武 鵬,石凱威,高歆越,姜宜飛,吳進龍*,王詩雨
(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所,北京 100125;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100193)
檸檬烯屬于單環(huán)單萜類化合物,化學(xué)名稱為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯,具有三種同分異構(gòu)體,分別為右旋檸檬烯、左旋檸檬烯和消旋檸檬烯[1,2],不同構(gòu)型的檸檬烯的生物活性存在差異[3],目前登記的檸檬烯有效成分均為d-檸檬烯,但已報到的檸檬烯分析方法如氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-7]均不能對檸檬烯進行手性拆分。本文采用氣相色譜法對檸檬烯中的l-檸檬烯和d-檸檬烯進行手性拆分和定量分析,該方法操作簡便、快速、準確,分離效果好,準確度和精密度均能達到定量分析的要求。
2.1 試劑和溶液 丙酮(色譜純);苯甲酸甲酯(分析純);內(nèi)標溶液:稱取苯甲酸甲酯0.05g(精確至0.000 2g),置于100mL容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,搖勻,備用;d-檸檬烯標樣,已知質(zhì)量分數(shù)99.0%(sigma-aldrich);l-檸檬烯標樣,已知質(zhì)量分數(shù)99.0%(sigma-aldrich);5%d-檸檬烯可溶液劑(由某公司提供)。
2.2 儀器氣相色譜儀 Agilent 7890A,具有氫火焰離子檢測器和自動進樣器;Agilent色譜工作站;色譜柱:30m×0.25mm(id) RestekRt-βDEXse毛細管色譜柱,膜厚0.25μm。
2.3 氣相色譜操作條件 溫度(℃):柱室溫度:初始80℃,保留15min,以20℃/min升溫至220℃,保留5min;氣化室溫度:220℃,檢測室溫度:240℃,載氣(N2):1.0mL/min;氫氣:30mL/min,空氣:300mL/min,進樣體積:1μL,分流比:10:1,保留時間:d-檸檬烯約13.0min;l-檸檬烯約12.5min;內(nèi)標物約18.3min。
d-檸檬烯標樣、l-檸檬烯標樣、內(nèi)標物和5%d-檸檬烯可溶液劑的氣相色譜圖(圖1、2)。
圖1 l-檸檬烯、d-檸檬烯標樣和內(nèi)標物氣相色譜圖
圖2 5%d-檸檬烯可溶液劑和內(nèi)標物氣相色譜圖
2.4 測定步驟
2.4.1 標樣溶液的配制 稱取l-檸檬烯標樣0.05g(精確至0.000 2g),置于100mL容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,搖勻;移取1.0mL上述溶液于10mL容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,搖勻;稱取d-檸檬烯標樣0.05g(精確至0.000 2g),置于10mL容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,搖勻;移取1.5mLl-檸檬烯標準溶液和1mLd-檸檬烯標準溶液,置于10mL容量瓶中,加入2mL內(nèi)標液,再用丙酮稀釋至刻度,搖勻,備用。
2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含d-檸檬烯的試樣0.1g(精確至0.000 2g),置于10mL容量瓶中,加入2mL內(nèi)標液,再用丙酮稀釋至刻度,超聲3min,搖勻,冷卻,備用。
2.4.3 測定在上述操作條件下 待儀器基線穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液,直至相鄰2針標樣溶液的響應(yīng)值相對變化<1.5%后,按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。
2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)峰面積分別進行平均。試樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量分數(shù)ω(%),按式(1)計算:
(1)
式中:
r1——標樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標物峰面積比的平均值;
r2——試樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標物峰面積比的平均值;
m1——標樣的質(zhì)量,g;
m2——試樣的質(zhì)量,g;
P——標樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量分數(shù),%;
n——稀釋倍數(shù),n(l-檸檬烯)=2000/3,n(d-檸檬烯)=10。
3.1 色譜條件的選擇 因d-檸檬烯和l-檸檬烯屬于旋光異構(gòu)體,且二者的沸點差異不大,采用常規(guī)的色譜柱不能進行有效拆分,且二者的碎片離子峰是一致的,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也不能進行有效拆分[4-7],本方法采用RestekRt-βDEXse手性毛細管色譜柱對檸檬烯進行拆分;依據(jù)檸檬烯物化性質(zhì),用丙酮作為溶劑溶解樣品,為了得到更好的分離效果和峰形,用不同的升溫條件在色譜柱上進行試驗,最終確定溫度(℃):初始80℃,保留15min,以20℃/min升溫至220℃,保留5min;在該條件下,d-檸檬烯和l-檸檬烯進行了有效拆分,且與雜質(zhì)能得到很好的分離,峰形對稱,基線平穩(wěn),能在短時間得到滿意的分析結(jié)果,提高了工作效率。
3.2 分析方法的線性相關(guān)性試驗 按2.4.1中標樣溶液的配制方法分別配制質(zhì)量濃度為5.07、25.35、50.70、253.49、506.98、1013.96mg/L的l-檸檬烯標準溶液,質(zhì)量濃度為5.08、25.41、50.83、254.13、508.27、1016.53mg/L的d-檸檬烯標準溶液,以d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量濃度為橫坐標,d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標物峰面積比為縱坐標,繪制校正曲線。試驗測得d-檸檬烯線性方程為y=1.277 95x+1.989 97,相關(guān)系數(shù)為0.996 89;l-檸檬烯線性方程為y=1.182 53x+1.774 80,相關(guān)系數(shù)為0.996 88。結(jié)果表明d-檸檬烯和l-檸檬烯在測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
3.3 分析方法的精密度試驗 從同一產(chǎn)品中準確稱取5個試樣,在上述色譜操作條件下進行分析,測得d-檸檬烯的標準偏差為0.066,變異系數(shù)為0.013%,l-檸檬烯的標準偏差為0.000 17,變異系數(shù)為0.023%(表1)。
表1 分析方法的精密度試驗結(jié)果
3.4 分析方法的準確度試驗 從已知d-檸檬烯(5.20%)和l-檸檬烯(0.007 5%)質(zhì)量分數(shù)的樣品中稱取5個試樣,分別加入一定量的d-檸檬烯標樣(99.0%)和l-檸檬烯標樣(99.0%),在上述色譜操作條件下進行分析,測得d-檸檬烯的平均回收率為100.41%,l-檸檬烯的平均回收率為101.72%(表2)。
表2 分析方法的準確度試驗結(jié)果
試驗建立了氣相色譜法手性拆分檢測d-檸檬烯和l-檸檬烯的分析方法。試驗結(jié)果表明,d-檸檬烯和l-檸檬烯在測試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,方法準確度和精密度較高,具有操作簡便、快速的特點,是產(chǎn)品質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中較為理想的分析方法。