江舟，姚新成

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南昆明 650500）

環(huán)烯醚萜作為重要成分存在于眾多中草藥中，具有降糖、抗炎以及抗腫瘤等藥理活性。環(huán)烯醚萜由多種化合物結(jié)構(gòu)組成，其作用機(jī)制以及生物活性也各不相同。一般環(huán)烯醚萜類化合物骨架有三大類，分別為環(huán)烯醚萜苷類、裂環(huán)烯醚苷類、環(huán)烯醚萜乙縮醛酯類，所以環(huán)烯醚萜基本骨架通過羥基化、環(huán)氧化以及通過莽草酸途經(jīng)可獲取芳香酸酯化，在芳香酸酯化驅(qū)動下形成不同形式的環(huán)烯醚萜[1]。環(huán)烯醚萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣，植物環(huán)烯醚萜類化合物則會受其多樣性結(jié)構(gòu)影響，其自身涵蓋的生物活性相對廣泛。當(dāng)前國內(nèi)外鮮少探究環(huán)烯醚萜類成分生物合成途徑及其關(guān)鍵酶基因，對此，從多方研究歸納環(huán)烯醚萜類成分，了解其生物合成途徑和關(guān)鍵酶基因，旨在預(yù)測未知活性的其他環(huán)烯醚萜類化合物，為研究開發(fā)高活性新型環(huán)烯醚萜類藥物奠定基礎(chǔ)。

1 環(huán)烯醚萜類成分概述

環(huán)烯醚萜醇涵蓋環(huán)狀烯醚與醇羥基，更是環(huán)烯醚萜類化合物母核。其中醇羥基是一種性質(zhì)活潑以及易與糖相結(jié)合的半縮醛羥基，所以，基本以苷形式組成環(huán)烯醚萜并存于天然環(huán)境內(nèi)，該物質(zhì)中占據(jù)較大比例的組分為D-葡萄糖苷。相關(guān)實驗證實，C4-CH3經(jīng)氧化易分解為-COOH、-CH2OH、-COOR 等成分，若分解為-COOH，通過脫羧后則演變?yōu)榻到庑问降沫h(huán)烯醚萜類化合物。同時，C8-CH3也易氧化分解為-CH2OH 與-COOH 等。此外，部分處于分子中的環(huán)戊烷以不同形式氧化狀態(tài)呈現(xiàn)，而C5-6、C6-7、C8-9三者間會轉(zhuǎn)化成雙鍵，C6-7為環(huán)酮結(jié)構(gòu)，CC7-C8則會形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)[2]。具體有以下3 類：

1.1 環(huán)烯醚萜苷類

此類骨架組成本質(zhì)為環(huán)烯醚萜類，唯一不同的參與此骨架的還有裂環(huán)環(huán)烯醚萜。環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)單元存在于環(huán)烯醚萜苷類母核中，與此同時，五元環(huán)與單一環(huán)烯醚環(huán)生成環(huán)烯醚萜苷類化合物。存在于可取代基五元環(huán)的C6、7、8，C6-C7，C8-C9，C9-C10可作為單雙鍵。C1位上則具有甲氧基和羥基等取代基，與此同時，C1為半縮醛羥基形式，經(jīng)常與D-葡萄糖組成苷鍵，該結(jié)構(gòu)體系中，葡萄糖C6上羥基及其他基團(tuán)多以酯基形式存在。在深入研究環(huán)烯醚萜類化合物中會持續(xù)發(fā)現(xiàn)全新的環(huán)烯醚萜類結(jié)構(gòu)，例如在抱莖獐牙菜中可分離獲取到senburiside Ⅲ/Ⅳ。環(huán)氧醚式環(huán)烯醚萜型化合物是各種植物中廣泛存在的環(huán)烯醚萜類化合物類型，其母核中的C6-7或C7-8間會涵蓋環(huán)氧醚結(jié)構(gòu)（β 型）。C4位或C7-8為環(huán)氧醚結(jié)構(gòu)時，無任何取代基，C6位上與β 型羥基相連，并時常與糖類組成苷鍵，其他基團(tuán)經(jīng)常會取代糖基上羥基氫。

