王雯，馮暢，林海生,2*，秦小明,2，曹文紅,2，章超樺,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，陳憶賓

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué) 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江)，南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088； 3.海南盛美諾生物技術(shù)有限公司，海南 澄邁 571925)

膠原蛋白是由3條α-肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，分子量較大，約占動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的1/3[1]，主要存在于動(dòng)物的結(jié)締組織、骨骼和皮膚中。膠原蛋白富含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。目前，已知的膠原蛋白種類繁多，常見類型為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ型。水產(chǎn)動(dòng)物源膠原蛋白主要為Ⅰ型和Ⅴ型，其中，Ⅰ型含量最多, 其相對(duì)分子質(zhì)量一般在100 000級(jí)范圍內(nèi), 大部分相對(duì)分子質(zhì)量約為300 000[2]。與陸生動(dòng)物相比，水產(chǎn)動(dòng)物源膠原蛋白含量較高，且具有低抗原性、低過敏性等特性，因此，水產(chǎn)動(dòng)物作為新的膠原蛋白提取源備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

目前，有關(guān)水生生物源膠原蛋白的研究，主要集中在魚類、蛙類和海洋無脊椎動(dòng)物(軟體動(dòng)物、海參和腔腸動(dòng)物)等。水生生物源膠原蛋白的氨基酸組成特性差異較大，且其酶解產(chǎn)物具有生物活性多樣性特點(diǎn)。Song等[3]通過發(fā)酵預(yù)處理，從尼羅羅非魚Oreochromisniloticus魚皮中提取膠原蛋白，證明其為Ⅰ型膠原蛋白，并能較好地保留其三螺旋結(jié)構(gòu)；趙媛媛等[4]從林蛙Ranachensinensis皮中提取膠原蛋白，證明其膠原蛋白具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力；Dai等[5]在魷魚軟骨中分離出新型Ⅱ型膠原蛋白，并證明其能減少患炎癥大鼠的促炎細(xì)胞因子；鄭志鴻等[6]證明了方格星蟲Sipunculusnudus酶解物具有促進(jìn)傷口愈合功效。對(duì)比魚類膠原蛋白，現(xiàn)階段對(duì)貝類膠原蛋白的研究仍較少。

馬婷等[7]研究發(fā)現(xiàn)，貝類外套膜膠原蛋白含量較高，本研究團(tuán)隊(duì)前期采用酶法降解貝類外套膜組織，并證實(shí)其酶解產(chǎn)物具有創(chuàng)傷修復(fù)等生物活性[8]。然而，對(duì)貝類膠原蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能的系統(tǒng)研究卻鮮有報(bào)道。

據(jù)2021年中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，貝類作為一種重要的經(jīng)濟(jì)漁業(yè)資源，年產(chǎn)量約為1 500萬t，約占水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的30%。目前，中國海洋貝類的加工產(chǎn)品主要是一些傳統(tǒng)食品，如冷凍品、干制品、罐頭和腌制品等。貝類外套膜富含膠原蛋白，通常作為主要的副產(chǎn)物被加工成低值產(chǎn)品或當(dāng)作廢棄物處理，不僅造成資源的浪費(fèi)，還對(duì)環(huán)境產(chǎn)生生態(tài)污染。因此，為進(jìn)一步提高貝類資源加工的附加值，外套膜膠原蛋白的提取及應(yīng)用顯得尤為重要。

華貴櫛孔扇貝Chlamysnobilis是中國南海地區(qū)主要的扇貝養(yǎng)殖種類之一[9]。近年來，其產(chǎn)量一直處于世界前列。華貴櫛孔扇貝可食部分主要為閉殼肌，除鮮食外，其加工方式主要為冷凍和干制，加工過程中產(chǎn)生了大量的外套膜組織，卻缺少高值化加工利用[10]。本研究中，以華貴櫛孔扇貝為原料，采用酸-酶處理法和熱水浸提法，從外套膜組織中提取膠原蛋白，并對(duì)其氨基酸組成、分子量分布、微觀結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱變性溫度等理化特性進(jìn)行比較分析，以期為其高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鮮活華貴櫛孔扇貝于2020年11月購自廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng)(產(chǎn)地湛江雷州流沙灣)。

