柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[1]。柴胡的入藥部位是根，主要含柴胡皂苷類、黃酮類、植物甾醇，以及少量揮發(fā)油、多糖等有效成分，主要的藥理活性為抗炎抗菌、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、增強(qiáng)免疫力、保肝利膽及抗腫瘤等[2]。柴胡地上部分也含有黃酮類、少量皂苷類、木脂素類、香豆素類等成分[3-4]，有研究表明，柴胡地上部分的主要成分是黃酮類化合物，且含量高于地下部分[5-7]。黃酮類化合物是中藥的有效成分之一，其具有抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗腫瘤、降糖等多種生物活性[8-11]。柴胡藥材在寧夏六盤山地區(qū)已基本形成規(guī)?；N植，柴胡地上部分是中藥材柴胡的非藥用部位，占柴胡整個植物干重的70%～85%，目前大部分被當(dāng)成廢料而丟棄從而造成極其嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[12]。因此，本研究采用4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并對其抑菌活性進(jìn)行研究，為充分利用資源、擴(kuò)大藥用部位提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TYS-400A 型粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SIB-Ⅲ型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析公司）；EL204 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器）；DHG-9123A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SHY-2A 型水浴恒溫振蕩器（常州國宇制造）；YJ-875 型超凈工作臺（蘇州安泰）；YXQLS-50S 型立式壓力蒸汽滅菌器 （上海博訊實(shí)業(yè)公司）；96 孔培養(yǎng)板（康寧3599 型）。

1.2 試藥

對照品蘆丁來自中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純，無水乙醇購自西安化學(xué)試劑廠，批號：20181028；氫氧化鈉購自煙臺市雙雙化工有限公司，批號：20181218；亞硝酸鈉購自上海廣諾化學(xué)儀器有限公司，批號：20140616；硝酸鋁購自上海廣諾化學(xué)儀器有限公司，批號：20141111；食用乙醇；蛋白胨和牛肉膏均購自北京奧博星公司；柴胡地上部分（2016年9月采自寧夏隆德縣柴胡種植基地，經(jīng)高級農(nóng)藝師張守宗老師鑒定為北柴胡地上部分，符合2020 版中國藥典標(biāo)準(zhǔn)[1]），低溫晾干，粉碎過2 號藥典篩。

1.3 菌株

大腸埃希菌（ATCC25922），鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），表皮葡萄球菌（ATCC12228），福氏志賀菌（CMC C51572）均為寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)中心饋贈，合軸馬拉色菌（CBS9593）、球形馬拉色菌（CBS9597）、糠秕馬拉色菌（CBS1878）、鈍形馬拉色菌（CBS7876）均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 對照溶液的制備 精密稱取對照品蘆丁10.5 mg，以30%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 ml 的容量瓶中定容至刻度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.210 mg/ml，放4℃冰箱備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 對文獻(xiàn)[13-14]中的方法略有改動，精密吸取蘆丁對照品溶液0、0.4、0.8、1.4、2.0 和2.6 ml 分別置于10 ml 容量瓶，用移液槍加入5%的NaNO2溶液0.4 ml，靜置6 min，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 ml，靜置6 min，然后再加入4%的NaOH溶液4 ml，用30%的乙醇定容至刻度，靜置10 min，以試劑空白為參比，用1 cm 比色皿測定510 nm 波長處的吸光度，并以蘆丁濃度（C，mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制作如圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=11.69×C+0.000 7，R2=1。在0～0.054 6 mg/ml 的范圍內(nèi)蘆丁乙醇溶液線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 總黃酮的提取

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選定55%乙醇為溶劑[15]，靜態(tài)回流方法進(jìn)行提取，以料液比（A）、浸泡時間（B）、提取次數(shù)（C）、提取時間（D）為4 個考察因素，每個因素分3 個水平，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定柴胡地上部分總黃酮的最佳提取工藝。因素、水平見表1。

表1 柴胡地上部分黃酮提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

準(zhǔn)確稱取柴胡地上部分粗粉1.00 g，根據(jù)表1正交設(shè)計(jì)工藝條件進(jìn)行提取，減壓抽濾，濾液減壓低溫濃縮成干浸膏，然后用30%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至50 ml 容量瓶中并定容至刻度，搖勻，每個條件平行做3 次。

2.3 總黃酮提取率測定

精密吸取按表1正交工藝設(shè)計(jì)條件提取的提取液適量，至10 ml 容量瓶中，按照“2.1.2”方法操作，依次加入顯色劑，最后用30%乙醇定容，搖勻，測定吸光度，將每個條件3 次提取液測得的吸光度計(jì)算平均吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算樣品溶液中總黃酮濃度C，然后代入以下公式計(jì)算總黃酮的提取率（%）：總黃酮提取率（%）=（C×N×V×10-3/M）×100。C：黃酮的質(zhì)量濃度（mg/ml）；N：稀釋倍數(shù)；M：提取用柴胡地上部分的質(zhì)量（g），V：粗提液的定容體積（ml）。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可以看出正交試驗(yàn)中，影響柴胡地上部分總黃酮提取率的主要因素是提取次數(shù)（C），其次是料液比（A），最后是提取時間（D）和浸泡時間（B），對于A 因素，由于k2＞k3＞k1，所以A 因素取第二水平，同理，B 因素取第一水平，C 因素取第三水平，D 因素取第一水平。表3方差分析表明，料液比、浸泡時間、提取次數(shù)、提取時間各水平間均無明顯差異。因此，通過本試驗(yàn)可以得出，用55%濃度乙醇作為提取溶劑選用靜態(tài)回流提取法提取寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的最佳提取工藝為A2B1C3D1，即藥材用量和溶劑用量之比為1∶10，浸泡適宜時間為60 min，提取3 次，每次提取72 min，該工藝條件下總黃酮的提取率最好。

