常曉春 李建平 郝曉燕 胡文冉 陳 果 高升旗 足木熱木·吐爾遜 趙 準 黃全生 *

（1新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點實驗室，新疆烏魯木齊 830091）

新疆屬于干旱半干旱地區(qū)，地下水位逐年下降，可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的水資源逐年減少。目前，影響新疆玉米生產(chǎn)最主要的問題是干旱，新疆玉米開花期受到干旱脅迫是導致玉米減產(chǎn)的主要原因。為解析玉米的耐旱性，國外科研人員從數(shù)量遺傳學角度開展了大量工作，利用傳統(tǒng)的QTL定位和關(guān)聯(lián)分析等方法，分析玉米每株穗數(shù)、穗長、單穗重、單穗粒數(shù)、百粒重等產(chǎn)量性狀以及開花—吐絲間隔期（anthesissilking interval，ASI）、株高、穗位高、根的相關(guān)性狀等耐旱相關(guān)性狀來間接地確定玉米的耐旱性[1]。以這些性狀為基礎(chǔ)，大量的玉米耐旱性QTLs被定位。近年來，國內(nèi)科研工作者在耐旱相關(guān)基因研究方面取得了很大進展。研究人員利用來源于30個連鎖分析群體共5 000個自交系的玉米NAM群體，對干旱條件下玉米產(chǎn)量和ASI等7個性狀進行定位，通過聯(lián)合連鎖分析檢測到169個QTLs，這些SNPs位點位于354個候選基因上[2-4]。

國內(nèi)外科研工作者已在玉米耐旱QTL定位和玉米耐旱相關(guān)基因發(fā)掘方面取得了一定進展，但這些還遠遠不能滿足目前新疆玉米生產(chǎn)實際的需要。究其原因，主要是目前玉米耐旱性QTL定位主要集中在玉米自交系上，并沒有利用生產(chǎn)上應(yīng)用的玉米雜交種（F1）進行耐旱性QTL位點挖掘。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進行玉米F1關(guān)聯(lián)群體的田間耐旱性鑒定與評價，開展全基因組關(guān)聯(lián)分析，并在耐旱性優(yōu)異的回交材料中進行前景選擇，以期獲得玉米耐旱優(yōu)異新種質(zhì)、新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為包含384個雜交種（F1）的玉米關(guān)聯(lián)群體。該群體是利用我國玉米生產(chǎn)中常用的96個自交系為母本、4個骨干自交系（鄭58、昌7-2、339M、339F）為父本，依據(jù)不完全雙列雜交（NCⅡ）設(shè)計構(gòu)建的。這些自交系分別來源于不同玉米生態(tài)區(qū)，屬于不同的雜種優(yōu)勢亞群，具有廣泛的遺傳基礎(chǔ)，是進行耐旱關(guān)聯(lián)分析的良好材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐旱性鑒定。田間試驗于2020年5月在新疆瑪納斯生物育種基地和新疆農(nóng)業(yè)科學院綜合試驗場基地進行，采用 α-lattice 設(shè)計（16×16），選地塊高低均勻、滴管分流流暢的大田，設(shè)置干旱脅迫和常規(guī)滴灌2個處理。為了嚴格進行耐旱相關(guān)性狀鑒定，本研究中田間水分管理如下：2個處理試驗區(qū)域均采用滴灌，常規(guī)滴灌和干旱脅迫處理播種后頭次水澆灌一致，以保證出苗；然后，常規(guī)滴灌處理每隔20 d澆水1次，直至收獲，保證玉米生長正常需水；干旱脅迫處理在播種后20 d和40 d各澆水1次，玉米開花期前后均不滴灌，至授粉完成后10 d澆1次水保證結(jié)實籽粒后期發(fā)育，屬于中度干旱脅迫。玉米生長期間如遇降雨，根據(jù)雨量和持續(xù)情況判斷下次澆水與否。2個處理之間至少相隔2 m以上，防止水分相互滲透，每個處理2次重復。試驗材料為一模兩行，行長5 m，株距20 cm，種植密度大約為8.4萬株/hm2。

試驗期間調(diào)查形態(tài)性狀，記錄玉米出苗期、散粉期和抽絲期，于每個生長關(guān)鍵節(jié)點考察小區(qū)的總株數(shù)、結(jié)實株數(shù)、株高、穗位高、雄穗長度和結(jié)實株數(shù)百分率。調(diào)查標準：出苗期為小區(qū)內(nèi)50%的植株出苗且苗高2 cm的日期；散粉期為小區(qū)內(nèi)50%的植株雄穗散粉的日期；抽絲期為小區(qū)內(nèi)50%的果穗吐絲的日期；株高為由植株基部到頂部的高度，每行測8株；穗位高為由植株基部到主穗穗節(jié)的高度，每行測8株；雄穗長度為雄穗第一節(jié)到頂部的長度，每行測8株；總株數(shù)為小區(qū)內(nèi)存活的植株總數(shù)；有效株數(shù)為小區(qū)內(nèi)能正常結(jié)實的株數(shù)。

1.2.2 玉米耐旱性關(guān)聯(lián)分析。通過耐旱性鑒定試驗，初步獲得了1年的表型數(shù)據(jù)，在384個F1群體中挑選耐旱性差異顯著的極端材料各30份，分為耐旱組與不耐旱組，然后在大田干旱條件下取材提取RNA，混池后進行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定差異表達基因。同時，選擇耐旱性最好的F1材料，分別用各自親本（鄭 58、昌 7-2、339M、339F）進行回交，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定玉米耐旱性關(guān)聯(lián)位點。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用軟件Power Marker V3.25進行遺傳多元性、多態(tài)性統(tǒng)計分析基因，應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SAS V9.4編程進行典型相關(guān)分析、方差分析、因子分析和表型性狀數(shù)據(jù)分析，選擇75%以上變異的性狀進行耐旱性評價，根據(jù)群體中所有單株的基因型以及表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[5-6]。

