徐希，張振聲，許傳亮

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，上海 200433

膀胱癌（bladder cancer，BC）是世界范圍內(nèi)常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2019年BC在美國男性惡性腫瘤患者中占6%，其發(fā)病率居全部惡性腫瘤第4位[1]。超過70%的BC患者表現(xiàn)為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC），其余為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），兩者的術(shù)后復(fù)發(fā)率均超過20%[2]。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET）于2004年首次被發(fā)現(xiàn)，是一種主要由中性粒細(xì)胞釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞可通過釋放NET影響腫瘤生長，這種機(jī)制在BC中很常見[4]。本文對NET的構(gòu)成和功能及其對BC作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NET的構(gòu)成和功能

中性粒細(xì)胞是宿主對細(xì)菌和真菌感染的第一道免疫防御屏障，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。中性粒細(xì)胞受到外界刺激幾分鐘后，逐漸出現(xiàn)核小葉減少、染色質(zhì)聚集、核膜內(nèi)外層分離、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒解體。然后核膜分裂成小泡，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)融合，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜破裂，釋放NET[6]。NET的釋放過程被稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)凋零（neutrophil extracellular trap apoptosis，NETosis），可由多種藥物和促炎介質(zhì)誘導(dǎo)[7]，其中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8是人類中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis最顯著的誘導(dǎo)趨化劑[8-9]。

NET由DNA組成松散骨架，其成分還包括基質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓樣過氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等[10]。NET可能通過激活淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞導(dǎo)致組織損傷、自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病[11]。除了作為一種防御機(jī)制來捕獲和殺死原核微生物，NET還參與了多種人類疾病的發(fā)生過程，包括血栓形成、痛風(fēng)和膽結(jié)石等[12]。

2 NET對腫瘤的作用

NET被證明具有抗腫瘤和促腫瘤兩種相互對立的作用[13]。NET的重要成分MPO和NE釋放并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可使磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）的活躍程度發(fā)生改變，影響腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，高濃度的MPO和NE對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，減少其釋放會(huì)導(dǎo)致NET功能由抗腫瘤向促腫瘤轉(zhuǎn)化[14]。在小鼠惡性腫瘤模型中，多種實(shí)驗(yàn)方法已證實(shí)NET的形成在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、喚醒休眠的腫瘤細(xì)胞和介導(dǎo)免疫抑制方面發(fā)揮作用[15-16]。一方面，在腫瘤微環(huán)境中NET會(huì)產(chǎn)生大量趨化因子，保護(hù)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞免受免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響[17]；另一方面，NET具有很強(qiáng)的黏附性，可以吸附病原體和血小板，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中提供了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附的血管內(nèi)網(wǎng)絡(luò)[18]。

NET促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移主要通過5個(gè)步驟來完成[19]：①NET降解細(xì)胞外基質(zhì)，如MMP9和CG可以降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤轉(zhuǎn)移做準(zhǔn)備[20]。②NET捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC），使這些細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位或轉(zhuǎn)移部位脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，從而逃避免疫攻擊[21]。③NET促進(jìn)免疫逃逸，如NET可以在免疫細(xì)胞和CTC之間形成屏障，NET及其溶解產(chǎn)物也能夠抑制體內(nèi)免疫細(xì)胞的正常功能，從而協(xié)助CTC逃避免疫識(shí)別[22]。④NET可通過調(diào)節(jié)鈣黏蛋白破壞血管壁完整性，使腫瘤細(xì)胞外溢，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[23]。⑤NET可促進(jìn)血管生成，NET中的各種組件如MMP9、CG和NE可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[24]。

3 NET在BC治療中的作用

BC被認(rèn)為是高度免疫原性惡性腫瘤，中性粒細(xì)胞對免疫系統(tǒng)具有抑制和激活雙重作用，反映宿主的炎癥和免疫反應(yīng)[25]。Nie等[26]研究認(rèn)為，調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（regulatory cell death，RCD）在BC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，RCD通路受到各種內(nèi)外環(huán)境的刺激，在各種信號分子的控制下誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或允許細(xì)胞存活，從而影響腫瘤進(jìn)展或治療效果，其中NET的作用尤其重要。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，BC微環(huán)境中存在大量的中性粒細(xì)胞浸潤，高濃度的NET浸潤與不良結(jié)局相關(guān)。de Andrea等[28]將MPO、瓜氨酸化組蛋白、IL-8蛋白和CD8+T細(xì)胞共染色，采用多重免疫熒光法識(shí)別人類腫瘤組織中的NET，通過此方法發(fā)現(xiàn)BC中NET密度與IL-8蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果均說明NET可能在BC進(jìn)展和治療方面發(fā)揮作用。

