呂國華，張婷，姚靜婷，丁圖強，徐東坡，占明飛，顧若波，徐跑，馬學(xué)艷，金武，東新旭，聞海波*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室，江蘇 無錫 214081； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 中美淡水貝類種質(zhì)資源保護及利用國際聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214081；3.阜陽市水產(chǎn)發(fā)展中心，安徽 阜陽 236001；4.安徽水韻環(huán)保股份有限公司，安徽 蕪湖 241000)

橄欖蟶蚌Solenaiaoleivira(Heude)隸屬于雙殼綱Bivalvia蚌目Unionoida蚌科Unionidae蟶蚌屬Solenaia，是中國特有的淡水經(jīng)濟蚌類，其肉厚、味鮮、營養(yǎng)價值高，具有較大的經(jīng)濟潛力，與魚類混養(yǎng)可以帶動漁民增收致富[1]。目前，因環(huán)境污染、棲息地被破壞和過度捕撈，橄欖蟶蚌自然資源急劇衰退，已接近瀕危狀態(tài)。經(jīng)研究人員不斷探索，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心長江特色水生動物繁養(yǎng)創(chuàng)新團隊已成功突破橄欖蟶蚌的人工繁育關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)了橄欖蟶蚌鉤介幼蟲的非寄生變態(tài)發(fā)育和苗種規(guī)模化繁育，這對橄欖蟶蚌資源的保護具有重要的意義。

目前，國內(nèi)學(xué)者對橄欖蟶蚌的研究主要集中在繁殖生物學(xué)[2]、營養(yǎng)成分[3]、人工馴化和增養(yǎng)殖[4]等方面，許巧情等[5]、呂國華等[6]研究表明，溫度和規(guī)格對橄欖蟶蚌耗氧率、排氨率、攝食率和同化率等存在顯著影響。但鹽度對橄欖蟶蚌呼吸代謝、攝食代謝及能量收支的研究尚未見報道。

中國幅員遼闊，鹽堿地面積巨大，開發(fā)利用鹽堿地有助于實現(xiàn)中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。中國的鹽堿地主要分為東北平原鹽堿地、東部沿海鹽堿地、黃淮海平原鹽堿地及半荒漠境內(nèi)鹽堿地4種類型[7]。其中，輕度鹽堿地含鹽量在鹽度為3以下，易開發(fā)和利用[8]。鹽度馴化試驗在魚類和甲殼類動物中研究較多[9-10]，在貝類中研究較少，橄欖蟶蚌若能在鹽堿地或灘涂養(yǎng)殖，可帶來較佳的經(jīng)濟效益，有助于加快實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。本研究中，在實驗室條件下，未考慮水型的特征和影響，測定了橄欖蟶蚌幼蚌在淡水和高鹽度水體中的存活率，并探討了可馴化高鹽度脅迫對幼蚌耗氧率、排氨率、攝食率和排糞率及能量收支等的影響，以期探索橄欖蟶蚌在鹽堿地或灘涂養(yǎng)殖的可能性，進一步豐富橄欖蟶蚌的生理能量學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗蚌取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地2019年人工繁育的1齡幼蚌，殼長為(4.68±0.31)cm，殼高為(0.87±0.21)cm，濕質(zhì)量為(2.63±0.47)g。

1.2 方法

1.2.1 暫養(yǎng)與管理 選取活力較好的幼蚌，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室暫養(yǎng)2周，每天換水2次，每次換水后投喂密度為1.7×109個/mL的破壁微擬球藻Nannochloropsisoculata2 mL。

1.2.2 急性鹽度脅迫試驗 根據(jù)等對數(shù)間距法，在鹽度為2～7范圍內(nèi)設(shè)置7個鹽度組，分別為2.00、3.31、3.70、4.24、4.92、5.82和7.00，同時設(shè)淡水對照組(鹽度為0.20±0.10)，用NaCl(AR)和曝氣自來水調(diào)節(jié)鹽度，鹽度用衡欣鹽度計8373測量，水溫為(22 ± 1)℃。每個鹽度組設(shè) 3個平行，每個平行放15只幼蚌，每隔2 h觀察記錄死亡數(shù)量，并將死亡個體挑出。根據(jù)死亡數(shù)據(jù)計算96 h的半致死鹽度(96 h LC50)。試驗中幼蚌以雙殼張開、對外界刺激無反應(yīng)為死亡標準。

