樊 威 周狄文 王 均 賀 揚(yáng) 卓 婷 楊 海 吳 俊 蘇 建*

（1四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川內(nèi)江 641000；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；3內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江 641000）

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又稱溝鯰、鉗魚，屬鯰形目鮰科，原產(chǎn)于北美洲，是一種生長(zhǎng)性能優(yōu)、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)上乘的大型淡水魚類。自1984年引進(jìn)后在全國(guó)大面積養(yǎng)殖[1]。隨著集約化養(yǎng)殖的增加、種質(zhì)資源的退化以及抗生素的濫用，斑點(diǎn)叉尾鮰疾病的暴發(fā)呈逐年遞增趨勢(shì)。報(bào)道顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病危害最大，包括細(xì)菌性敗血癥、腸型敗血癥、柱形病、套腸癥等[2]。近幾年，斑點(diǎn)叉尾鮰套腸病在各地頻繁暴發(fā)，往往發(fā)病突然、傳染迅速、死亡率居高不下，給斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。以往報(bào)道顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥主要由嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌引起[3]，后來(lái)有人發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬的細(xì)菌也能引起套腸癥[4-5]。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬弧菌科氣單胞菌屬，是典型的人-獸-魚共患病病原[6]。據(jù)目前的相關(guān)報(bào)道，各類淡水魚均可感染嗜水氣單胞菌，多數(shù)魚類感染嗜水氣單胞菌后均表現(xiàn)為典型的敗血癥，但情況略有不同。嗜水氣單胞菌可致異育銀鯽發(fā)生溶血性腹水病[7]、黃顙魚發(fā)生腹水病[8]以及草魚發(fā)生細(xì)菌性敗血癥[9]等。

2020年10月底，隨著氣溫突然回升，四川省樂(lè)山地區(qū)養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰出現(xiàn)爆發(fā)性死亡，主要表現(xiàn)為體表脫黏、體色變淡以及腸道套疊等癥狀，造成當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰大量死亡。為了弄清此次斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病死亡原因，本研究采集癥狀明顯的患病斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行了生物性病原檢測(cè)，并對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，以期為該細(xì)菌引起斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試驗(yàn)對(duì)象?；疾』铙w斑點(diǎn)叉尾鮰4尾（33±5 cm），由四川省樂(lè)山市井研縣某斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖場(chǎng)提供；20尾健康斑點(diǎn)叉尾鮰，由長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管，購(gòu)自杭州天和生物試劑有限公司；Master mix和細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；水質(zhì)快速分析試劑盒，購(gòu)自湖南漁美康生物技術(shù)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的方式，詢問(wèn)養(yǎng)殖戶近期斑點(diǎn)叉尾鮰死亡情況以及用藥情況，并且觀察、記錄水體顏色。使用賽氏透明度盤測(cè)定水體透明度并記錄。使用水質(zhì)快速分析試劑盒測(cè)定患病魚池塘中的氨氮、亞硝酸鹽、pH值以及溶解氧含量。

1.2.2 剖檢觀察。取患病斑點(diǎn)叉尾鮰，觀察其體表、頭部、鰓蓋、鰓絲、眼球、鰭條、肛門等部位有無(wú)明顯病變并記錄，解剖患病斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟觀察并記錄。

1.2.3 寄生蟲檢測(cè)。取少量患病斑點(diǎn)叉尾鮰鰓絲、體表黏液以及腸道黏液壓片，置于顯微鏡下觀察并記錄是否有寄生蟲產(chǎn)生。

1.2.4 細(xì)菌的分離與純化。按無(wú)菌操作的方法，取病變明顯的斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟、脾臟和腎臟，在無(wú)菌環(huán)境下接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行革蘭氏染色并觀察其純度，純度較大的部位劃線接種到一個(gè)新的BHI瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)配，得到純化的菌株后使用甘油保存。

1.2.5 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定與生化鑒定。將純化完的菌株接種于BHI培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)大小。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征，并拍照或畫圖記錄。之后挑取單個(gè)菌落接種于微量生化管中，在28℃下培養(yǎng)24～48 h。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定。分別挑取分離得到的不同形態(tài)病原菌，接種于無(wú)菌BHI液體培養(yǎng)基，28℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。取2 mL菌液，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌DNA。采用細(xì)菌16S（16S rRNA）和gyrB基因通用引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行：PCR Premix 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物 1.0 μL， 模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)擴(kuò)增30次，最后72℃延伸10 min，于12℃結(jié)束反應(yīng)。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約1 500 bp和1 200 bp。以1%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，將預(yù)期片段PCR送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因通用引物

