李文婭， 彭 展， 郭柑彤， 何 濤， 劉揚(yáng)科， 吳金梅

（1.中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司，河南 林州 456550；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046）

抗生素在畜牧養(yǎng)殖中不僅用于治療疾病，而且用于預(yù)防，并作為促生長劑廣泛使用，導(dǎo)致耐藥菌及殘留的抗生素通過肉類攝入和處理傳播給人類，食品安全問題成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)（Tiseo等，2020）。2021年12月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布《“十四五”全國畜牧獸醫(yī)行業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，明確提出加快研發(fā)推廣抗生素替代品的重點(diǎn)任務(wù)，因此，開發(fā)新型飼料添加劑替代飼用抗生素成為研究熱點(diǎn)。

抗菌肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽物質(zhì)，因具有熱穩(wěn)定性高、水溶性好、相對(duì)分子質(zhì)量小且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)逐步成為抗生素替代品的選擇之一。自1980年瑞典科學(xué)家G.Boman等在天蠶蛹體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗菌多肽并命名為天蠶素后，人們相繼從細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物乃至人體中均發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有抗菌活性的多肽，其中已有70多種抗菌多肽的結(jié)構(gòu)被測定（甄陽光，2018；尚田田等，2013）。目前已知抗菌肽的作用機(jī)制與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密切相關(guān)，因AMPs帶正電荷，而細(xì)菌細(xì)胞膜上的LTA、TA、LPS及LPG帶負(fù)電荷，二者以靜電作用相互結(jié)合，然后AMPs的疏水端嵌入細(xì)菌磷脂雙分子層中，擾亂細(xì)菌雙分子層中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等組分原有的排列順序，形成“桶板”“地毯”和“環(huán)形孔”等模型的跨膜通道，最終導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)外漏而死亡（甄陽光，2018；Chan等，2006）。而宿主正常細(xì)胞是真核細(xì)胞，其主要由鞘磷脂、中性磷脂和膽固醇等不帶電荷的物質(zhì)組成，而且磷脂雙分子層更加穩(wěn)固，不易形成膜通道，因此不能與帶正電荷的AMPs結(jié)合（Findlay等，2010）。這也說明了AMPs作為飼料添加劑的安全性。吳東（2020）等研究表明，在飼糧中添加不同比例的抗菌肽對(duì)肉雞的生長性能及腸道菌群等指標(biāo)都有一定程度的改善。郭森（2016）等研究表明，抗菌肽在飼糧中使用能顯著增加愛拔益加（AA）肉雞的生長性能、改善腸道菌群等。

本試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌代謝物是由枯草芽孢桿菌YT168-6表達(dá)的含有37個(gè)氨基酸殘基的抗菌肽，故命名為枯草三十七肽?？咕牟粌H結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而且對(duì)高溫、酸堿、胃蛋白酶、胰蛋白酶具有良好的抵抗力（Garcia等，2014）。但關(guān)于抗菌肽對(duì)肉雞腸道健康的報(bào)道甚少，因此本試驗(yàn)在飼糧中添加枯草芽孢代謝物，研究其對(duì)肉雞生長性能、腸道組織形態(tài)及盲腸微生物多樣性的影響，從而為指導(dǎo)飼料企業(yè)使用最優(yōu)的無抗方案提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 枯草芽孢代謝物（枯草三十七肽）由中農(nóng)穎泰林州生物科園有限公司提供?？莶菅挎邨U菌活菌數(shù)≥2.0×1010cfu/g，為市場購買。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取1日齡體重相近[（37.10±0.10）g]的快大型白羽肉雞612只，隨機(jī)分為3個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)34羽肉雞。對(duì)照組（CG）在基礎(chǔ)飼糧中添加200 g/t枯草芽孢桿菌，試驗(yàn)組1（EG1）、試驗(yàn)組2（EG2）分別在基礎(chǔ)飼糧中添加150、200 g/t枯草芽孢代謝物（枯草三十七肽）。采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T33-2004）配制，具體原料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)在遼寧省鞍山市海城市某肉雞養(yǎng)殖小區(qū)進(jìn)行，采用三層立體籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)17只雞。飼養(yǎng)過程中安排專人負(fù)責(zé)，溫濕度、光照、通風(fēng)、免疫、消毒等按照試驗(yàn)場常規(guī)管理進(jìn)行，藥物預(yù)防與治療均按照試驗(yàn)場要求進(jìn)行。試驗(yàn)期間，進(jìn)行健康觀察，做好記錄，試驗(yàn)期42 d。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定 在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)稱量并記錄各處理組肉雞的體重，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期內(nèi)各組肉雞的采食量，計(jì)算出欄均重、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料肉比（FCR）及歐洲效益指數(shù)（EPI）。