1.2.3 能量收支試驗設(shè)計 基于鹽度脅迫試驗可知，鹽度高于3.31且在24 h時即出現(xiàn)死亡個體，為防止鹽度過高使幼蚌在能量收支試驗中出現(xiàn)死亡而影響試驗結(jié)果，僅選取96 h LC50值的50%的鹽度(2.23)作為可馴化鹽度，并在此鹽度下進行能量收支試驗。能量收支試驗分為3部分，分別為耗氧率與排氨率測定、攝食率與濾水率測定、排糞率與吸收率測定試驗。每部分試驗分別設(shè)鹽度組(2.23±0.10)和淡水對照組(0.20±0.10)，每組設(shè)3個平行和1個不放蚌的空白對照。

1)耗氧率和排氨率測定。耗氧率、排氨率試驗在5 L玻璃缸中進行，試驗用水為提前曝氣的自來水3 L，用NaCl(AR)進行鹽度調(diào)節(jié)，水溫為(22±1)℃，每個平行放5只幼蚌，用保鮮膜封口，試驗用時2 h。采用室內(nèi)靜水法測定試驗前后空白對照組與試驗組水中溶解氧、氨氮含量。溶解氧的測定采用Winkler碘量法(執(zhí)行標準ISO 5813—1983)，氨氮的測定采用納氏試劑分光光度計法(執(zhí)行標準HJ 535—2009)。試驗結(jié)束后，將試驗蚌軟組織取出，于65 ℃烘箱中烘至恒重，記錄軟體部干質(zhì)量(g)。耗氧率[mg/(g·h)]和排氨率[μmol/(g·h)]計算公式分別為

耗氧率=(DO0-DOt)×V/(W×t)，

(1)

排氨率=(Nt-N0)×V/(W×t)。

(2)

其中：DO0、DOt分別為試驗結(jié)束時空白組和試驗組水中溶解氧的含量(mg/L)；N0、Nt分別為試驗結(jié)束時空白組和試驗組水中氨氮的濃度(μmol/L)；V為試驗用水的體積(L)；W為橄欖蟶蚌軟體部干質(zhì)量(g)；t為試驗用時(h)。

2)攝食率和濾水率測定。試驗在5 L玻璃缸中進行，試驗用水為提前曝氣的自來水3 L，水溫為(22±1)℃，每個平行放5只幼蚌并投喂密度為1.7×109個/mL的破壁微擬球藻0.5 mL，微充氣使藻液均勻分布，試驗用時2 h。經(jīng)預(yù)試驗可知，在此餌料密度下橄欖蟶蚌不產(chǎn)生假糞。試驗結(jié)束時，使用GF/C玻璃纖維濾膜(孔徑0.45 μm)測定試驗前后試驗組和空白對照組水體中總顆粒物(TPM)、顆粒有機物(POM)含量。攝食率[mg/(g·h)]和濾水率[L/(g·h)]計算公式為

攝食率=(C0-Ct)×V/(W×t)，

(3)

濾水率=V×ln(C0/Ct)/(W×t)。

(4)

其中：C0、Ct分別是試驗結(jié)束時空白組、試驗組水體中的餌料濃度(mg/L)；V為試驗用水的體積(L)；W為橄欖蟶蚌軟體部干質(zhì)量(g)；t為試驗用時(h)。

3) 排糞率和吸收效率測定。攝食2 h后，將幼蚌轉(zhuǎn)移至不添加藻液的曝氣自來水中，收集24 h內(nèi)的幼蚌糞便，計算糞便的顆粒有機物和橄欖蟶蚌軟體部干質(zhì)量(g)。吸收效率(%)和排糞率[mg/(g·h)]計算公式分別為

吸收效率=(F′-E′)/[(1-E′)×F′]×100%，

(5)

排糞率=攝食率×(1-吸收效率)。

(6)