利用全基因組SNP標記構(gòu)建耐旱相關(guān)性狀圖譜，以玉米高密度分子標記連鎖圖譜（Intermated B73XMo17 Map，IBM）與 IBM2 2008 Neighbors玉米連鎖圖譜為參考圖譜，產(chǎn)生的IBM neighbors高密度圖譜，比對QTL定位的原始圖譜與參考圖譜，確定玉米抗旱相關(guān)QTL的比對標記及坐標，發(fā)掘出與目標性狀關(guān)聯(lián)的標記位點[7-9]。對表型數(shù)據(jù)的QTL分析可以得到控制表型的關(guān)鍵基因組區(qū)間，通過QTL定位分析雜種優(yōu)勢的形成機制選取重要關(guān)聯(lián)位點及其基因型，控制雜種優(yōu)勢表型性狀的基因位點的遺傳效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米耐旱性初步鑒定

在新疆大田條件下，對包含384個雜交種（F1）的玉米關(guān)聯(lián)群體進行初步的耐旱性鑒定，調(diào)查獲得了開花—吐絲間隔期（ASI）、株高（PH）、穗長（EL）等數(shù)據(jù)。結(jié)果（圖1）顯示，在干旱脅迫條件下，開花—吐絲間隔期明顯長于常規(guī)滴灌，株高和穗長明顯小于常規(guī)滴灌，且都有較大的變異。說明干旱脅迫可使玉米開花—吐絲間隔期（ASI）變長，株高變低，穗長變短。方差分析表明，F(xiàn)1群體中基因型、干旱脅迫對開花—吐絲間隔期都有極顯著影響，且基因型與干旱脅迫的交互效應(yīng)對開花—吐絲間隔期有顯著影響；基因型和干旱脅迫對穗長和株高都有極顯著影響，干旱脅迫與常規(guī)滴灌處理間玉米開花—吐絲間隔期（ASI）、株高（PH）、穗長（EL）差異均達極顯著水平。

2.2 玉米耐旱性關(guān)聯(lián)分析

分位數(shù)-分位數(shù)圖縱軸是SNP位點的實際-log10P值，橫軸是理論-log10P值（假設(shè)SNP與表型不相關(guān)），顯示了每個SNP位點P值實際值與理論值的差異。從圖2（a）曼哈頓圖可以看出，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鑒定到16個REC關(guān)聯(lián)的位點，只有3號染色體上有一個很高的峰，這幾乎是最理想的GWAS結(jié)果。圖2（b）這種翹尾巴的形式是最理想的分位數(shù)-分位數(shù)圖結(jié)果，可以看到從橫坐標大于2開始，GWAS結(jié)果的P值與理論P值就有了明顯的差距，說明表型和基因型之間確實存在顯著的相關(guān)關(guān)系。曼哈頓圖本質(zhì)上是一個散點圖，用于顯示大量非零大范圍波動數(shù)值，最早應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究展示高度相關(guān)位點，以染色體編號為橫坐標、以SNP位點相關(guān)統(tǒng)計顯著性P值的-log10變換值（-log10P）為縱坐標，其中P值為SNP位點相關(guān)顯著性（SNP位點與表型的關(guān)聯(lián)程度）。

3 結(jié)論與討論

玉米是典型的異交作物，玉米耐旱性的相關(guān)性狀、形態(tài)結(jié)構(gòu)與植株的水分吸收和散失有密切關(guān)系，形態(tài)結(jié)構(gòu)良好是玉米耐旱的機制之一[10]。玉米生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的是雜交種（F1），但在全基因組水平上直接利用F1群體進行玉米耐旱性QTL的解析鮮有報道。因此，這方面的理論研究大大落后于實際生產(chǎn)需求。研究實例表明，利用F1進行關(guān)聯(lián)分析正在成為一種趨勢和研究方向。由于F1產(chǎn)量高、生物量大，利用F1進行遺傳學研究，挖掘與實際田間表現(xiàn)有關(guān)的遺傳信息，能夠為作物分子育種提供可以直接利用的遺傳和分子信息，從而更高效地推動作物分子育種[11-14]。本研究利用96個自交系為母本、4個骨干自交系為父本，依據(jù)不完全雙列雜交（NCⅡ）設(shè)計構(gòu)建了包含384個F1的群體，開展了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)等分析。在全基因組學水平對新疆的玉米種質(zhì)資源進行系統(tǒng)的基因型鑒定，共鑒定到16個REC關(guān)聯(lián)的位點。課題組選定開花—吐絲間隔時間（ASI）、結(jié)實率（ESP）、產(chǎn)量（GY）和相對產(chǎn)量（RGY）等指標進行田間耐旱性全基因組關(guān)聯(lián)分析，整合4個指標關(guān)聯(lián)區(qū)域，初步獲得138個與花期干旱相關(guān)的整合區(qū)域，能夠解釋34%～49%的性狀表型變異。整合區(qū)域與前面16個REC關(guān)聯(lián)區(qū)域重疊，其中4個REC關(guān)聯(lián)的單倍型可以有效地區(qū)分農(nóng)藝性狀。將為解析玉米耐旱分子機制和培育耐旱玉米新品種提供理論依據(jù)與優(yōu)異耐旱新種質(zhì)[15-18]。