試劑：胃蛋白酶(豬胃黏膜)(10 000 U/g，上海源葉有限公司)、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、 對(duì)二甲氨基苯甲醛、冰乙酸、氯胺T、溴化鉀和氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純(西隴科學(xué)股份有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液、R-250考馬斯亮藍(lán)和BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量為6 500～270 000)均購自碧云天生物技術(shù)公司。試驗(yàn)用水為純水。

儀器和設(shè)備：UMVERSAL 320R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Hettich公司)、FD-551冷凍干燥機(jī)(EYELA公司)、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)、835-50氨基酸自動(dòng)分析儀(日立公司)、UV-756MC紫外分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)、Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker公司)、PHS-2F pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、Pyris1 DSC-7全自動(dòng)熱分析儀(TA 沃特斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 膠原蛋白的提取

1)酸-酶法。按料液比1∶20(g∶mL)將扇貝外套膜加入 0.5 mol/L乙酸中，并加入外套膜質(zhì)量2%[11]的豬胃蛋白酶，用磁力攪拌器攪拌24 h，離心取上清，緩慢加入氯化鈉溶液并攪拌至終濃度為0.9 mol/L，靜置過夜(膠原蛋白鹽析)，以8 000 r/min離心15 min，取出沉淀加入0.1 mol/L乙酸溶液復(fù)溶，透析12 h，每4 h更換一次透析液，至透析液中性[12]，得膠原蛋白提取液，冷凍干燥得到酸-酶溶性膠原蛋白凍干粉，記為A-PSC(Cn)(acid-pepsin soluble collagenChlamysnobilis)(以上所有操作均在4 ℃下進(jìn)行)。

2)熱水浸提法。參照溫慧芳等[13]方法，略做修改。加堿除雜蛋白后，按料液比1∶20將扇貝外套膜加入蒸餾水中，并置于95 ℃ 恒溫水浴中攪拌提取4 h, 取出用紗布過濾, 收集濾液, 旋蒸濃縮后冷凍干燥得到其膠原蛋白凍干粉，記為HSC(Cn)(hot water soluble collagenChlamysnobilis)。

1.2.2 膠原蛋白凍干粉得率測(cè)定 膠原蛋白得率(%)計(jì)算公式為

膠原蛋白得率=膠原蛋白凍干粉質(zhì)量(g)/外套膜質(zhì)量(g)×100%。

1.2.3 膠原蛋白含量測(cè)定 參照 GB/T 9695.23—2008測(cè)定羥脯氨酸含量，膠原蛋白含量(%)計(jì)算公式為

膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×11.1。

1.2.4 膠原蛋白理化性質(zhì)測(cè)定

1)氨基酸組成分析。參照 GB5009.124—2016測(cè)定膠原蛋白的氨基酸組成。

2)紫外全波長(zhǎng)掃描分析。取適量膠原蛋白凍干粉樣品溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的膠原蛋白溶液，以 0.1 mol/L乙酸溶液作空白對(duì)照。在190～400 nm處以2 nm/s的速度對(duì)不同樣品的膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描，采集速率為0.5 nm/s[14]。

3)傅里葉變換紅外光譜分析。參照楊慧等[15]的方法，略做修改。取適量膠原蛋白凍干粉樣品，以質(zhì)量比1∶20將凍干粉與溴化鉀(溴化鉀使用前于120 ℃烘箱烘干4 h以上備用)加入瑪瑙缽體中研磨后進(jìn)行壓片。使用紅外光譜掃描測(cè)定4 000～400 cm-1處樣品的透過率，分辨率為4 cm-1。

4)SDS-PAGE分析。聚丙烯酰胺凝膠由質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的分離膠組成[16]，電泳儀電壓120 V。取0.1 mg/mL的膠原蛋白溶液，按照每4 μL膠原蛋白溶液加入1 μL上樣緩沖液的比例，加入5×SDS緩沖液混合均勻，于100 ℃下煮沸3 min，冷卻備用。取10 μL混合液進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后，在考馬斯亮藍(lán)G-250超快速染色液中染色0.5 h，用蒸餾水沖洗表面染色劑，小心將膠條泡在蒸餾水中，于脫色搖床上反復(fù)脫色至條帶清晰可見，取出后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