1.2 裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類

裂環(huán)式環(huán)烯醚萜型化合物形成與環(huán)烯醚萜環(huán)戊烷C7-C8共價鍵發(fā)生斷裂現(xiàn)象有關(guān)，分子C8-C9以雙鍵形式存在。通常C7位為酯基時，C10位經(jīng)常為羥基。與此同時，C7位羥基與C11位羥基組建為環(huán)狀內(nèi)酯結(jié)構(gòu)六元環(huán)。近年來，科研人員發(fā)現(xiàn)裂環(huán)環(huán)烯醚萜存在于多種植物中，如忍冬科金銀花藥用植物則涵蓋較多的裂環(huán)環(huán)烯醚萜。在金銀花水提取物中順利分離出近7 種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物。女貞子藥用植物具有滋補(bǔ)肝腎、明目、烏發(fā)等功效，該植物水溶性化學(xué)成分中重要活性成分之一則為裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物。選取女貞子作為研究對象，從其70%乙醇提取物中通過分類獲取新型裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物，經(jīng)鑒定得知，該新型裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物為6′-O-肉桂?；?8-表-金吉苷酸。

1.3 環(huán)烯醚萜乙縮醛酯類

環(huán)烯醚萜苷十分容易水解，會形成半縮醛結(jié)構(gòu)苷元，其化學(xué)性質(zhì)相對活潑且較易聚合，結(jié)晶苷元獲取難度大。相關(guān)研究指出，蜘蛛香是一種含環(huán)烯醚萜類成分較高的敗醬科纈草屬蜘蛛香，涵蓋單烯型環(huán)烯醚萜與雙烯型環(huán)烯醚萜成分，纈草中的纈草環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用。與此同時，纈草醚酯為沒有糖結(jié)構(gòu)的單萜環(huán)烯醚萜成分，受熱不穩(wěn)定，尤其在堿性和酸性條件下會出現(xiàn)降解。國外科研人員早在1966 年提取纈草植物并從中順利分離出環(huán)烯醚萜化合物，該物質(zhì)也稱為纈草三酯。

在研究中，從螞蟻分泌腺中順利分離出環(huán)烯醚萜，然而眾多研究證實，此類化合物多存在于植物中，如龍膽科、山茱萸科、唇形科、馬鞭科、木樨科、茜草科、玄參科等，其生物活性相對廣泛。例如茜草科巴戟天中涵蓋的水晶蘭苷的抗炎鎮(zhèn)痛作用相對顯著，與巴戟天祛風(fēng)濕作用有著緊密聯(lián)系；山茱萸科中的山茱萸環(huán)烯醚萜有利于防治因糖尿病引發(fā)的腎功能結(jié)構(gòu)改變、心臟病變以及血管并發(fā)癥等多種并發(fā)癥。此外，獐牙菜與龍膽科龍膽屬重要成分為環(huán)烯醚萜，具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗膽堿及保肝等作用，已開發(fā)至護(hù)胃藥與抗肝炎藥物。環(huán)烯醚萜是玄參科胡黃連屬植物中不可缺少的化學(xué)成分，存在于胡黃中環(huán)烯醚萜類成分約有20 種。胡黃連苷-Ⅰ/Ⅱ為胡黃連環(huán)烯醚萜苷類成分關(guān)鍵活性物質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，玄參中涵蓋的桃葉珊瑚甙具有抗病毒、降血糖、抑制腫瘤生長、抗炎止痛及降血壓等作用。

2 環(huán)烯醚萜類成分生物合成途徑

經(jīng)實驗得知，萜類化合物合成分為IPP 與DMAPP生成的中間體生成、催化IPP 與DMAPP 生成各種類型中間體或萜類的萜類化合物合成、修飾復(fù)雜萜類終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的后期修飾期三大階段[4]。環(huán)烯醚萜屬于相對特殊單萜類成分，其合成途徑與上述3 大階段較為相似。

2.1 中間體生成

研究領(lǐng)域共同認(rèn)證的環(huán)烯醚萜中間體共有以下兩條生成途徑：（1）甲羥戊酸途徑。細(xì)胞質(zhì)負(fù)責(zé)該途徑，即3 分子乙酰與酶A 相互作用縮合為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 并由此作為開端，參與其中的酶共有6個。（2）甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑。質(zhì)體負(fù)責(zé)該途徑，丙酮酸與由甘油醛-3-磷酸的相互縮合為開端，共有8 個酶發(fā)揮作用。此條途徑也有6 個酶參與成功結(jié)晶并鑒定其結(jié)構(gòu)。上述兩個途徑最后均合成IPP 及其異構(gòu)體體二甲基丙烯基焦磷DMAPP。與此同時，該兩條途徑位于細(xì)胞不同位置且具有完全不同的起始物，然而二者卻有相同產(chǎn)物，且存在DMAPP 與IPP 交互在質(zhì)體與胞質(zhì)中交互使用現(xiàn)象。相關(guān)研究者指出，經(jīng)甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑合成的DMAPP 與IPP 參與四萜、雙萜及單萜等生物合成。雖然自然界中萜類化合物有眾多種類且結(jié)構(gòu)多元，但其基本單位均為異戊二烯，DMAPP 或IPP 是其共同前體。

