盧 翔，張翔宇，李 晨

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

谷子（Setaria italicaL.）脫皮后即為小米，又名粟米。小米在山西省的種植面積大，位居全國第一[1]。小米糠是小米加工過程中的主要副產(chǎn)物，小米糠的蛋白營養(yǎng)價值較高，易于人體吸收且致敏性低[2]，但是目前我國小米糠主要應(yīng)用于飼料行業(yè)，其價值尚未得到充分開發(fā)。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過消化道的酶解作用，蛋白質(zhì)最終大多以小肽的形式被吸收[3]。某些小肽（一般含有2～20個氨基酸殘基）有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、降血壓、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等[4]。這些活性肽具有重要的生理功能，對人體產(chǎn)生的有益影響遠超過其原本的營養(yǎng)價值。因此，生物活性肽的篩選與開發(fā)日益引起關(guān)注。已有報道，植物來源的生物活性肽大多來自小麥、大豆、大米以及小米等谷物[5]。于坤弘等[6]使用全脂鈍化后的米糠為原料，通過酶解制備了米糠多肽。于國萍等[7]用風味蛋白酶與木瓜蛋白酶酶解制備米糠蛋白肽，通過進一步分離與純化，得到了較為單一的抗氧化多肽。于書佳等[8]用菠蘿蛋白酶水解谷糠得到的多肽可抑制S180、H22腫瘤細胞的增殖。HE等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小米糠多肽可通過調(diào)控核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路發(fā)揮體內(nèi)外抗炎活性，減輕LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞炎癥。目前對小米糠抗氧化肽的生物活性及分子作用機制報道較少。因此，利用小米糠蛋白生產(chǎn)新型的生物活性多肽，探索其抗氧化活性及機制，具有重要的研究意義。

近年來，老齡化問題日益突出，如何安全有效地延緩衰老引起人們廣泛關(guān)注，從飲食來源的材料中尋找抗衰老物質(zhì)具有重要前景。基于自由基衰老理論，外源天然抗氧化劑的篩選十分必要。目前，分子對接技術(shù)被廣泛應(yīng)用于篩選酶抑制劑和預(yù)測配體與受體之間分子相互作用[10]。髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是參與人體氧化損傷的一種酶，可以刺激氧化應(yīng)激，與動脈粥樣硬化、心血管病等有關(guān)。SOLO等[11]采用MOE 09對設(shè)計的藥物與MPO進行分子對接，以MPO為受體，當配體能夠與其活性位點相結(jié)合時，可以抑制MPO活性，減少機體損傷。VAN DER DOES等[12]研究發(fā)現(xiàn)了能與MPO特異性結(jié)合并且起到免疫調(diào)節(jié)作用的一種多肽hLF1-11（GRRRRSVQWCA）。HE等[13]進一步以hLF1-11為參照物通過分子對接的方法從壺腹草中發(fā)現(xiàn)了另一種潛在的抑制MPO活性的多肽。因此，本研究選擇MPO作為蛋白受體，尋找能與其活性口袋特異性結(jié)合的小米糠多肽配體，從而抑制MPO活性，提高機體抗氧化能力。

本研究利用堿性蛋白酶對小米糠蛋白進行酶解、超濾后得到不同分子質(zhì)量的多肽，通過檢測對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除率，研究其體外抗氧化性。進一步檢測了小米糠多肽對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）壽命的影響，并結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用和分子對接技術(shù)，預(yù)測谷糠蛋白中具有抗氧化活性的肽序列，旨在為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的綜合利用和小米糠多肽的功能食品研發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

小米糠為市售。Folin-酚、堿性蛋白酶、ABTS購自北京索萊寶科技有限公司；DPPH購自東京化成工業(yè)株式會社；胰蛋白胨、酵母提取物、膽固醇購自生工生物工程（上海）有限公司；其余試劑均為分析純。

TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用公司；pH計，上海安萊立思儀器科技有限公司；HC-2518高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；AR124CN電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；體式顯微鏡，重慶奧特光學(xué)顯微鏡有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小米糠多肽的制備小米糠粉用丙酮脫脂處理（料液比為1∶3）后抽濾，晾干。稱取50 g脫脂谷糠加入500 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至9.0，攪拌提取2 h后，11 000 r/min 4℃離心20 min，收 集 上 清 液，用1 mol/L HCl調(diào)pH值 至4.0，11 000 r/min 4℃離心20 min，取沉淀得到小米糠蛋白。

配制小米糠蛋白溶液（10 mg/mL，pH值8.0），加入堿性蛋白酶（8 000 U/g），50℃酶解2 h后沸水浴加熱5 min進 行 滅 活，12 000 r/min離心10 min取上清得到小米糠多肽[14]。分別用截留分子質(zhì)量為3、10 ku的超濾管對小米糠多肽進行分離，得到不同大小的多肽組分，即MW＜3 ku、3 ku＜MW＜10 ku和MW＞10 ku共3個組分，用福林酚法測定多肽含量。采用牛血清白蛋白作為標準蛋白，繪制標準曲線。

1.2.2 體外抗氧化試驗將3個組分的小米糠多肽配成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL的樣品溶液，通過ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基清除試驗測定其體外抗氧化活性。

ABTS自由基清除試驗：取2 mL ABTS和2 mL K2S2O8混合，避光靜置12 h后，用乙醇稀釋40倍得到ABTS+反應(yīng)液。將0.2 mL樣品溶液和1.8 mL ABTS+反應(yīng)液均勻混合，反應(yīng)10 min后測定734 nm處吸光度值，記為A1。用等體積蒸餾水代替樣品作為對照組，其734 nm處吸光度值記為A2。

DPPH自由基清除試驗：將0.6 mL小米糠多肽溶液與1.4 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液室溫反應(yīng)30 min后測517 nm波長下吸光度值（A1）。用同體積的蒸餾水代替樣品作為對照組，其517 nm吸光度值記為A2。

·OH清除試驗：向300 μL樣品溶液中依次加入300 μL 6 mmol/L水楊酸溶液、300 μL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液和300 μL 2%過氧化氫溶液，充分搖勻后避光靜置30 min，于510 nm處測定吸光度值，記為A1。以同體積蒸餾水代替樣品作為空白對照，其吸光度值記為A2。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲壽命試驗以O(shè)P50菌作為食物，在20℃下用NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲。線蟲同期化處理：將產(chǎn)卵期線蟲收集到離心管中，加入裂解液（1 g NaOH，5 mL 10% NaClO溶液，95 mL H2O）上下顛倒混勻，將離心管置于渦旋振蕩器上振蕩5 min后2 000 r/min離心l min。重復(fù)以上步驟至蟲體被裂解。用M9緩沖液清洗蟲卵上殘留的裂解液。將蟲卵于NGM培養(yǎng)基20℃培養(yǎng)，孵化后獲得同期化線蟲[17]，用于后續(xù)試驗。

參照郜鑫洋等[18]的方法，選用分子質(zhì)量小于3 ku的小米糠多肽組，設(shè)10、20、40 μg/mL共3個質(zhì)量濃度。用蒸餾水代替小米糠多肽溶液作為空白對照。待同期化處理后的線蟲生長到L4期后，將其轉(zhuǎn)移至含有大腸桿菌OP50和小米糠多肽的培養(yǎng)基中，各組30只，20℃培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)移日作為第0天，每天記錄線蟲的死亡數(shù)目，并將存活的線蟲移入新的培養(yǎng)皿。

將L4期的N2線蟲轉(zhuǎn)至小米糠多肽（20 μg/mL）涂布的NGM培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)。以同體積的無菌水代替小米糠多肽作為對照組。在第4天和第8天時，將其轉(zhuǎn)移至新的NGM培養(yǎng)基中，在體視顯微鏡下測線蟲30 s內(nèi)身體作正弦運動的次數(shù)及內(nèi)咽部收縮次數(shù)[19]，共統(tǒng)計10條蟲體。

