杜紅飛，袁鴻玲，龐雪利，鄧蘭，陽燕，唐寧，許穎

610500 成都，成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2021年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌的新增病例數(shù)為248 530例，占26%，居男性癌癥的第1位[1]；2022年我國癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌的發(fā)病率居我國第7位，死亡率居第10位[2]。目前大約10%的前列腺癌患者就診時已處于疾病晚期，且有5%患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，嚴(yán)重影響人類的健康。因此，迫切需要探究前列腺癌發(fā)病的病理分子機制，尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點。

CBX4（chrombox homolog 4，CBX4）為 多 梳 基因蛋白家族（the Polycomb group of protein，PcG）成員之一，是一種SUMO E3鏈接酶[4]。近年來的研究證實CBX4參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為重要的分子靶點，然而CBX4在前列腺癌中的研究仍處于空白。鐵死亡是2012年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物和活性氧過量積累導(dǎo)致的鐵依賴性程序性細(xì)胞死亡[5]，不同于細(xì)胞凋亡、壞死及自噬，鐵死亡在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為線粒體皺縮、線粒體嵴減少、線粒體膜密度增加和細(xì)胞核正常[6]。目前的研究表明，鐵死亡主要包含兩個途徑，一是外源性（轉(zhuǎn)運蛋白依賴）途徑，即胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體，其中SLC7A11為鐵死亡的重要上游調(diào)控蛋白；另一途徑為內(nèi)源性（酶調(diào)控）途徑，脂質(zhì)過氧化物積累是鐵死亡的標(biāo)志。2021年Ghoochani等[7]最新的研究發(fā)現(xiàn)，SLC7A11高表達(dá)于去勢抵抗性前列腺癌，參與前列腺癌鐵死亡的調(diào)控。為此，本研究將通過生物信息數(shù)據(jù)庫和細(xì)胞水平實驗揭示CBX4在前列腺癌的表達(dá)，臨床意義及CBX4對前列腺癌鐵死亡的影響，以期為前列腺癌的臨床治療和診斷提供有效的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)移性激素敏感型前列腺癌細(xì)胞系LNCap和22RV1、轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC3和DU145以及前列腺增生細(xì)胞BPH-1為課題組前期保存于液氮；組織芯片從上海芯超生物購買獲得，包括100例前列腺癌組織，50例前列腺癌旁組織，相關(guān)病理參數(shù)見表1（剔除6例信息不全的病例）。CBX4干擾慢病毒載體（LV-shCBX4）購買于上海吉凱基因，保存于-80℃。CBX4抗體購于正能生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析CBX4基因表達(dá) Onc- omine（www.oncomine.org）為一個在線分析DNA或RNA序列的腫瘤微陣列數(shù)據(jù)庫，可用于基因表達(dá)分析的研究。本文利用Oncomine進行CBX4數(shù)據(jù)集收集，篩選條件為“gene: CBX4； analysis type: cancer vs normal analysis； data type: all； cancer type: prostate cancer； gene summary: P ＜ 0.05，fold change ＞ 2，gene rank = top 10%； order by: over-expression”。對獲取的部分?jǐn)?shù)據(jù)進行Meta分析，結(jié)果用散點圖表示。

1.2.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫進行病理參數(shù)和生存期分析 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）數(shù) 據(jù) 庫是一個基于TCGA數(shù)據(jù)集中31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)進行在線分析和挖掘的網(wǎng)站工具，可以對相關(guān)基因進行表達(dá)譜、臨床病理參數(shù)等進行分析。在UALCAN數(shù)據(jù)庫中的TCGA數(shù)據(jù)集的gene symbol（s）檢索“CBX4”，TCGA Dataset選擇“prostate adenocarcinoma”。分別對CBX4在前列腺癌和前列腺正常組織的表達(dá)、CBX4的表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理特征（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Gleason 分?jǐn)?shù)等）及生存期進行分析。

