劉 欣， 程 瑞， 徐兵劃， 白 甜， 許文釗， 張朝陽， 羅德旭， 趙建鋒， 張興平，孫玉東

(江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/淮安市設(shè)施蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇淮安223001)

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳與育種研究中的應(yīng)用越來越普及。已有分子標(biāo)記主要分為四大類：(1)基于DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記，比如RFLP標(biāo)記；(2)基于PCR的分子標(biāo)記，比如RAPD標(biāo)記、SCAR標(biāo)記和SSR標(biāo)記等；(3)基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的分子標(biāo)記，比如AFLP標(biāo)記和CAPS標(biāo)記；(4)基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記，比如SNP標(biāo)記。其中SNP標(biāo)記分布廣、多態(tài)性高、可靠性高，在遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇等方面被廣泛應(yīng)用[1-6]。競爭性等位基因特異性PCR (Kompetitive allele specific PCR，KASP) 是一種新型高通量SNP分型技術(shù)，該技術(shù)準(zhǔn)確度高,可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，簡單便捷，并且將使用SNP標(biāo)記的成本降至最低[7]，是目前最理想的基因分型技術(shù)。

指紋圖譜是指利用DNA分子標(biāo)記對作物品種進(jìn)行檢測，并根據(jù)不同品種的每個(gè)標(biāo)記的基因型而建立的圖譜，據(jù)此可以有效避免品種的同名異物及同物異名的問題，有利于種業(yè)的健康發(fā)展。目前，已有許多品種利用基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記完成了指紋圖譜的構(gòu)建。王富強(qiáng)等[8]利用KASP技術(shù)將22個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于76份葡萄品種的指紋圖譜構(gòu)建。李志遠(yuǎn)等[4]利用篩選獲得的50個(gè)核心SNP標(biāo)記，構(gòu)建了59份市場上主要推廣的甘藍(lán)品種指紋圖譜。魏慶鎮(zhèn)等[9]篩選了34個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記，并構(gòu)建了6個(gè)浙茄品種的指紋圖譜。目前，在西瓜中，大部分種質(zhì)資源及品種的指紋圖譜由SSR標(biāo)記構(gòu)建[10-12]，其缺點(diǎn)是多態(tài)性低，操作步驟繁瑣，不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，對于大批量樣品檢測，耗費(fèi)時(shí)間長，人工成本高。因此，建立基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記用于西瓜品種鑒定和種子純度檢測是非常必要的。

本研究利用Yang 等[6]開發(fā)的32個(gè)核心SNP標(biāo)記，采用KASP技術(shù)對79份西瓜雜交種及自交系材料進(jìn)行基因分型，根據(jù)分型數(shù)據(jù)以及多態(tài)性信息，篩選獲得30個(gè)核心SNP標(biāo)記，用于構(gòu)建蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種的指紋圖譜，同時(shí)，篩選出具有多態(tài)性和分型較好的標(biāo)記，用于種子純度檢測，為鑒定西瓜品種的真實(shí)性提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的試驗(yàn)材料如表1所示。每份材料播種5粒于72孔穴盤中，放置于25 ℃、16 h(光)/8 h(暗)環(huán)境中，正常水肥管理，保證出芽和成苗。待幼苗長出2～3片真葉時(shí)，取嫩葉0.1 g于1.5 ml離心管中，用于提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。種子純度檢測所用的蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)、蘇夢7號(hào)、蘇夢9、蘇創(chuàng)3號(hào)、蘇創(chuàng)4號(hào)和蘇創(chuàng)5號(hào)西瓜種子均取自制種棚，制種參考西瓜雜交制種技術(shù)[13]，隨機(jī)選取收獲的雜交種子90粒播種于穴盤，編號(hào)Z1～Z90，待2片真葉展平后取1片真葉于1.5 ml離心管中，用于提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，待幼苗伸蔓后，按照每個(gè)雜交種的編號(hào)(Z1～Z90)定植在塑料大棚中，行距2.6 m，株距30.0 cm，爬地栽培，正常水肥管理，待結(jié)果后進(jìn)行田間純度鑒定。