5)掃描電子顯微鏡觀察。取適量膠原蛋白凍干粉固定在導(dǎo)電膠上，噴金時(shí)間為400 s，加速電壓為10.00 kV，真空噴金處理后，在不同倍數(shù)掃描電子顯微鏡下觀察不同樣品的膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)。

6)熱變性溫度。使用差示掃描量熱儀測(cè)定樣品的熱變性溫度，取適量膠原蛋白凍干粉樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配制成0.1 mg/mL的膠原蛋白溶液，測(cè)定時(shí)用移液槍準(zhǔn)確移取8 μL樣品溶液置入鋁坩堝后密封，以空的鋁坩堝作為空白對(duì)照。掃描溫度為30～100 ℃，升溫速率為3 ℃/min，樣品室氮?dú)饬髁繛?0 mL/min[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，數(shù)據(jù)用SPSS 22軟件進(jìn)行組間差異性分析(F檢驗(yàn))，采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白提取效果

從表1可見：熱水法提取的外套膜膠原蛋白凍干粉得率顯著高于酸-酶法(P<0.05)；HSC(Cn)和A-PSC(Cn)凍干粉中膠原蛋白的平均含量分別為61.94%和37.41%，HSC(Cn)的膠原蛋白含量顯著高于A-PSC(Cn)(P<0.05)。這說明提取方法對(duì)膠原蛋白含量有顯著性影響。

2.2 膠原蛋白的氨基酸組成

從表2可見，HSC(Cn)和A-PSC(Cn)均具有膠原蛋白特征性氨基酸，即甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，HSC(Cn)和A-PSC(Cn)膠原蛋白的谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均較高，組氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量相對(duì)較低，胱氨酸則均未檢出。這說明提取方法對(duì)膠原蛋白的氨基酸組成并無顯著性影響。

表1 外套膜膠原蛋白得率及膠原蛋白含量

表2 不同方法提取的膠原蛋白氨基酸組成

2.3 膠原蛋白的紫外分析

2.4 膠原蛋白的紅外分析

從圖2可見，HSC(Cn)和A-PSC(Cn)的紅外吸收光譜均具有膠原蛋白紅外光譜的特征吸收峰，包括酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶。這說明HSC(Cn)和A-PSC(Cn)均存在三股螺旋結(jié)構(gòu)，可初步判斷兩者均為Ⅰ型膠原蛋白。

圖1 外套膜膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrogram of collagens extracted from mantle of scallop Chlamys nobilis

圖2 外套膜膠原蛋白的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrogram of collagens extracted from mantle of scallop Chlamys nobilis

從表3可知，A-PSC(Cn)和HSC(Cn)的酰胺A產(chǎn)生的吸收峰分別出現(xiàn)在3 288 cm-1和 3 330 cm-1附近，提示A-PSC(Cn)相較HSC(Cn)有更多N—H基團(tuán)參與了氫鍵締合。這是因?yàn)轷０稟產(chǎn)生的吸收峰通常在3 400～3 440 cm-1，是由N—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。當(dāng)多肽中的N—H基團(tuán)參與氫鍵的形成時(shí)，會(huì)使吸收峰波數(shù)降低100 cm-1左右[13]。兩種膠原蛋白的酰胺B均出現(xiàn)在2 930 cm-1附近，主要是由CH2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，說明兩種膠原蛋白的CH2結(jié)構(gòu)未被破壞。

2.5 SDS-PAGE分析

從圖3可見：兩種膠原蛋白的圖譜相似，均含有γ、β、α1和α2鏈，由此可推測(cè)，所得兩種膠原蛋白均為Ⅰ型膠原蛋白，但其相對(duì)分子質(zhì)量不完全相同；兩種膠原蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量180 000附近均有一條α鏈的二聚體β鏈，在相對(duì)分子質(zhì)量110 000附近有一條α1鏈，在相對(duì)分子質(zhì)量95 000附近有一條α2鏈。與A-PSC(Cn)相比，HSC(Cn)在相對(duì)分子質(zhì)量66 000以下含有較多的蛋白條帶，表明HSC(Cn)含有的雜蛋白較多。

表3 外套膜膠原蛋白的紅外光譜特征峰值及位置特征基團(tuán)