1.4.2 腸道組織形態(tài)學(xué)觀察 在42 d時(shí)，從每個(gè)重復(fù)抽取1只體重相近的肉雞，處死解剖后，剪取3~5 cm的空腸、回腸和盲腸腸段，放入10%中性福爾馬林溶液充分固定后，橫向采集樣品管腔結(jié)構(gòu)約0.5 cm長的組織放入包埋盒中繼續(xù)固定24 h。將固定完全的組織進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、切片烤片后，用蘇木精-伊紅（H&E）染色法染色，晾干后的切片置于Motic數(shù)字切片掃描儀下進(jìn)行掃描拼接，生成一張全視野的數(shù)字化切片后，使用軟件DSAssistant Lite進(jìn)行組織學(xué)觀察，選擇合適的物鏡倍數(shù)采集圖片，再使用軟件Motic Images Plus 3.0分別測量每張圖片中的腸道絨毛高度和隱窩深度，測量時(shí)每個(gè)樣品選取3個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)至少3個(gè)數(shù)據(jù)，并計(jì)算腸絨毛高度與隱窩深度的比值（V/C）。

1.4.3 盲腸微生物指標(biāo)測定 在42 d時(shí)，從每個(gè)重復(fù)抽取1只體重相近的肉雞，處死后迅速解剖，分離出盲腸，立即在無菌條件下將其內(nèi)食糜取出放入無菌離心管，液氮保存。

1.4.3.1 DNA提取和16S rRNA測序 將盲腸內(nèi)容物用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]按照說明書進(jìn)行總基因組DNA的提取，再用酶標(biāo)儀進(jìn)行濃度檢測，用1.8%的瓊脂糖對(duì)其完整性進(jìn)行電泳檢測。用V338F和V806R通用引物對(duì)基因組總DNA的16S rRNA的V3~V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測，混勻后用Monarch DNA Gel Extraction（北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司）進(jìn)行純化回收，使用TruePrepRDNA Library Prep Kit V2（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行文庫構(gòu)建，建好的文庫通過Qseq-400方法進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測序。

1.4.3.2 測序結(jié)果處理及分析 基于Illumina Novaseq測序平臺(tái)，構(gòu)建以雙末端測序的方法對(duì)小片段文庫進(jìn)行測序。通過對(duì)Reads拼接過濾，聚類或去噪，豐度分析及物種注釋等操作，從而揭示樣品物種的構(gòu)成。再進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析等，從而挖掘樣品之間的差異。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，方差分析用one-way ANOVA進(jìn)行，組間多重比較用Duncan’s法進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理對(duì)肉雞生長性能的影響 由表2可知，EG1的出欄均重和ADG與CG之間沒有顯著差異（P>0.05）；EG2的出欄均重和ADG顯著高于CG（P<0.05）。3組之間ADFI和FCR差異不顯著（P>0.05）。CG和EG1的EPI無顯著差異（P>0.05），且均顯著低于EG2（P<0.05）。

表2 各處理對(duì)肉雞生長性能的影響

2.2 各處理對(duì)肉雞腸道組織形態(tài)的影響 由表3可以看出，與CG相比，EG1和EG2的空腸絨毛高度顯著提高（P<0.05），回腸和盲腸的絨毛高度無顯著性差異（P>0.05），空腸、回腸和盲腸的隱窩深度差異不顯著（P>0.05）。EG1的空腸、回腸和盲腸V/C與CG相比，均有不同程度的提高，分別提高了17.01%、9.69%和59.19%（P>0.05）；EG2的空腸V/C顯著高于CG（P<0.05），回腸和盲腸分別提高了18.64%和55.14%（P>0.05）。

表3 各處理對(duì)肉雞腸道組織形態(tài)的影響

2.3 各處理對(duì)肉雞盲腸微生物組成及多樣性的影響

2.3.1 門水平 從圖1可以看出，42 d肉雞盲腸微生物門水平相對(duì)豐度前10位的微生物，以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其次分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變 形 菌 門（Proteobacteria）、藍(lán) 藻 菌 門（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門 （Actinobacteria）等，均以Firmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢菌門，占總數(shù)的80%以上。