1.2.4 肽的質(zhì)譜鑒定及分子對接采用LC-MS/MS對分子質(zhì)量小于3 ku的小米糠多肽組分進行鑒定（由上海生工完成）。樣品經(jīng)過C18柱脫鹽后，用離心濃縮儀將肽段溶液抽干。質(zhì)譜分析則使用Thermo公司的Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。樣品通過ULtiMate 3000 RSLCnano系統(tǒng)進行分離。液相的流速設(shè)置為300 nL/min。

利 用PeptideRanker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php）對質(zhì)譜鑒定的多肽段進行潛在的生物活性評分，所得分值越高，說明該肽的生物活性越大。當生物活性評分大于0.5時，可認為該肽是具有活性的肽。因此，本試驗以生物活性評分大于0.5的肽作為分析對象。

采用Autodock Vina 1.1.2[20]進行分子對接，以研究小米糠多肽與髓過氧化物酶之間的結(jié)合模式。MPO的三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：3F9P）從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載。運用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制了肽序列的二維結(jié)構(gòu)圖，并用ChemBio3D Ultra 14.0軟件將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)。使用AutoDockTools 1.5.6工具生成對接輸入文件。采取定義可旋轉(zhuǎn)鍵和合并非極性氫原子對配體進行處理。根據(jù)VINA對接分數(shù)選擇得分最高的結(jié)合方式，并使用PyMoL 1.7.6軟件（http://www.pymol.org/）進行可視化分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次。數(shù)據(jù)均用Excel和SPSS 26.0軟件單向方差分析（ANOVO）中的鄧肯多重比較進行顯著性差異分析（顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01）。使用Origin 2019軟件進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米糠多肽的抗氧化活性

從圖1可以看出，分子質(zhì)量不同的小米糠多肽均具有清除ABTS+的作用。隨著濃度提高，小米糠多肽對ABTS+的清除率提高，多肽質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，3個組分對ABTS+的清除能力都達到最高，MW＜3 ku，3 ku＜MW＜10 ku、MW＞10 ku組分分別為90.28%、87.52%、87.97%。

圖1 小米糠多肽的ABTS+、DPPH·、·OH清除能力Fig.1 ABTS+，DPPH·and·OH scavenging capacity of millet bran polypeptide

DPPH易溶于乙醇，溶液呈現(xiàn)紫紅色，當有抗氧化物質(zhì)存在時，溶液中的孤對電子能夠與DPPH自由基相結(jié)合，溶液當中的自由基含量會減少，從而導(dǎo)致溶液顏色變淺。由圖1可知，小米糠多肽具有DPPH自由基清除能力，對DPPH自由基的清除率隨著多肽濃度增加而升高；當多肽質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，MW＜3 ku、3 ku＜MW＜10 ku、MW＞10 ku組分的自由基清除能力分別為78.43%、75.56%、57.44%；MW＜3 ku和3 ku＜MW＜10 ku的多肽組分對DPPH自由基的清除能力高于MW＞10 ku組。

不同分子質(zhì)量的小米糠多肽均具有·OH清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，各組多肽對·OH的清除率升高；當多肽質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，MW＜3 ku、3 ku＜MW＜10 ku、MW＞10 ku組分的清除率分別為34.23%、20.77%、26.30%，MW＜3 ku組分多肽的清除率最高，MW＞10 ku組分次之。

以上結(jié)果表明，MW＜3 ku多肽組分在體外抗氧化性最好，其原因可能是由于隨著多肽水解程度加大，片段變小，有利于更多的活性位點暴露出來，從而表現(xiàn)出更好的抗氧化性。另外，通常相對分子質(zhì)量較低的多肽更容易通過腸道屏障發(fā)揮抗氧化能力[21]。因此，選用MW＜3 ku多肽進行線蟲壽命試驗。