1.2.7 序列比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。將所測(cè)得的序列提交GenBank獲取相應(yīng)登錄號(hào)，并在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行相似性搜索。選取相似性較高的典型序列與病原菌序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株分類和進(jìn)化地位。

1.2.8 致病菌株毒力測(cè)定。先將分離純化后的菌株接種于BHI平板上，于28℃培養(yǎng)24 h后，用0.85%無(wú)菌生理鹽水1 mL清洗菌苔備用，并用革蘭氏染色檢驗(yàn)菌株純度。之后，按菌液0.4 mL和生理鹽水3.6 mL的比例，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整細(xì)菌濃度。試驗(yàn)組按照1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL 的濃度對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰腹鰭基部進(jìn)行注射感染，每組注射5尾健康斑點(diǎn)叉尾鮰，注射劑量為0.2 mL/尾；對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)時(shí)間為1周，在此期間不進(jìn)食，用塑料箱暫養(yǎng)且水溫保持在（25±2）℃，連續(xù)增氧24 h，觀察斑點(diǎn)叉尾鮰的活動(dòng)情況、發(fā)病癥狀和死亡情況，并對(duì)死亡斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行細(xì)菌檢查。

1.2.9 藥敏試驗(yàn)。無(wú)菌環(huán)境下采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行。取分離純化的細(xì)菌，用接種環(huán)挑取形態(tài)、大小一致的菌落在新平板上劃線；然后加入0.85%生理鹽水1 mL，使用無(wú)菌棉簽均勻涂布于接種的平板上。將21種含常用抗菌藥的紙片貼在平板上，28℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑的大小，判斷病原菌對(duì)藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)場(chǎng)檢查情況

該池塘斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病時(shí)間約為1個(gè)月，發(fā)病魚癥狀主要表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩，食欲減退，肛門紅腫，體表色淡、脫黏，部分魚體表有圓形褪色斑或口腔出血并有淡黃色污物附著，死亡量較大，嚴(yán)重時(shí)死亡量達(dá)到1 000～1 500 kg。

2.2 病魚的臨床癥狀

病魚體色變淡、黏液減少，腸道出現(xiàn)明顯套疊。解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)紅出血，脾腎腫大、出血，胃和腸道出血、發(fā)炎，部分腦內(nèi)充血、出血（圖1）。

2.3 寄生蟲檢測(cè)

鰓絲壓片結(jié)果表明，鰓絲壓片未觀察到寄生蟲。體表黏液壓片表明，體表黏液中未觀察到寄生蟲。

2.4 細(xì)菌分離、純化

利用穿刺接種技術(shù)將病變明顯的肝臟、脾臟和腎臟劃線接種于BHI培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基上形成圓形、表面光滑的半透明乳白色針尖狀菌落，分別挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色，置于顯微鏡下觀察，確定分離細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌（圖2）。

2.5 細(xì)菌檢測(cè)PCR擴(kuò)增

以分離菌株的DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)和凝膠成像后，16S rRNA基因于1 500 bp左右得到其目的條帶，gyrB基因于1 300 bp左右得到其目的條帶（圖 3）。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將分離菌株的16S rRNA序列（LSCC20201）與gyrB序列（LSCC20202）于 GenBank中查找相關(guān)序列，在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行Blast分析，選擇與該序列具有較高同源性的核酸序列。按照以上方法，在基因庫(kù)里下載嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、點(diǎn)狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和熒光假單胞菌共5類已公開(kāi)的序列，與菌株序列在MEGA 6.0軟件中進(jìn)行多次比對(duì)，最后采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)分析各分枝的置信度。在16S rRNA序列、gyrB序列上，分離菌株均聚在嗜水氣單胞菌的分支上。從生理生化試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，菌株為嗜水氣單胞菌（圖4）。

2.7 人工感染試驗(yàn)

將分離純化菌株培養(yǎng)后稀釋成 1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL的濃度對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行腹腔注射（0.2mL/尾），24 h后，斑點(diǎn)叉尾鮰開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為急性充血、出血，72h死亡率達(dá)高峰（表2），且部分出現(xiàn)套腸癥狀。對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。

表2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.8 藥敏試驗(yàn)