表2 柴胡地上部分總黃酮提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 精密稱取柴胡地上部分粗粉1.00 g，共3 份，根據(jù)最佳工藝提取條件平行操作，各提取液低溫減壓濃縮成干浸膏，30%乙醇溶解、轉(zhuǎn)移并定容至50 ml 容量瓶中，取適量于10 ml 容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法測定3 份柴胡地上部分總黃酮提取率，結(jié)果表明，驗(yàn)證試驗(yàn)的3 次平行操作中，總黃酮平均提取率為2.702%，且RSD 為1.227%，表明該工藝所選結(jié)果是合理、可行的。

2.5 抑菌活性測定及結(jié)果

2.5.1 抑菌活性測定 本研究通過測定最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）考察柴胡地上部分提取物的抑菌活性，具體過程利用96 孔板參考文獻(xiàn)[16-17]方法并略有改動，向96 孔板1～9 號孔，每孔加入空白營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基90 μl，再向每排的第一孔中加入質(zhì)量濃度為500 mg/ml 的柴胡地上部分提取物，然后對樣品液依次進(jìn)行2 倍稀釋后向每孔中加入菌落濃度為1.0×106CFU/L 的不同受試菌懸液20 μl，此時每孔樣品液最終質(zhì)量濃度依次為： 250、125、62.5、31.25、15.63、7.815、3.908、1.954、0.977 mg/ml，并在10 號孔加入180 μl 培養(yǎng)基和20 μl 菌懸液作陰性對照，11 號孔加入200 μl 培養(yǎng)基作空白對照，12 號孔加入100 μl 培養(yǎng)基和100 μl 藥液作空白對照，然后置37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)16 h 后取出觀察。如小孔內(nèi)澄清即為完全抑制細(xì)菌生長，而澄清小孔中所對應(yīng)的最低藥物濃度即待測樣品對該菌的最低抑菌濃度。氨芐青霉素鈉（細(xì)菌的陽性對照）和特比萘酚（真菌的陽性對照）陽性對照的做法同樣品，但初始濃度為0.050 mg/ml。每個樣品重復(fù)3 次。

2.5.2 抑菌活性測定結(jié)果 利用微量稀釋96 孔板，測定柴胡地上部分提取物對4 個細(xì)菌和4 個真菌的最小抑菌濃度，柴胡地上部分提取物對供試的4 種細(xì)菌和4 種真菌都有一定的抑菌活性，但與陽性對照相比較總體的抑菌活性較低（表4）。

表4 柴胡地上部分提取物的最小抑菌濃度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)過程中正交條件的乙醇濃度、提取方法等都是通過單因素實(shí)驗(yàn)而確定，具體見參考文獻(xiàn)[15]，為了使提取工藝更接近工業(yè)化生產(chǎn)，本研究在選擇料液比時最高比例設(shè)為1∶10，提取次數(shù)最多選擇提取3次。單宇等[18]對北柴胡莖葉總黃酮最佳提取工藝的研究表明，75%乙醇10 倍量60℃提取2 h，確定提取級數(shù)為2 次，總黃酮提取率達(dá)2.871%；馬文兵等[19]對北柴胡莖葉總黃酮的最佳提取工藝為，用70%的乙醇在80℃下，按料液比1∶30，回流提取2 h，其總黃酮提取率為3.40%。本研究最佳提取工藝是，用55%的乙醇作溶劑，按料液比1∶10，浸泡時間60 min，加熱回流提取3 次，每次提取72 min，提取率是2.70%，與馬文兵等[19]、單宇等[18]的研究結(jié)果接近，但文獻(xiàn)用70%、75%乙醇作溶劑進(jìn)行提取，使提取液色素含量較多，影響總黃酮含量的紫外測定，而本實(shí)驗(yàn)在研究過程中采用55%乙醇濃度作為提取溶劑，所得提取液色素較少，同時可以節(jié)約溶劑乙醇的用量，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在本研究最佳工藝提取下，柴胡地上部分總黃酮的抑菌活性研究表明，柴胡地上部分總黃酮具有一定的抑菌作用，這與王紅燕等[20]研究顯示柴胡地上部分不同醇提物抑菌活性的初步研究結(jié)果基本一致，與陽性對照結(jié)果相比，柴胡地上部分總黃酮對四種供試的馬拉色菌抑制作用更強(qiáng)。本研究僅對其粗提物的抑菌活性進(jìn)行了測定，對于純化后總黃酮的抑菌活性及抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，本研究在提取之前對藥材進(jìn)行預(yù)浸泡，使溶劑更好地?cái)U(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)容，更有利于有效成分的提取和溶出，同時，可以節(jié)約提取時間。