其中：E′和F′分別為糞便、餌料中無灰分干質(zhì)量的比例，即E′=W1/W2，W1=W65 ℃-W450 ℃，W2=W65 ℃-W0，W65 ℃為水樣經(jīng)過GF/C玻璃纖維濾紙過濾后，在65 ℃烘箱中烘干至恒重所得的質(zhì)量(g);W450 ℃為W65 ℃樣品經(jīng)馬弗爐450 ℃灼燒8 h，冷卻后稱得的質(zhì)量(g)，W0為GF/C玻璃纖維濾紙使用前在馬弗爐450 ℃灼燒8 h，冷卻后稱得的質(zhì)量(g)，F(xiàn)′計算方法同E′。

1.2.4 能量收支方程的計算 能量收支方程為

C=F+R+U+P。

(7)

其中：C為攝食能；F為排糞能；R為呼吸能；U為排泄能；P為生長能。單位均為焦耳(J)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽度脅迫對幼蚌存活率的影響

從圖1可見：鹽度為2.00時，幼蚌在72 h時開始出現(xiàn)死亡，96 h的存活率為95.56%；而其他鹽度組(3.31、3.70、4.24、4.92、5.82、7.00)均出現(xiàn)不同程度的死亡現(xiàn)象，幼蚌存活率隨脅迫時間的延長和鹽度的增大呈下降趨勢；在鹽度為7.00時，48 h的幼蚌全部死亡。以線性回歸法得到幼蚌96 h LC50鹽度為4.47。

圖1 不同鹽度脅迫對橄欖蟶蚌幼蚌存活率的影響Fig.1 Effects of salinity stress on the survival rate of juvenile freshwater mussel Solenaia oleivira exposed to different salinities

2.2 高鹽度脅迫對幼蚌耗氧率和排氨率的影響

從表1可見，選擇96 h LC50的50%鹽度(2.23)作為可馴化高鹽度，在此鹽度脅迫下，幼蚌耗氧率和排氨率均較淡水組顯著升高(P<0.05)。

表1 不同鹽度下橄欖蟶蚌幼蚌的耗氧率和排氨率

2.3 高鹽度脅迫對幼蚌攝食率和濾水率的影響

從表2可見，高鹽度(2.23)脅迫下，幼蚌攝食率和濾水率均較淡水組顯著升高(P<0.05)。

表2 不同鹽度下橄欖蟶蚌幼蚌的攝食率和濾水率

2.4 高鹽度脅迫對幼蚌排糞率和吸收效率的影響

從表3可見，高鹽度(2.23)脅迫下，幼蚌的排糞率較淡水組顯著升高(P<0.05)，而吸收效率則較淡水組略有下降(P>0.05)。

表3 不同鹽度下橄欖蟶蚌幼蚌的排糞率和吸收效率

2.5 高鹽度脅迫對幼蚌能量收支的影響

從表4可見，高鹽度(2.23)脅迫下，幼蚌攝食能、呼吸能、排泄能和排糞能均顯著增加(P<0.05)，生長能反而顯著下降(P<0.05)。根據(jù)各種能量占攝食能的比例，建立淡水狀態(tài)和高鹽度應(yīng)激下的能量收支方程(表5)，從能量收支方程中可見，與淡水狀態(tài)下相比，鹽度為2.23時，呼吸能、排泄能、排糞能占比均升高，生長能占比卻下降。

表4 不同鹽度下橄欖蟶蚌幼蚌的能量收支Tab.4 Energy budget of juvenile freshwater mussel Solenaia oleivira exposed to different salinities J

表5 不同鹽度下橄欖蟶蚌幼蚌的能量收支方程

3 討論

3.1 高鹽度對橄欖蟶蚌幼蚌存活的影響

鹽度是影響水生生物生長和存活的重要環(huán)境因子。從容[13]研究了鹽度與殼長約4 cm的三角帆蚌Hyriopsiscumingii幼蚌生長的關(guān)系，結(jié)果顯示，鹽度為0.15～1.50時較適宜生長，當鹽度超過1.5時生長率明顯下降，致死鹽度為3～5。聞海波等[14]研究了鹽度對殼長小于1 cm的三角帆蚌稚蚌生理代謝的影響，結(jié)果顯示，鹽度為2的試驗液對兩種規(guī)格稚貝的生理活動造成了明顯影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為0～2.00時，橄欖蟶蚌幼蚌存活率較高，鹽度為7.00時48 h內(nèi)全部死亡，96 h的半致死鹽度為4.47，這說明橄欖蟶蚌幼蚌對鈉鹽的耐受性較差，養(yǎng)殖幼蚌的水體鹽度最好不要超過2.00。橄欖蟶蚌存活率隨著鹽度脅迫時間延長和強度增加呈顯著下降趨勢，可能是因為隨鹽度脅迫時間延長和強度增加，貝類用于調(diào)節(jié)滲透壓的能量增加，從而影響到存活率。