表1 供試西瓜種質(zhì)資源

1.2 DNA提取

將取好的樣品放入液氮罐中速凍，用組織研磨器[天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品]研磨至粉末狀，采用北京華越洋生物科技有限公司提供的試劑盒(0418-50BB型)提取DNA，最后用蒸餾水洗脫和溶解DNA。取2 μl DNA用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，無拖帶且條帶單一即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。利用Nanodrop 2000測定吸光值OD260/OD280及OD260/OD230，測定值為1.8～2.0時(shí)表示DNA質(zhì)量較好。測定每份DNA樣品的濃度，并稀釋質(zhì)量濃度至60 ng/μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3 PCR反應(yīng)

根據(jù)Yang 等[6]開發(fā)的40個(gè)核心SNP標(biāo)記信息合成引物，在每組引物中的正向引物(Forward 1)的序列5′端加上接頭序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在正向引物(Forward 2)序列的5′端加上接頭序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，反向引物序列不用改變，用蒸餾水溶解稀釋引物濃度至100 μmol/L，按照如下體系配置引物混合物(Primer Mix)：正向引物Forward1和Forward2各12 μl，反向引物30 μl，加蒸餾水至100 μl，配置完成后保存于-20 ℃?zhèn)溆?。每個(gè)PCR反應(yīng)孔的體系配置如下：DNA模板1.20 μl，Primer Mix 0.14 μl，2×KASP Mix(北京嘉程生物科技有限公司產(chǎn)品)5.00 μl，蒸餾水3.50 μl，配置完成后封膜，每個(gè)96孔反應(yīng)板中加入2個(gè)陰性對照(NTC)。PCR反應(yīng)板和封板膜由愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司提供。將加樣完成的PCR板放入熒光定量檢測儀器(Applied Biosystems /7500型定量PCR儀)中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性15 min; 94 ℃變性20 s，61～55 ℃復(fù)性和延伸1 min， 10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次降低0.6 ℃; 94 ℃變性20 s，55 ℃繼續(xù)擴(kuò)增60 s ，26個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)據(jù)，若分型不充分，則繼續(xù)擴(kuò)增，每3個(gè)循環(huán)查看分型情況，不超過40個(gè)循環(huán)。

1.4 KASP基因分型

熒光定量PCR結(jié)束后，使用Real-Time PCR Software V2.4軟件進(jìn)行分型及分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)引物信息、熒光信號(hào)和分型結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)SNP位點(diǎn)基因型。聚類分析采用MEGA X軟件版本，將位點(diǎn)信息轉(zhuǎn)化為序列信息，運(yùn)用近鄰法(Neighbor-Joining method)和JTT矩陣模型來進(jìn)行計(jì)算[14-15]，重復(fù)計(jì)算次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP分型

根據(jù)KASP的分型結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果(圖1 )顯示，用32個(gè)核心標(biāo)記對所有材料進(jìn)行KASP分型，有2個(gè)標(biāo)記分型失敗，分別是WmSNP178和WmSNP192。其余30個(gè)標(biāo)記雖然在所有材料中存在分型數(shù)據(jù)缺失的情況，但每個(gè)材料缺失標(biāo)記數(shù)量都不超過3個(gè)，因此，這30個(gè)標(biāo)記能夠成功分型(圖1 )，用于遺傳背景分析和指紋圖譜構(gòu)建。標(biāo)記WmSNP47在大部分材料中是雜合位點(diǎn)，雜合基因型占比87.5%。標(biāo)記WmSNP151在所有材料中均是純合位點(diǎn)，基因型為C或者T。

A：標(biāo)記WmSNP140在79份材料中的基因分型；B：標(biāo)記WmSNP92在蘇創(chuàng)4號(hào)種子純度檢測中的基因分型。FAM、VIC表示探針的熒光值。