2.2 小米糠多肽對線蟲壽命的影響

小米糠多肽對秀麗隱桿線蟲壽命的影響如圖2所示。

圖2 小米糠多肽對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.2 Effects of MBPEs on lifespan of C.elegans

壽命是研究老化的最直接指標，它可以被方便地進行觀察和統(tǒng)計，直觀地反映出藥物對線蟲的影響[22]。本試驗檢測了不同質(zhì)量濃度的MW＜3 ku小米糠多肽組分（Millet bran peptide fraction，MBPE）對秀麗隱桿線蟲壽命的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，3種質(zhì)量濃度的小米糠多肽處理組線蟲的生存曲線都發(fā)生了右移（圖2），表明小米糠多肽可延長線蟲壽命。對照組線蟲最長存活時間為20 d，試驗組為22 d。當MBPE質(zhì)量濃度為20、40 μg/mL時，線蟲平均壽命分別延長3.53、3.24 d，與對照組相比均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。線蟲最長壽命和平均壽命結(jié)果均顯示，一定濃度的小米糠多肽具有延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用。

通過線蟲運動能力、咽抽頻率研究了小米糠多肽MBPE對秀麗隱桿線蟲活力的影響，結(jié)果如圖3所示。在第4天時，20 μg/mL小米糠多肽（MW＜3 ku組分）試驗組線蟲30 s內(nèi)做正弦運動的次數(shù)是49.7，對照組為47.7，但二者間無顯著差異（P＞0.05）；在第8天時，試驗組線蟲30 s內(nèi)做正弦運動的次數(shù)是44.2，而對照組為34.7，且二者間存在顯著差異（P＜0.05），表明小米糠多肽可改善線蟲的運動性。

圖3 小米糠多肽對秀麗隱桿線蟲運動次數(shù)、咽抽頻率的影響Fig.3 Effects of MBPEs on times of exercise and pharyngeal pumping of C.elegans

由圖3可知，第4天時，30 s內(nèi)線蟲咽抽頻率的平均值為80.3，對照組為73.3，且二者間差異顯著（P＜0.05）；第8天時，試驗組和對照組30 s內(nèi)線蟲咽抽頻率的平均值分別為72.3和64.2，且二者間存在顯著差異（P＜0.05）。咽抽頻率提高表明小米糠多肽有利于改善線蟲的進食情況。壽命試驗、線蟲運動試驗和咽抽頻率檢測結(jié)果都表明，小米谷糠活性肽對線蟲的健康具有積極的促進作用。

2.3 分子對接情況分析

小米糠多肽分子對接情況如表1所示。

表1 小米糠多肽分子對接情況Tab.1 Molecular docking of millet bran polypeptide

為進一步研究小米糠多肽的組成及其與抗氧化性、延壽作用的關(guān)系，采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)對小米糠多肽進行了測序。通過PeptideRanker數(shù)據(jù)庫預(yù)測多肽生物活性，選取評分在0.5以上的多肽作為分析對象，共有93個小米糠多肽滿足評分條件。將生物活性評分高于0.5的小米糠多肽作為配體，以MPO（體內(nèi)氧化應(yīng)激的介質(zhì)和標志物）為受體，通過Autodock Vina 1.1.2進行分子對接。表1列舉了分子對接評分前9名的小米糠多肽和人乳鐵蛋白水解肽（human lactoferrin，hLF1-11）的氨基酸序列。已有研究表明[12]，hLF1-11能與MPO特異性結(jié)合并且起到免疫調(diào)節(jié)作用。由表1可知，9種小米糠多肽分子質(zhì)量均小于2 ku，并且都包含抗氧化氨基酸組分。另外，9種肽與MPO的對接能均小于hLF1-11，表明小米糠多肽更易與MPO結(jié)合。