1.2.3 HPA數(shù)據(jù)庫分析CBX4蛋白表達(dá)水平 HPA在線數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org）：該數(shù)據(jù)庫包含大約20 種常見的腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)。本項目通過利用該數(shù)據(jù)庫在線評估正常潛前列腺正常組織和前列腺癌中CBX4蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 String數(shù)據(jù)庫平臺構(gòu)建CBX4蛋白互作網(wǎng)絡(luò) String（https://cn.string-db.org/）是一個在線搜索已知蛋白，以及預(yù)測蛋白質(zhì)互作關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫。本研究運用該數(shù)據(jù)庫分析可能與CBX4基因相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 免疫組織化學(xué) 免疫組化參照課題組前期已發(fā)表論文所述方法[8-9]。CBX4抗體按照1∶200的比例稀釋用于前列腺癌組織免疫組化檢測。將組織芯片進行常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，一抗，二抗及三抗孵育等步驟處理后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。CBX4免疫組化染色結(jié)果通過半定量計分的方法進行蛋白表達(dá)的評價，染色強度評分原則如下：陰性（0分）、弱陽性（1分）、中陽性（2分）、強陽性（3分）；陽性染色的百分比評分如下： ＜ 5%（0分）、5% ～ 25%（1分）、26% ～ 50%（2分）、51% ～ 75%（3分）、 ＞ 75%（4分）。CBX4的最終免疫組化染色得分（0 ～ 12分）為組織標(biāo)本的染色強度評分乘以相對應(yīng)的陽性染色的百分比評分。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞PC3、22RV1、DU145 和LNCap，前列腺增生細(xì)胞BPH-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素的1640，于37℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。

1.2.7 實時熒光定量PCR 參照課題組前期已發(fā)表論文所述方法[8-9]，采用Triol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000進行定量后，取200 ng總RNA經(jīng)Bio-Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄，后將產(chǎn)物進行qPCR檢 測，CBX4的 引物序列為：Forward： 5’-AGTGGAGTATCTGGTGAAATGGA-3；Reverse：5’-TCCTGCCTTTCCCTGTTCTG-3’。每個樣本以β-actin為內(nèi)參。

1.2.8 CBX4干擾慢病毒載體感染 LV-shCBX4和LV-control（LV-ctrl）慢病毒從上海吉凱基因購買。CBX4干擾序列為：GATGAAGATAGTCAAGAACAA；對照序列為：TTCTCCGAACGTGTCACGT。常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)60% ～ 80%。感染細(xì)胞LV-shCBX4和LV-ctrl，并使用嘌呤霉素穩(wěn)定篩選CBX4沉默細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，在蛋白和mRNA水平上驗證CBX4干擾效果。

1.2.9 免疫印跡（Western blot） 參照課題組前期已發(fā)表論文所述方法[8-9]。采用細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，即加入細(xì)胞RIPA裂解液，經(jīng)勻漿、裂解、離心后，獲得總蛋白，后通過Bradford方法檢測總蛋白濃度，利用 SDS-PAGE行蛋白電泳，經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，后將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉，加入CBX4一抗4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液，顯影，拍照。最后，采用ImageJ分析系統(tǒng)軟件測定蛋白條帶的光密度值，以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參對照。

1.2.10 透射電鏡 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)LV-shCBX4和LV-ctrl慢病毒感染細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，分別兩次離心后，吸除細(xì)胞上清，緩慢加入戊二醛固定液，將固定好的細(xì)胞送成都里來生物科技有限公司完成透射電鏡細(xì)胞鐵死亡觀察，即通過固定-脫水-滲透與包埋-超薄切片-雙染色法-圖像采集（6 000倍觀察）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究涉及的所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運用t檢驗分析組間差異。CBX4的表達(dá)和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗分析。P ＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CBX4在前列腺癌組織的表達(dá)分析

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，有327項研究分析了CBX4在癌組織和正常組織的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：58項研究提示表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，49項為高表達(dá)，9項為低表達(dá)。其中，有5項研究分析了前列腺癌中CBX4的表達(dá)情況，均提示CBX4呈異常高表達(dá)（圖1A）。對5項研究的數(shù)據(jù)進行Meta分析，結(jié)果提示，與對照組比較，CBX4在所有差異表達(dá)基因的中位數(shù)值排名為576（P ＜ 0.001），表明CBX4在前列腺癌中高表達(dá)（圖1B）。

然后，選取Wallace和Grasso等2項前列腺癌芯片的表達(dá)研究，對其表達(dá)進行了散點圖分析。結(jié)果顯示，CBX4均高表達(dá)于前列腺癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05；圖1C、D）。最后，利用不同來源的UALCAN和HPA數(shù)據(jù)庫驗證，發(fā)現(xiàn)CBX4明顯高表達(dá)于前列腺癌（圖1E、F）。

圖1 CBX4在前列腺癌中的表達(dá)差異Figure 1．Differential Expression of CBX4 in Prostate Cancer