為進(jìn)一步判斷病原菌對(duì)藥物的敏感程度，選取21種常用抗生素，采用紙片法，分別對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行混合藥敏試驗(yàn)（圖5）。該菌株對(duì)氧氟沙星和氟苯尼考敏感，對(duì)其他藥物低度敏感或不敏感，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 患病魚分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥又稱為斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊癥，1988年在美國(guó)就有斑點(diǎn)叉尾鮰類似腸斷裂的疾病報(bào)道，并且從病魚器官中分離到嗜水氣單胞菌、假單胞菌（Pseudomonas spp.）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）和柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnar）等多種細(xì)菌[10]，但沒(méi)有證據(jù)將這些分離細(xì)菌與疾病之間的關(guān)系建立起來(lái)。汪開(kāi)毓等[11]認(rèn)為，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的病原，但其致病性較嗜水氣單胞菌更高，患病斑點(diǎn)叉尾鮰更易出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象。之后，也有研究報(bào)道顯示，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等細(xì)菌也能夠引起斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥[4]。研究發(fā)現(xiàn)，套腸癥發(fā)生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易引起腸道缺血，降低消化能力，引起腸炎，甚至破裂引起全身性繼發(fā)感染，造成魚體死亡[3]。

本研究將分離菌株進(jìn)行回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)新感染斑點(diǎn)叉尾鮰出現(xiàn)相似癥狀，隨后通過(guò)與16S rRNA序列與gyrB序列進(jìn)行比對(duì)，確定該病原為嗜水氣單胞菌。斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病癥狀主要為體色變淡，有褪色斑現(xiàn)象，鰭條基部發(fā)紅，肛門紅腫，脫肛現(xiàn)象較少，內(nèi)臟器官表現(xiàn)為典型的腸道套疊并伴有出血和腸炎跡象，脾臟充血腫大，與嗜水氣單胞菌引起的敗血癥有較大差異，但也有相似之處。這可能與不同嗜水氣單胞菌分離株的毒性、流行水溫及宿主差異有關(guān)[12]。嗜水氣單胞菌導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物致病主要與外分泌物中一些毒力因子有關(guān)，包括外毒素和胞外酶[13]。這些毒素和酶往往使被感染魚類發(fā)生不可逆的病變，如溶血素能破壞各種細(xì)胞（包括白細(xì)胞），腸毒素能引起患病魚腸道細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致炎癥及套腸等癥狀。本試驗(yàn)中，患病斑點(diǎn)叉尾鮰出現(xiàn)腸炎、腸套疊等癥狀，可能與嗜水氣單胞菌攜帶的這些毒力因子有關(guān)。

除此之外，斑點(diǎn)叉尾鮰爆發(fā)性死亡與放養(yǎng)密度和池塘環(huán)境也有關(guān)系。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖密度較大，池塘底質(zhì)淤泥較多，池塘底部堆積了大量殘餌糞便，為有害細(xì)菌群提供了適宜的生長(zhǎng)和繁殖環(huán)境，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體偏黃略帶渾濁，池塘中氨氮、亞硝酸鹽含量均嚴(yán)重超標(biāo)，最終引起魚體的抵抗力和免疫力下降；同時(shí)，該病主要發(fā)生在冷水或涼水水域中（水溫12～19℃）[14]。本次發(fā)病期氣溫突然上升（水溫達(dá)到15℃左右），斑點(diǎn)叉尾鮰代謝突然加快，推測(cè)可能是本次致病菌感染發(fā)病速度較快的原因之一。后期通過(guò)改善水質(zhì)，降低了養(yǎng)殖場(chǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰的死亡率。

在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，合理、有效地使用抗生素是治療魚類細(xì)菌性疾病的重要措施之一。本試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥物敏感性分析，結(jié)果表明，致病菌株對(duì)氟苯尼考及氧氟沙星敏感。吳 璇等[4]在研究嗜水氣單胞菌引起的斑點(diǎn)叉尾鮰套腸病時(shí)，也發(fā)現(xiàn)該分離菌株對(duì)喹諾酮類藥物敏感。喹諾酮類抗生素氧氟沙星已經(jīng)在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中禁止使用，因而臨床上可以選取氟苯尼考治療該疾病。

3.2 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌分離鑒定和人工感染試驗(yàn)，確定了引起斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的病原為嗜水氣單胞菌；通過(guò)藥敏試驗(yàn)，得出分離菌株對(duì)氟苯尼考和氧氟沙星敏感。試驗(yàn)結(jié)果可為臨床中由嗜水氣單胞菌引起的斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的防治提供參考。