過氧化物酶MPO的活性部位為一個較深的裂縫，在裂縫底部有一血紅素輔基。H2O2和超氧陰離子等底物與血紅素基團作用可導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)生[10]，當局部抗氧化劑不能抵御ROS時，會引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機體組織氧化性損傷。

由圖4可知，小米糠中對接能最低的一個目標活性肽（ASEGGHGPHWPLPPF）和hLF1-11均可與MPO的活性部位結(jié)合，其中，hLF1-11與MPO的Arg-31、Ile-160、Asn-162、Arg-438、Lys-505形成 氫 鍵；而ASEGGHGPHWPLPPF與MPO的

圖4 MPO與活性肽作用示意Fig.4 Function diagram of active peptides and MPO

Arg-31、Phe-29、Ile-160、Asn-162、Lys-308、Arg-323、Arg-504形成氫鍵。hLF1-11與MPO的Ala-28、Val-30、Arg-31、Ile-160產(chǎn)生疏水相互作用；目標活性肽與MPO的Val-30、Arg-31、Leu-33、Pro-34、Ala-35、Ile-160、Arg-438、Phe-439產(chǎn)生疏水相互作用。此外，目標活性肽還能與MPO的殘基Arg-323形成π-陽離子相互作用。綜上所述，目標肽與MPO形成了和hLF1-11類似但更為強烈的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水相互作用，結(jié)合在血紅素腔縫隙疏水袋的入口處，從而阻止了底物化合物的氧化及活性氧的生成。這與ZHANG[23]從大西洋海參中提取的抗氧化肽與MPO的對接結(jié)果相似。

3 結(jié)論與討論

本試驗利用堿性蛋白酶水解小米糠蛋白，進一步通過超濾獲得了3種分子質(zhì)量的多肽組分。體外抗氧化試驗表明，小米糠蛋白水解肽具有較高的自由基清除率，其中，以MW＜3 ku的小米糠多肽組分的體外抗氧化活性最強。秀麗隱桿線蟲是進行壽命試驗的一種理想的模式動物。本研究表明，將MW＜3 ku的小米糠多肽組分作用于秀麗隱桿線蟲后，線蟲壽命值顯著提高，在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時效果最佳。運動和咽抽能力試驗結(jié)果表明，20 μg/mL的MW＜3 ku小米糠多肽能顯著增強線蟲運動能力和咽抽速率。因此，小米糠多肽不僅具有體外抗氧化活性，有效清除自由基的能力，并且可以改善秀麗隱桿線蟲生理指標，延長線蟲壽命。主要的衰老學(xué)說即自由基學(xué)說認為，生物體的衰老源于細胞產(chǎn)生的自由基積累。一系列與衰老相關(guān)的慢性疾病如心血管疾病、糖尿病和癌癥都伴隨有自由基的過量積累。推測小米糠多肽在線蟲體內(nèi)也發(fā)揮了抗氧化作用，降低了蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少了自由基對脂質(zhì)、蛋白及DNA等重要功能大分子的破壞作用。

分子對接的預(yù)測結(jié)果表明，序列為ASEGGHG PHWPLPPF的小米糠肽可與MPO的活性位點結(jié)合，其作用方式類似于hLF1-11，形成了氫鍵及疏水相互作用，推測其在體內(nèi)可能具有抵抗氧化應(yīng)激的能力。由于通過分子對接預(yù)測與體內(nèi)實際情況存在差異，后續(xù)可通過合成多肽及線蟲體內(nèi)試驗進一步驗證所得肽的抗氧化能力，從而深入研究小米糠活性肽的抗衰老機制。此外，小米糠肽綠色天然，具有抗氧化性，還可用于護膚品等領(lǐng)域。

本研究通過酶解法制備了小米糠多肽，對其體外抗氧化活性、延壽作用及抗氧化機制進行了初步分析，研究結(jié)果為開發(fā)小米糠產(chǎn)品、提高小米糠附加值提供了一定理論依據(jù)。