2.2 CBX4的表達(dá)與前列腺癌病理參數(shù)及生存期的關(guān)系

運用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CBX4 mRNA表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征關(guān)系，包括Gleason分?jǐn)?shù)、TP53突變、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，數(shù)據(jù)結(jié)果表明CBX4的表達(dá)與前列腺癌的Gleason分?jǐn)?shù)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與TP53突變和種族有明顯相關(guān)性（圖2A～D）。同時，對CBX4高、低表達(dá)組進行了生存期的分析，揭示前列腺癌患者的不良預(yù)后與CBX4的高表達(dá)相關(guān)（圖2E）。

進一步在臨床樣本組織芯片中利用免疫組織化學(xué)分析CBX4蛋白在前列腺癌表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果提示，CBX4蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖2F、G），且與臨床Gleason分?jǐn)?shù)相關(guān)（P ＜ 0.05），而與前列腺癌患者的年齡、病理分級、TNM分期無關(guān)（P ＞ 0.05；表1、2）。

表1 前列腺癌患者的臨床參數(shù)及CBX4在前列腺癌組織中的表達(dá)Table 1．Clinical Characteristics of Prostate Cancer Patients and CBX4 Expression in Prostate Cancer Tissue

圖2 CBX4的表達(dá)與前列腺癌病理參數(shù)的關(guān)系Figure 2．Association between CBX4 Expression and Clinical Characteristics of Prostate Cancer

2.3 CBX4相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

通過String平臺構(gòu)建CBX4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）發(fā)現(xiàn)，與CBX4相互作用的蛋白有E3泛素蛋白連接酶RING2和RING1、多梳復(fù)核蛋白BMI-1、多梳樣蛋白PHC1/PHC2/PHC3、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A等。

圖3 CBX4基因與上下游基因的關(guān)系Figure 3．Relationship between CBX4 and Upstream or Downstream Genes

2.4 CBX4在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)情況

提取前列腺增生細(xì)胞與癌細(xì)胞的總RNA，進行RT-PCR。結(jié)果顯示，與前列腺增生細(xì)胞BPH-1比較，CBX4在前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNcap細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05；圖4）。由于22Rv1和LNcap為轉(zhuǎn)移性雄激素敏感型前列腺癌細(xì)胞，表明CBX4的高表達(dá)可能與雄激素敏感有關(guān)系。

圖4 CBX4前列腺增生細(xì)胞和癌細(xì)胞系的mRNA表達(dá) 水平Figure 4．Levels of CBX4 mRNA in Prostate Hyperplasia Cells and Cancer Cell Lines

表2 CBX4的表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2．Correlation between CBX4 Expression and Clinicopathologic Characteristics of Prostate Cancer Patients

2.5 CBX4對前列腺癌細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響

基于CBX4在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果，選擇22RV1細(xì)胞作為細(xì)胞水平功能實驗的細(xì)胞，分別感染CBX4慢病毒載體LV-shCBX4和LV-ctrl，RT-qPCR和Western blot 檢測CBX4的干擾效果。如圖5A和5B所示，LV-shCBX4能夠明顯降低22RV1細(xì)胞中CBX4的表達(dá)水平。透射電鏡下的線粒體的變化顯示，與LV-ctrl組比較，LV-shCBX4的線粒體皺縮，膜密度增加（圖5C）。以上結(jié)果表明下調(diào)CBX4的表達(dá)加劇線粒體的皺縮，揭示CBX4負(fù)性調(diào)控鐵死亡。

圖5 干擾CBX4表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞鐵死亡的影響Figure 5. Effect of CBX4 Interference on Ferroptosis of Prostate Cells

2.6 CBX4對鐵死亡關(guān)鍵分子SLC7A11表達(dá)的影響

由于胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11是鐵死亡的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控蛋白，抑制其表達(dá)能夠誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[10]。因此，下調(diào)CBX4的表達(dá)后，實時熒光定量PCR檢測SLC7A11的表達(dá)變化。如圖6所示，與正常組及LV-ctrl組比較，LV-shCBX4組的SLC7A11表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。

圖6 干擾CBX4的表達(dá)對SLC7A11表達(dá)的影響Figure 6．Effect of CBX4 Interference on the Level of SLC7A11 mRNA Expression

3 討 論

前列腺癌是危害男性健康的常見腫瘤之一，早期臨床癥狀不典型，確診時多數(shù)患者已是中晚期[11]。目前臨床對于前列腺癌的治療方法為手術(shù)切除結(jié)合內(nèi)分泌治療、放療、化療等，能夠延長部分患者的生存期，但部分患者會因為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致臨床結(jié)局不理想。因此，深入探究前列腺癌的分子發(fā)病機制，對臨床的早期診斷和治療具有關(guān)鍵的臨床意義。