1—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2—A-PSC(Cn)；3—HSC(Cn)。1—marker; 2—A-PSC(Cn); 3—HSC(Cn).圖3 外套膜膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis patterns of collagens extracted from mantle of scallop Chlamys nobilis

2.6 掃描電子顯微鏡分析

將HSC(Cn)和A-PSC(Cn)膠原蛋白分別在不同倍數(shù)的掃描電鏡下觀察，結(jié)果顯示，兩種膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)均存在明顯差異，但均保留了較為完整的纖維結(jié)構(gòu)(圖4)。HSC(Cn)結(jié)構(gòu)更加有序，呈層狀排列且較為緊密，基本形成薄片狀結(jié)構(gòu)；A-PSC(Cn)則不顯示層狀，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布不均勻，膠原蛋白的薄片部分?jǐn)嗔选?/p>

2.7 膠原蛋白的熱變性溫度

從圖5可見，HSC(Cn)的熱變性溫度明顯高于A-PSC(Cn)，二者分別為95、88 ℃，這與HSC(Cn)中的羥脯氨酸含量明顯高于A-PSC(Cn)的結(jié)果一致(表2)。這表明膠原蛋白的熱變性溫度與膠原蛋白中的亞氨基酸(如羥脯氨酸)含量呈正相關(guān)。

圖4 外套膜膠原蛋白的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscope images of collagens extracted from mantle of scallop Chlamys nobilis

圖5 外套膜膠原蛋白的熱變性溫度Fig.5 Thermal denaturation temperature of collagens extracted from mantle of scallop Chlamys nobilis

3 討論

3.1 華貴櫛孔扇貝膠原蛋白的氨基酸組成特性

氨基酸的組成比例決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和品質(zhì)[18]。本研究表明，兩種提取方法對(duì)華貴櫛孔扇貝外套膠原蛋白的含量影響較大，但對(duì)其氨基酸組成影響不大。不同提取方法對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響程度不同。熱水法提取的膠原蛋白，其三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋，形成無規(guī)則的單條多肽鏈，但對(duì)其氨基酸組成影響較小[19]。而采用酸-酶解法提取的膠原蛋白，在酶解過程中，醋酸溶液對(duì)組織的腫脹機(jī)制使胃蛋白酶容易在端肽區(qū)域切割交聯(lián)分子，導(dǎo)致其脯氨酸含量降低[20]。同時(shí)，酶解能夠有效降解酸提取物中的雜蛋白，從而導(dǎo)致兩種膠原蛋白HSC(Cn)和A-PSC(Cn)中的氨基酸相對(duì)含量存在差異，如HSC(Cn)中的亞氨基酸含量高于A-PSC(Cn)。研究表明，膠原蛋白中亞氨基酸的含量與膠原的熱變性溫度有關(guān)，亞氨基酸含量越高，膠原蛋白中的氫鍵熱穩(wěn)定性就越高[21]。本研究中，HSC(Cn)的羥脯氨酸含量高于A-PSC(Cn)(表2)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。相對(duì)鮟鱇Lophiuslitulon魚骨[22]、養(yǎng)殖花鰻鱺Anguillamarmorata魚皮[23]和鰱Hypophthalmicthysmolitrix魚皮[24]等其他水產(chǎn)魚類來源的膠原蛋白，華貴櫛孔扇貝外套膜膠原蛋白HSC(Cn)和A-PSC(Cn)的甘氨酸含量較低，而水產(chǎn)動(dòng)物來源的膠原蛋白甘氨酸含量一般均低于哺乳動(dòng)物[25]，這種差異可能是生長(zhǎng)環(huán)境不同造成的。本試驗(yàn)中，不同方法提取的櫛孔扇貝外套膜兩種膠原蛋白的氨基酸組成與楊鳳影等[26]對(duì)該物種的研究結(jié)果略有不同，原因可能是不同地理位置的扇貝種群，所食餌料及氣候條件均存在顯著差異，這表明櫛孔扇貝的氨基酸組成具有地域差異性。兩種膠原蛋白中呈味氨基酸的含量均較高，HSC(Cn)還含有較多的羥脯氨酸，羥脯氨酸具有運(yùn)輸血漿中鈣的重要功能，可通過促進(jìn)鈣在體內(nèi)的消化吸收來補(bǔ)充骨骼中的膠原蛋白[27]。因此，可針對(duì)特殊人群如老人和兒童，將該種膠原蛋白作為一種功能性食品應(yīng)用于醫(yī)療保健方面等[28]。A-PSC(Cn)含人體所必需的氨基酸量較高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于HSC(Cn)，A-PSC(Cn)的支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的總量比值也較HSC(Cn)高，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的總量比值較低是患肝病的典型依據(jù)，高支鏈氨基酸和低芳香族氨基酸混合物具有保肝作用[29]，由此推測(cè)，A-PSC(Cn)在保肝作用方面具有較優(yōu)的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 華貴櫛孔扇貝膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征