2.2 遺傳背景分析

根據(jù)KASP分型結(jié)果，我們將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成不同位點(diǎn)的基因型，運(yùn)用MEGA軟件對79份材料進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖2。蘇夢系列小果型品種蘇夢2號(hào)(Wm38)、蘇夢5號(hào)(Wm21)、蘇夢6號(hào)(Wm40)、蘇夢7號(hào)(Wm31)被聚類在一個(gè)分支上，屬于一個(gè)類型，說明這些品種遺傳關(guān)系相近，而在人工選育時(shí)，這些品種選擇的育種方向都是紅瓤，中心糖度高，果皮韌性較強(qiáng)，耐裂[16]，并且蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)和蘇夢7號(hào)的父本相同，因此這3個(gè)品種在遺傳背景上具有相似性。Wm13和Wm14是2個(gè)野生種，與雜交種在性狀上存在較大差異：野生種瓤色為白色，且具有苦味，種子顏色為灰綠色無覆紋或紅褐色有斑點(diǎn)狀覆紋，與雜交種種子的棕色和黑色不同。從圖2中可以看出，其與蘇夢系列品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分屬不同分支，屬于不同類型。蘇夢3號(hào)(Wm39)與蘇夢4號(hào)(Wm16)分別屬于不同分支，二者瓤色不同，前者為紅瓤，后者為黃瓤，且蘇夢4號(hào)果肉風(fēng)味獨(dú)特，推測二者在某些位點(diǎn)具有遺傳多樣性。蘇夢9號(hào)(Wm22)與蘇夢6號(hào)(Wm40)也屬于不同分支，蘇夢6號(hào)果皮覆紋形狀為窄齒條狀，而蘇夢9號(hào)齒條較寬，并且其果形比蘇夢6號(hào)稍大。蘇夢7號(hào)親本W(wǎng)m29和Wm33的遺傳距離為0.43，二者遺傳距離較遠(yuǎn)，農(nóng)藝性狀測定結(jié)果顯示其雜交一代蘇夢7號(hào)的品質(zhì)高于雙親，尤其是在果皮韌性方面，其雙親果皮分別為易裂和中等硬度，但蘇夢7號(hào)表現(xiàn)出韌性強(qiáng)的特點(diǎn)[16]。

圖中的材料見表1。方框中的材料表示2個(gè)野生種材料；帶星號(hào)的材料表示蘇夢7號(hào)的親本。

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

我們利用KASP分型成功的SNP 標(biāo)記構(gòu)建了蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種的指紋圖譜，位點(diǎn)和基因型數(shù)據(jù)如表2所示。在30個(gè)SNP標(biāo)記中，WmSNP162在15份西瓜品種中基因型(GG)全部一致，為純合位點(diǎn)。WmSNP226在蘇夢8號(hào)中的基因型(AG)為雜合，其他品種該位點(diǎn)基因型均為純合(AA)。WmSNP92在蘇夢8號(hào)中是純合基因型(CC)，在蘇夢1號(hào)中未檢出，其余品種該位點(diǎn)基因型(TC)均為雜合。通過WmSNP1、WmSNP29、WmSNP60、WmSNP66、WmSNP140和WmSNP156共6個(gè)SNP標(biāo)記即可將所有蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種區(qū)分開。根據(jù)位點(diǎn)基因型信息，將每個(gè)品種指紋圖譜轉(zhuǎn)化為二維碼，方便品種的真實(shí)性鑒定和推廣(圖3)。