適當?shù)柠}度改變可以促進魚類攝食和生長，并改變魚肉風(fēng)味，但鹽度變化太大則會產(chǎn)生不利影響[15]。許多淡水魚類經(jīng)逐步馴化可適應(yīng)高鹽度環(huán)境，如虹鱒、硬頭鱒[15]在鹽度為30的水體中成活率分別在70%、75%以上。但不同馴化方式會影響水產(chǎn)動物在高鹽度水體中的存活率，急性鹽度脅迫可使馬來西亞紅羅非魚在高鹽度下全部死亡，而緩慢鹽度馴化可使其適應(yīng)較高的鹽度[16]。本試驗中，橄欖蟶蚌幼蚌成活率是在急性鹽度脅迫下測得的，推測如果對幼蚌進行慢性鹽度脅迫，其耐鹽性和成活率可能會有所提高，但有待進一步研究證實。

3.2 高鹽度對橄欖蟶蚌呼吸代謝的影響

貝類是變滲透壓動物，當外界環(huán)境鹽度發(fā)生變化時，貝類會調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓與環(huán)境相適應(yīng)。但適量的鹽度變化可以縮小貝類體內(nèi)與環(huán)境間的滲透壓差值，從而減少維持滲透壓而損失的能量，起到促進生長的作用[14]。劉鵬遠等[17]研究了鹽度對福壽螺Pomaceacanaliculata耗氧率和排氨率的影響，結(jié)果顯示，在一定鹽度范圍內(nèi)，鹽度升高會導(dǎo)致耗氧率和排氨率增加，但超過一定范圍，會導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)分解供能，福壽螺出現(xiàn)應(yīng)急響應(yīng)，致使耗氧率和排氨率下降。孫陸宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，中華圓田螺Cipangopaludinacathayensis和銅銹環(huán)棱螺Bellamyaaeruginosa在鹽度為1.8時的耗氧率和排氨率均高于鹽度為0.3時。與福壽螺和中華圓田螺的研究結(jié)果一致，本研究顯示，在鹽度為2.23時，橄欖蟶蚌幼蚌的耗氧率和排氨率較淡水組均顯著升高，呼吸代謝速率加快。這是因為鹽度改變了機體的滲透壓平衡，生物體需要消耗更多的能量來調(diào)節(jié)滲透壓，從而導(dǎo)致耗氧率和排氨率增加[18]。

3.3 高鹽度對橄欖蟶蚌攝食代謝的影響

鹽度是影響貝類生理活動的重要環(huán)境因子。有研究認為，鹽度可以影響貝類附著力、鰓纖毛運動和心臟跳動等，進而影響其生理代謝[19]。呂昊澤等[20]研究發(fā)現(xiàn)，河蜆Corbiculafluminea在鹽度為0～5的條件下，攝食活動狀態(tài)最佳，當鹽度超過10時，其攝食率、濾水率顯著下降，吸收效率雖有下降但無顯著性差異。林楠等[21]對三角帆蚌攝食率的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為1.5時三角帆蚌攝食率達到最大，當鹽度超過2.0時，其攝食率明顯下降。與上述研究結(jié)果基本一致，本研究顯示，鹽度2.23對橄欖蟶蚌幼蚌攝食活動產(chǎn)生明顯刺激，此時鹽度組的攝食率、濾水率和排糞率均顯著高于淡水組，吸收效率則較淡水組略有下降。這是因為大多數(shù)貝類對于鹽度刺激具有一定的適應(yīng)性，在一定范圍內(nèi)攝食率和濾水率等會隨鹽度升高而上升，當達到某一鹽度值時，貝類會關(guān)閉進出水管或者關(guān)閉貝殼，與外界不良環(huán)境隔開，從而導(dǎo)致攝食率和濾水率下降[22]。