2.2 環(huán)烯醚萜骨架構(gòu)成

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，香葉基焦磷酸（GPP）的形成與DMAPP 與IPP 有關(guān)，此兩種物質(zhì)通過香葉基焦磷酸酶進(jìn)行催化并順利催化為GPP。GPP 是不同萜類重要分解分界點，各種萜類通過GPP 沿不同代謝方向傳遞至生物堿、單萜、二/三萜等合成途徑。GPP 在環(huán)烯醚萜合成中會先篩去磷酸基團(tuán)，提煉出香葉醇。之后在香葉醇-10-羥化酶作用下，在C10位置上進(jìn)行羥基化后再順利生成10-羥基-香葉醇。緊接著CI 與C10位置通過氧化成為10-氧香葉醛，上述一系列均為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。10-氧香葉醛需要通過環(huán)化這一重要步驟成為環(huán)烯醚萜的骨架琉蟻二醛，直至2012 年才發(fā)現(xiàn)作用于此步驟的環(huán)烯醚萜合酶。

2.3 后修飾階段

相關(guān)研究表明[5]，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)以不同特征和形式存在于眾多植物內(nèi)，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是修飾酶參與萜類生物合成過程。如?；?、羥基化、糖基化、環(huán)氧化等修飾結(jié)構(gòu)與小分子結(jié)合后修飾多種反應(yīng)。環(huán)烯醚萜類化合物基本骨架組成為裂環(huán)環(huán)烯醚萜以及開裂環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜。以下兩種途徑是環(huán)烯醚萜類成分組成：其一，從伊蟻二醛經(jīng)去氧番木鱉酸和馬錢素（番木鱉苷），由此生成裂環(huán)環(huán)烯醚萜以及復(fù)雜吲哚生物堿；例如龍膽與獐牙菜苦苷是獐牙菜、龍膽科龍膽等植物不可缺少的組成部分，裂環(huán)烯醚萜類合成是長春花等多種類型吲哚生物堿產(chǎn)生途徑。獐牙菜/龍膽苦苷、吲哚生物堿物質(zhì)重要中間體為裂環(huán)番木鱉苷。與環(huán)烯醚萜相比，裂環(huán)環(huán)烯醚萜具有深入且相對廣泛的生物合成途徑。與長春花吲哚生物堿生物合成途徑有關(guān)研究已長達(dá)40 年，在研究中獲得較多合成途徑。因此，研究裂環(huán)番木鱉苷等不同形成生物合成途徑有利于解析其他植物裂環(huán)環(huán)烯醚萜生物合成途徑。

3 環(huán)烯醚萜類成分關(guān)鍵酶

3.1 IS 基因環(huán)烯醚萜合酶

環(huán)烯醚萜生物合成的關(guān)鍵酶之一為IS，即環(huán)烯醚萜合酶，該酶列屬于孕酮5β-還原酶（P5βR）之中，更是超聯(lián)脫氫酶/還原酶超基因家族重要組成。線性單萜10-Ioxogerania 是IS 基因環(huán)烯醚萜合酶底物，在長春花中發(fā)現(xiàn)該酶并對其鑒定。該酶不同于底物為香葉二磷酸并生成為陽離子中間產(chǎn)物單萜環(huán)化酶，單萜因全新的環(huán)烯醚萜苷合成酶在兩個重要程序中得以環(huán)化，前驅(qū)10-氧香葉醛中的烯醇中間體從經(jīng)典還原反應(yīng)獲得，此物質(zhì)的環(huán)化效果基本從Diels-Alder 環(huán)加成反應(yīng)產(chǎn)生。在深入研究和反復(fù)試驗中發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜合酶，在試驗中運(yùn)用生物技術(shù)利用環(huán)烯醚萜酶順利合成環(huán)烯醚萜類化合物，為此物質(zhì)賦予生物活性，更具備相關(guān)功能。解析環(huán)烯醚萜合酶及其復(fù)合體結(jié)構(gòu)時，也深入研究IS 催化機(jī)理，獲得順式與反式催化機(jī)制。此外，選取長春花作為研究物質(zhì)，采取純化、克隆、表達(dá)、結(jié)晶等方式，深入分析環(huán)烯醚萜合酶載酯蛋白與NADP+/8-oxogeranial 二者結(jié)合后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)活性中心中并未存在SDR 中傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)保守區(qū)Tyr/Lys/Ser。其中Tyrl78 涵蓋有利于研究的催化功能且IS 底物相對專一，上述研究從不同層面揭示IS 催化機(jī)制。