圖1 42 d肉雞門水平上前10位盲腸微生物相對(duì)豐度柱形圖

2.3.2 科水平 由圖2可以看出，42 d肉雞盲腸微生物科水平相對(duì)豐度前15位的微生物，包含了瘤胃球菌科 （Ruminococcaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、理 研 菌 科（Rikenellaceae）、苜蓿 科（Christensenellaceae）、乳 酸 細(xì) 菌 科（Lactobacillaceae）、 梭 菌 目 （Clostridiales_vadinBB60_group）、未分類嗜氣性胃腺桿菌目（uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和擬桿菌科（Bacteroidaceae）等。與CG相比，EG1和EG2的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相對(duì)豐度均明顯增加，且EG1和EG2的盲腸微生物在科水平上的分布更相似。

圖2 42 d肉雞科水平上前15位盲腸微生物相對(duì)豐度柱形圖

2.3.3 屬水平 從圖3可以看出，42 d肉雞盲腸微生物屬水平相對(duì)豐度前25位的微生物，其中主要是瘤胃球菌科（Ruminococcaceae_UCG-014）、鞘脂單胞菌屬（Subdoligranulum）、未分類毛螺菌科 （uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae）、擬桿菌屬（Alistipes）、苜?？疲–hristensenellaceae_R-7_group）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等，占群落總數(shù)的85%以上。與CG相比，EG1的Ruminococcaceae_UCG -014、Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group的相對(duì)豐度增加，Alistipes和uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae相對(duì)豐 度 降 低，EG2的Subdoligranulum、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae和Eubacterium coprostanoligenes group相對(duì)豐度增加，Lactobacillus和Faecalibacterium相 對(duì) 豐 度 降 低。EG1和EG2對(duì) 比 得 出，EG1中Ruminococcaceae_UCG-014，Christensenellaceae_R-7_group和Lactobacillus相對(duì)豐度高于EG2，而Subdoligranulum和Alistipes的相對(duì)豐度相反。

圖3 42 d肉雞屬水平上前30位盲腸微生物相對(duì)豐度柱形圖

2.3.4 α多樣性 由表4可以看出，三個(gè)處理組42 d肉 雞 盲 腸 微 生 物 的ACE、Chao1、Simpson、Shannon指數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，展示了CG和EG的α多樣性結(jié)果。其中，前兩個(gè)指標(biāo)衡量物種豐度，后兩個(gè)指標(biāo)衡量物種多樣性（Grice等，2009）。結(jié)果顯示，各組肉雞的ACE、Chao1指數(shù)差異不顯著（P>0.05），說明三組物種豐度差異不顯著，三組的Shannon指數(shù)差異不顯著（P>0.05），而EG1的Simpson指數(shù)顯著高于CG（P<0.05），EG2與其他兩組無顯著性差異（P>0.05），說明EG1的物種多樣性顯著高于CG，而EG2與CG物種多樣性差異不顯著。

表4 各處理的42 d肉雞盲腸微生物α多樣性分析

2.3.5 β多樣性 圖4是42 d肉雞盲腸微生物的PCoA聚類圈分析圖，屬于β多樣性指標(biāo)之一，用來研究樣本群落組成的相似性或相異性（Wang等，2012）。從圖中可以看出，三個(gè)處理組的微生物群落有部分相似，且EG1和EG2的物種組成和群落結(jié)構(gòu)相似度更高。

圖4 樣品PCoA聚類圈分析圖

3 討論

3.1 枯草三十七肽對(duì)肉雞生長性能的影響 生長性能是畜禽養(yǎng)殖中重要的指標(biāo)之一，不僅與經(jīng)濟(jì)價(jià)值有密切關(guān)系，而且是相關(guān)添加劑是否能替代抗生素的評(píng)價(jià)指標(biāo)。歐洲效益指數(shù)（EPI）是一個(gè)綜合評(píng)價(jià)生長性能的指標(biāo)，跟肉雞體重、成活率、料肉比及出欄日齡均有聯(lián)系，指數(shù)越大，說明盈利越高。研究表明，抗菌肽有提高動(dòng)物生長性能的作用。孫全友（2014）等研究表明，飼糧中添加200 g/t抗菌肽能顯著降低肉雞料肉比，顯著提高體重。苗旭（2020）等試驗(yàn)結(jié)果也表明，飼糧中添加抗菌肽能提高肉雞生長性能，降低腹瀉率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高出欄均重、ADG和EPI，提高肉雞生長性能，與上述報(bào)道結(jié)果一致。