3.4 高鹽度對橄欖蟶蚌幼蚌能量收支的影響

鹽度也是影響橄欖蟶蚌能量收支的重要因子。張碩等[23]對中國對蝦Penaeuschinensis研究表明，隨鹽度的升高，排糞碳占攝食碳比例增大。章承軍等[24]對縊蟶Sinonovaculaconstricta研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽度的升高，縊蟶攝食能增大，但生長能占攝食能比例反而下降。與上述研究結(jié)果一致，本研究顯示，攝食能、呼吸能和排糞能均隨鹽度的升高而增大，呼吸能和排糞能占攝食能比例也增大，而生長能占攝食能比例卻下降。這是因為雖然攝食能隨鹽度升高而增大，但飼料利用率下降，導(dǎo)致排糞能增大，生長能減少。胡先成等[25]對饑餓狀態(tài)下的河川沙塘鱧Odontobutispotamophila研究發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧在鹽度大于或等于3時，損失的能量要高于淡水組。本研究表明，在鹽度為2.23條件下，橄欖蟶蚌幼蚌生長能的占比明顯降低，在此鹽度下幼蚌消化吸收的能量大多用于維持自身生理代謝的需要，故導(dǎo)致生長緩慢，甚至出現(xiàn)死亡。因此，如果要在NaCl型鹽堿地養(yǎng)殖橄欖蟶蚌，應(yīng)選擇鹽度小于2.23的區(qū)域，或者對鹽堿地或灘涂水質(zhì)進行鹽度淡化改良，使鹽度保持在適宜生長的范圍內(nèi)，養(yǎng)殖過程中也應(yīng)注意水體鹽度變化，防止因鹽度過高而引起稚蚌和幼蚌生長緩慢甚至死亡。當然，這里僅就鹽度而言，水型的影響因素，以及水型和鹽度的協(xié)同效應(yīng)還有待進一步研究。

生長能是指貝類用于生長的能量，對于幼體來說表現(xiàn)為體質(zhì)量和殼長的增加，而對于成體來說生長能還包括用于生殖的能量。在實驗室條件下，當所有有關(guān)生理過程如攝食、消化吸收和呼吸排泄等均已確定，且換算成能量后即可估算出貝類的生長能。在貝類能量收支研究中，關(guān)于生長能的計算方法主要有兩種：一種是根據(jù)吸收能減去呼吸能和排泄能得到[26]；另一種是由攝食能減去呼吸能、排泄能和排糞能得到[27]。由于兩種方法的生長能均是根據(jù)公式差減法所得，因此，其他測定參數(shù)的誤差集中體現(xiàn)在生長參數(shù)中，導(dǎo)致生長能誤差較大。而在魚類[28]和蝦蟹類[29-30]能量收支中，生長能的計算常采用試驗后生物體所含能量減去試驗前生物體所含能量，測定方法多以氧彈式熱量儀或者自動熱量儀測量試驗前后魚或蝦蟹類生物體所含能量。這種方法較能量收支公式差減法所得誤差較小，但目前在貝類能量收支中應(yīng)用較少，以后的研究中可以考慮將該種方法引入貝類能量收支方程中以減小生長能誤差。

4 結(jié)論

1)鹽度對橄欖蟶蚌幼蚌存活率具有顯著影響，在鹽度為0～2.00時幼蚌存活率較高，鹽度為7.00及以上時幼蚌全部死亡，這說明幼蚌對急性鈉鹽脅迫的耐受性較差。

2)鹽度為2.23時，會使橄欖蟶蚌幼蚌耗氧率、排氨率、攝食率、濾水率和排糞率顯著增大，但對吸收效率無顯著性影響。這導(dǎo)致橄欖蟶蚌幼蚌呼吸、排泄和排糞能占攝食能比例增大，生長能占比減小，不利于幼蚌生長。因此，養(yǎng)殖橄欖蟶蚌的NaCl型鹽堿地、灘涂應(yīng)選擇鹽度小于2.23的水域，或者對鹽堿地、灘涂水質(zhì)進行淡化改良后再養(yǎng)殖。