CBX4具有重要的SUMO泛素連接酶活性。研究表明CBX4參與促進實體腫瘤發(fā)生發(fā)展[12-13]，且在多種腫瘤中表達(dá)異常，如骨肉瘤[14]、肝癌[15]、結(jié)直腸癌[16]及食管鱗狀細(xì)胞癌[17]等。另外，CBX4通過泛素化調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子1a的轉(zhuǎn)錄活性進而調(diào)控腫瘤血管生成[18]；CBX4可與HDAC3的相互作用來抑制轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)，進而調(diào)控結(jié)直腸癌的遷移和侵襲能力[16]；CBX4的異常高表達(dá)促使肝癌患者易發(fā)生多柔比星耐藥[19]。然而，CBX4在前列腺癌中發(fā)揮的生物學(xué)功能未見報道，有待深入探究。

本研究首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，有5項研究顯示CBX4在前列腺癌中顯著高表達(dá)；進一步對這部分研究進行Meta及散點圖分析，得到的結(jié)果一致。然后，我們運用TCGA來源數(shù)據(jù)庫UALCAN證實，CBX4在前列腺癌的表達(dá)明顯高于正常前列腺組織，且通過HPA數(shù)據(jù)庫從蛋白水平證實了這一結(jié)論。為增加生物信息數(shù)據(jù)庫結(jié)論的準(zhǔn)確性，我們再次利用免疫組織化學(xué)方法檢測臨床患者組織芯片中CBX4在前列腺癌及前列腺癌旁組織的表達(dá)情況，并通過實時熒光定量PCR檢測前列腺癌細(xì)胞及增生細(xì)胞CBX的mRNA水平。結(jié)果顯示，前列腺癌組織中的CBX4表達(dá)高于癌旁組織，并且CBX4高表達(dá)于轉(zhuǎn)移性激素敏感型前列腺癌細(xì)胞系LNCap和22RV1，而在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145中呈低表達(dá)，表明CBX4的表達(dá)可能與前列腺癌雄激素治療敏感性有關(guān)，提示CBX4可能為參與前列腺癌發(fā)生和發(fā)展的重要分子，為后期的進一步實驗奠定了基礎(chǔ)。為分析CBX4在前列腺癌中可能涉及的臨床意義，我們通過UALCAN數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，CBX4的表達(dá)與前列腺癌的Gleason分?jǐn)?shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且CBX4的表達(dá)與前列腺癌的生存期呈負(fù)相關(guān)；臨床樣本組化結(jié)果顯示，CBX4的表達(dá)與前列腺癌的Gleason分?jǐn)?shù)具有密切相關(guān)性。以上研究結(jié)果表明CBX4可能為前列腺癌診療的關(guān)鍵生物學(xué)標(biāo)志物。

近年來的研究證實，鐵死亡與多種疾病，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、缺血再灌注損傷、腎臟損傷、血液病等多種疾病的病理過程密切相關(guān)。熱休克蛋白β-1過度表達(dá)可抑制erastin誘導(dǎo)的前列腺腫瘤細(xì)胞的鐵死亡[20]；前列腺癌中，ZNF217的高表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量降低，結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加，促進了前列腺腫瘤細(xì)胞的生長[21]。以上研究揭示鐵死亡為臨床前列腺癌潛在治療靶點，因此研究鐵死亡的調(diào)控機制具有重要的臨床意義。本研究確定CBX4高表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞后，利用慢病毒干擾技術(shù)下調(diào)CBX4的表達(dá)，運用透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察線粒體的改變，發(fā)現(xiàn)線粒體皺縮，膜密度增加，揭示CBX4調(diào)控前列腺癌的鐵死亡；進一步檢測CBX4調(diào)控的鐵死亡分子發(fā)現(xiàn)，CBX4干擾組的SLC7A11表達(dá)明顯被抑制。但具體的分子機制待后期進一步探究。以上結(jié)果提示CBX4可能通過對外源性胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體的關(guān)鍵蛋白SLC7A11的調(diào)控進而抑制前列腺癌的鐵死亡。

綜上所述，本研究通過生物信息數(shù)據(jù)庫分析和細(xì)胞水平實驗證實，CBX4在前列腺癌中的表達(dá)上調(diào)，與前列腺癌的臨床病理參數(shù)Gleason評分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且影響前列腺癌患者的預(yù)后，與生存期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；進一步發(fā)現(xiàn)前列腺癌中可能存在CBX4/SLC7A11信號軸調(diào)控鐵死亡。以上研究或可為前列腺癌患者的早期診斷和靶向治療提供更為精準(zhǔn)的分子標(biāo)志物和靶點。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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