3.1 NET與膀胱內(nèi)卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）灌注治療

膀胱內(nèi)BCG灌注已成為NMIBC最有效的免疫治療方法，可有效降低術(shù)后復(fù)發(fā)率和腫瘤進(jìn)展率[29]。然而，BCG相關(guān)的不良反應(yīng)和不耐受限制了其應(yīng)用，因此了解膀胱內(nèi)BCG灌注對腫瘤的作用機(jī)制可以為BC的免疫治療提供新的策略[30]。中性粒細(xì)胞是BCG免疫治療有效的必要條件，多形核 中 性 粒 細(xì) 胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是人類固有免疫的第一道防線，是膀胱內(nèi)BCG灌注治療后出現(xiàn)的主要白細(xì)胞亞群[31]。BCG誘導(dǎo)的NET有助于抑制腫瘤細(xì)胞生長，特別是在使用BCG的初期，在BCG、炎癥因子和腫瘤細(xì)胞存在的情況下，活化的PMN可以刺激自噬途徑并釋放NET，自噬還能調(diào)節(jié)NET的形成，誘導(dǎo)活性氧和NET的產(chǎn)生[32]。

在BCG治療過程中，PMN的生物功能包括促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖和生存等，其產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子、趨化因子和NET通過影響其他免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并在BCG治療的早期形成腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TIME）[33]。Liu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，BCG誘導(dǎo)的NET具有雙重效應(yīng)，具體包括NET的直接效應(yīng)和NET刺激的間接效應(yīng)，NET的直接效應(yīng)通過細(xì)胞毒性作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制腫瘤細(xì)胞向膀胱環(huán)境遷移等表現(xiàn)出來，而間接效應(yīng)是NET通過刺激免疫反應(yīng)、募集T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞阻止腫瘤生長。

3.2 NET與BC的放射治療

超過40%的侵襲性BC患者傾向于選擇非手術(shù)治療，如放射治療表現(xiàn)出良好的腫瘤治療效果[35]。Menon等[36]研究發(fā)現(xiàn)，BC患者的TIME在放射治療中具有關(guān)鍵作用。輻射引起的炎癥會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞快速進(jìn)入TIME，免疫細(xì)胞的浸潤和促炎細(xì)胞因子的釋放可以在長時(shí)間內(nèi)維持免疫反應(yīng)，通過形成NET影響腫瘤進(jìn)展[37]?；诜派渲委熁颊叩木植棵庖叻磻?yīng)，循環(huán)中性粒細(xì)胞的持續(xù)高濃度也與BC患者的預(yù)后相關(guān)[38]。

Shinde-Jadhav等[39]研究使用相同腫瘤基因型的小鼠BC模型，發(fā)現(xiàn)在接受放射治療的小鼠TIME中NET沉積增加，通過抑制NET可以改善整體輻射反應(yīng)。在體外，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box B1，HMGB1）可促進(jìn)NET形成；在體內(nèi)，抑制HMGB1和NET均可顯著延緩腫瘤生長。而在部分BC患者中觀察到NET，這些患者對放射治療沒有反應(yīng)，并且在放射治療后BC持續(xù)進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)確定了NET可以作為提高放射治療療效的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索NET在放射治療中的作用及與腫瘤相關(guān)蛋白的相互作用是有必要的，可以確定放射治療的時(shí)機(jī)。

4 NET在BC治療中的作用機(jī)制

腫瘤分級、臨床分期、淋巴管和血管擴(kuò)張等常被作為BC的預(yù)后指標(biāo)。然而，目前使用的預(yù)后標(biāo)志物在預(yù)測腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)方面作用有限[40]。NET與CD15、MPO和瓜氨酸化組蛋白H3共同染色后可被明顯觀察到，在BC的進(jìn)展過程中NET可被定量地檢測[28]。因此，對組織和血清中的NET進(jìn)行動(dòng)態(tài)評估可為BC治療效果的預(yù)測提供依據(jù)。

NETosis過程可在不同水平上進(jìn)行治療性阻斷，例如IL-8可以被單克隆抗體中和，C-X-C趨化因子受體（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR）1/2抑制劑可以延緩NETosis，這些研究正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[41-42]。應(yīng)用NET的抑制劑或降解劑治療腫瘤正在被探索，例如肽基精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine decoagulase 4，PAD4）能夠?qū)⒕彼徂D(zhuǎn)化為瓜氨酸，從而引起染色質(zhì)發(fā)生變化，而PAD4缺乏的中性粒細(xì)胞不能產(chǎn)生NET[43]。這些研究說明根據(jù)NET的發(fā)生機(jī)制研究治療腫瘤的靶向藥物是可行的且具有廣闊的前景。

5 小結(jié)

綜上所述，NET在腫瘤的發(fā)生和治療中具有重要作用，但目前關(guān)于NET在BC治療中作用的研究還較少，主要局限在放射治療和BCG灌注治療方面，通過靶向NET改善BC患者預(yù)后將成為未來的重要研究方向，未來還需要更多的研究來闡明NET在BC發(fā)生發(fā)展中的作用。