3.2 SLS 基因

1993 年，Vetter等[6]發(fā)現(xiàn)SLS 基因，該基因?qū)Ψ诀M苷環(huán)戊烯環(huán)氧化裂解發(fā)揮催化作用，使其分裂為開聯(lián)番木鱉苷（RG）。該物質(zhì)為細(xì)胞色素P450 重要組成。通過喂飼實驗得知，液泡中會產(chǎn)生該反應(yīng)，在長春花懸浮細(xì)胞中進(jìn)行分離并分析其功能發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)為細(xì)胞膜有關(guān)的且依賴于NADPH 與氧氣的細(xì)胞色素P450 單加氧酶。SLS 基因在此過程中發(fā)揮催化作用，并由此合成開聯(lián)番木鱉苷的酶。長春花（）是夾竹桃科（Apocynaceae）長春花屬植物，目前，人們從長春花全草中分離了100 多種萜類吲哚生物堿（Terpenoid indolealkaloids，TIAs）。多數(shù)TIAs 由于具有生物學(xué)活性在現(xiàn)代醫(yī)藥得到廣泛應(yīng)用，例如抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿可用于治療何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細(xì)胞型白血病、絨毛上皮細(xì)胞癌及其他癌癥，其硫酸鹽已廣泛用于臨床，是目前應(yīng)用最廣的天然植物抗腫瘤藥物NADPH 與分子氧是SLS 在反應(yīng)中作用支撐，細(xì)胞色素P450 抑制劑與一氧化碳會阻斷反應(yīng)，說明細(xì)胞色素P450 調(diào)節(jié)該反應(yīng)。通過原位雜交試驗與免疫組織化學(xué)可知，長春花葉片的表皮細(xì)胞中存在SLS，但僅能從喜樹、長春花、滇龍膽中順利克隆到SLS 基因。其中喜樹中SLS 基因組成編碼為524 個氨基酸、1575bp 相對完整的開放閱讀框以及cDNA 長度1706P。

3.3 G10H 基因香葉醇

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)烯醚萜類化合物生物合成中關(guān)鍵因子為G10H 基因香葉醇，其中番木鱉苷生成首個環(huán)節(jié)都體現(xiàn)該反應(yīng)。在裂環(huán)番木鱉苷生成中，G10H 所發(fā)揮作用為調(diào)控，故而G10H 基因香葉醇為烯醚萜類合成物第一次限速程序。同時，G10H 來自通過膜結(jié)合途徑且高度依賴NADPH 細(xì)胞素P450 單加氧酶范圍中的CYP768 成員。同時，G10H 自身涵蓋能力相對薄弱，通過對3-羥基柚皮素進(jìn)行催化，最后生成圣草酚活性。所以部分藥用植物黃酮類合成中有G10H 基因香葉醇參與其中。從長春花中首次提煉和純化出G10H 基因，一般植物體中涵蓋不同類型的P450 基因，所以難以克隆出G10H 基因。2001 年首次從長春花中克隆出第1 個基因cDNA。目前，分別從川西獐牙菜、長春花、黑紫獐牙菜、秦艽等植物中克隆出G10H 酶編碼基因，由此說明，川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷與長春花中的堿等物質(zhì)合成中G1OH 發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。G10H 基因的開放閱讀框為1488-1491，cDAN 全長1578-1637bp，其編碼為495-496 個氨基酸。相關(guān)研究得出，存在于不同植物中的G10H 無跨膜及其部分跨膜結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量各有不同。如在川西獐牙菜中研究胚性細(xì)胞愈傷組織表達(dá)，從中得知，G10H 對裂環(huán)烯醚萜發(fā)揮上調(diào)作用。如在秦艽植物中，G10H 基因主要在其花與根中有所表達(dá)，在秦艽莖與葉中總表達(dá)量則相對偏低。

4 結(jié)語

大量研究表明，環(huán)烯醚萜類構(gòu)效關(guān)系相對復(fù)雜，藥理活性多，廣泛存儲于自然界中，提取工藝相對簡單，可經(jīng)化學(xué)合成方式獲取該原料。通過研究環(huán)烯醚萜類成分生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因，可為借助基因工程方式體外改造酶及篩選獲取高質(zhì)高效生產(chǎn)環(huán)烯醚萜類工程奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域僅從喜樹、長春花、獐牙菜等少數(shù)植物中深入研究涵蓋的環(huán)烯醚萜類生物合成，其相關(guān)功能基因研究也受到廣泛重視，然而研究深入性不足，需結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與基因組學(xué)深入研究上述關(guān)鍵酶基因克隆、功能、次生代謝途徑調(diào)控與影響，才能更好地推斷環(huán)烯醚萜類主要活性與作用特征，為臨床新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。