3.2 枯草三十七肽對(duì)肉雞腸道組織形態(tài)的影響腸道形態(tài)可以衡量機(jī)體腸道的健康狀況（Csernus等，2020），其絨毛高度直接決定機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，隱窩深度反映細(xì)胞生成率，隱窩深度增加則提示腸道對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力減弱。絨毛高度/隱窩深度（V/C）則綜合反映了腸道功能狀態(tài)，比值上升，表示黏膜改善，吸收能力增強(qiáng)，動(dòng)物生長加快（Chamorro等，2019）。張凱瑛（2021）在飼糧中添加300 mg/kg或500 mg/kg抗菌肽，結(jié)果顯著提高了42 d肉雞小腸各腸段絨毛高度，顯著降低回腸的隱窩深度，顯著提高了空腸和回腸的V/C。王建（2019）等研究結(jié)果顯示，飼糧中添加抗菌肽Api-PR19能顯著提高21 d肉雞的空腸和42 d十二指腸的絨毛高度和V/C。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高空腸絨毛高度和V/C，對(duì)回腸和盲腸的絨毛高度和V/C也有不同程度的提高。這一結(jié)果說明飼糧中添加枯草三十七肽在一定程度上改善了肉雞腸道形態(tài)的發(fā)育，從而促進(jìn)肉雞健康生長。

3.3 枯草三十七肽對(duì)肉雞盲腸微生物組成及多樣性的影響 腸道微生物菌群的平衡能夠保證畜禽的健康生長，尤其是畜禽的盲腸內(nèi)存在大量微生物，與畜禽的免疫、消化吸收等有著密切的聯(lián)系。研究表明，益生菌和抗菌肽均可抑制有害菌，增加有益菌數(shù)量，改善腸道微生物環(huán)境（易中華等，2005）。白建（2014）等研究表明，抗菌肽降低了盲腸內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，增加了乳酸菌的數(shù)量，且與海藻粉存在協(xié)同效應(yīng)。研究顯示，肉雞門水平的優(yōu)勢菌群是Firmicutes和Bacteroidetes，占微生物群落總數(shù)的80%以上，其在能量的產(chǎn)生和代謝中起著重要作用（Pandit等，2018；Oakley等，2014）。在本研究中，試驗(yàn)組和兩個(gè)對(duì)照組的肉雞盲腸微生物在門水平上的相對(duì)豐度沒有顯著差異，群落的優(yōu)勢菌門是Firmicutes，與報(bào)道一致。在本研究中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的Ruminococcaceae和Lachnospiraceae相對(duì)豐度明顯升高，二者含有產(chǎn)短鏈脂肪酸（SCFAs）的科，SCFAs抑制腸道致病菌生長繁殖的方式是通過影響腸道酸堿度，從而為肉雞良好的生長性能提供了前提，其中，Ruminococcaceae可能與試驗(yàn)組肉雞平均日增重的提高有關(guān)（Zeng等，2019；Nava等，2011）。試驗(yàn)組的Blautia相對(duì)豐度高于對(duì)照組，Blautia能降解不同類型的碳酸化合物，產(chǎn)生乙酸、乳酸等代謝產(chǎn)物，其含量的增加與宿主腸道健康有關(guān)（Abaidullah等，2019；Yang等，2016；Liu等，2008）。

腸道微生物多樣性影響動(dòng)物消化吸收，常用α多樣性和β多樣性表示。其中，α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性（Grice等，2009），β多樣性比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度，可通過多種指標(biāo)反映，PCoA分析是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或相異性（Gower等，1966）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加枯草三十七肽能顯著提高盲腸α多樣性的物種多樣性，與朱隨亮（2021）等研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

飼糧中添加枯草三十七肽可顯著增加肉雞出欄均重、平均日增重和歐洲效益指數(shù)，提高腸道絨毛高度和絨隱比，改善盲腸微生物多樣性，增強(qiáng)肉雞的消化吸收能力，從而提高肉雞的生長性能，改善腸道健康。