從微觀結(jié)構(gòu)上看，A-PSC(Cn)的紫外光譜在280 nm處的吸收峰高于HSC(Cn)，這表明其含有更多的芳香族氨基酸。HSC(Cn)在熱處理?xiàng)l件下三螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氫鍵斷裂，導(dǎo)致3條肽鏈彼此分開[32]，但SDS-PAGE結(jié)果顯示，其具有α鏈的二聚體β鏈，提示其膠原蛋白的結(jié)構(gòu)保存較完整。結(jié)合熱變性溫度分析，推測(cè)HSC(Cn)可能有部分三螺旋結(jié)構(gòu)未解旋，且在較高溫度條件下，膠原蛋白可能與其他物質(zhì)結(jié)合，對(duì)蛋白進(jìn)行修飾或降解，進(jìn)而形成更多雜帶[14]。

從表面形貌結(jié)構(gòu)上看，兩種膠原蛋白差異明顯。HSC(Cn)為緊密層狀，基本呈片狀結(jié)構(gòu)，提示熱水處理能使膠原蛋白發(fā)生變性與交聯(lián)[33]，這些分子間與分子內(nèi)的交聯(lián)鍵對(duì)穩(wěn)定膠原纖維的有序結(jié)構(gòu)與膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)具有重要作用[19]，使得交聯(lián)后膠原蛋白的熱穩(wěn)定性得到顯著提高，后續(xù)研究可結(jié)合原子力顯微鏡探索其熱穩(wěn)定性的變化[34]。對(duì)比HSC(Cn)，A-PSC(Cn)的雜質(zhì)蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，微觀結(jié)構(gòu)改變，膠原蛋白的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保留較完整，在結(jié)構(gòu)上具有疏松多孔的特性，推測(cè)A-PSC(Cn)應(yīng)具有較好的保濕性，較適合作為止血生物材料等[35]。本試驗(yàn)中，A-PSC(Cn)具有多層聚集且以纖維為主的無規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合其高于其他水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白的熱變性溫度，如鰈Pleuronichthyscoconuts魚皮(70.5、78.6 ℃)[36]等，推測(cè)A-PSC(Cn)較HSC(Cn)更適用于作為生物醫(yī)學(xué)材料基料，如膠原蛋白止血海綿等[24]。此研究結(jié)果可為華貴櫛孔扇貝外套膜的高值化利用和貝類外套膜膠原蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

4 結(jié)論

1)采用酸-酶法和熱水法從華貴櫛孔扇貝外套膜提取得到的膠原蛋白A-PSC(Cn)和HSC(Cn)均為Ⅰ型膠原蛋白，其結(jié)構(gòu)特征及其理化性質(zhì)均存在差異。A-PSC(Cn)三螺旋結(jié)構(gòu)完整且純度較高，具有疏松多孔的特性；HSC(Cn)亞氨基酸含量較高?？筛鶕?jù)研究需要選用不同提取方法開發(fā)膠原蛋白產(chǎn)品。

2)針對(duì)A-PSC(Cn)疏松多孔的特性，推測(cè)其在膠原蛋白海綿方面具有更廣泛的應(yīng)用，可通過進(jìn)一步的試驗(yàn)，如采用掃描電鏡、透射電鏡和圓二色譜法等測(cè)定其孔徑、觀察其構(gòu)象和分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究A-PSC(Cn)是否適用于各種損傷創(chuàng)面的止血修復(fù)。