圖3 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種指紋圖譜二維碼

表2 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種指紋圖譜

2.4 種子純度檢測

根據(jù)KASP分型結(jié)果，篩選可以對蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)、蘇夢7號(hào)、蘇夢9號(hào)、蘇創(chuàng)3號(hào)、蘇創(chuàng)4號(hào)和蘇創(chuàng)5號(hào)西瓜品種種子進(jìn)行純度檢測的標(biāo)記。結(jié)果顯示，標(biāo)記WmSNP5在蘇創(chuàng)3號(hào)的雙親中是純合位點(diǎn)，且呈現(xiàn)多態(tài)性，在蘇創(chuàng)3號(hào)中是雜合位點(diǎn)，可以用來對蘇創(chuàng)3號(hào)種子的純度和真實(shí)性進(jìn)行檢測。利用同樣的分析方法，我們篩選到標(biāo)記WmSNP92可以用來檢測蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)、蘇夢7號(hào)、蘇夢9號(hào)、蘇創(chuàng)4號(hào)、蘇創(chuàng)5號(hào)6個(gè)西瓜品種種子的純度(圖1 B)。通過標(biāo)記WmSNP5和WmSNP92，利用KASP技術(shù)對上述7個(gè)西瓜品種進(jìn)行種子純度鑒定，同時(shí)進(jìn)行田間種植鑒定，鑒定指標(biāo)包括葉片形態(tài)、果皮花色、果型、種子大小及顏色等，結(jié)果如表3所示，田間鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致，因此，標(biāo)記WmSNP92和WmSNP5可用于蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)、蘇夢7號(hào)、蘇夢9號(hào)、蘇創(chuàng)4號(hào)、蘇創(chuàng)5號(hào)和蘇創(chuàng)3號(hào)種子純度和真實(shí)性的檢測。

表3 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種種子純度鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

對于育種工作者來說，明確種質(zhì)資源和育種材料的遺傳背景,鑒定商品品種種子純度及種子的真實(shí)性非常重要，傳統(tǒng)的鑒定方法主要是從植株表型觀察鑒定。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，人們開發(fā)的分子標(biāo)記可以在基因水平上直接反映植物的遺傳多態(tài)性，因此分子標(biāo)記已經(jīng)成為植物遺傳多樣性研究的主要方法[17-19]。KASP技術(shù)是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的SNP標(biāo)記分型技術(shù)[20]。利用以KASP技術(shù)為基礎(chǔ)的SNP標(biāo)記研究種質(zhì)資源的遺傳背景，構(gòu)建品種指紋圖譜以及鑒定品種的真實(shí)性是未來發(fā)展的趨勢。馮子珊等[21]通過KASP技術(shù)，對浙蒲9號(hào)父本、母本以及92份F1材料進(jìn)行基因分型，進(jìn)而鑒定F1材料的種子純度，結(jié)果與田間種子純度鑒定結(jié)果一致，且該方法準(zhǔn)確性高，成本低。Shen等[22]利用SNP標(biāo)記對372份青花菜種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析與評價(jià)，最終篩選出28個(gè)KASP標(biāo)記對青花菜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，用于種子鑒定和品種鑒定。Mulugeta等[23]利用37個(gè)基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記對48個(gè)埃塞俄比亞蠶豆進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳多態(tài)性較高，有利于培育優(yōu)良品種。

本研究利用32個(gè)核心SNP標(biāo)記對79份西瓜材料(包括54份自交系和25份F1雜交種)進(jìn)行KASP分型和遺傳背景分析，通過聚類分析及遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，不同自交系間的遺傳距離不同，因此，我們可以通過選擇遺傳距離較遠(yuǎn)的自交系進(jìn)行雜交配組，篩選高優(yōu)勢組合，進(jìn)而為選育優(yōu)質(zhì)和高優(yōu)勢品種奠定基礎(chǔ)。通過分析我們還發(fā)現(xiàn)蘇夢系列不同品種其遺傳背景有差異，這也從DNA水平上解釋了不同品種間性狀差異的原因。但是在進(jìn)行KASP分型時(shí)，有2個(gè)標(biāo)記分型不成功，推測這是因?yàn)?9份材料不能涵蓋西瓜的所有品種，這2個(gè)位點(diǎn)基因型不呈現(xiàn)多態(tài)性，因此導(dǎo)致分型失敗。本研究針對蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜，利用篩選出來的30個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜，為西瓜品種鑒定和保護(hù)提供了技術(shù)支撐。通過篩選出來的WmSNP5和WmSNP92標(biāo)記，對江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所培育的蘇夢5號(hào)、蘇夢6號(hào)、蘇夢7號(hào)、蘇夢9號(hào)、蘇創(chuàng)3號(hào)、蘇創(chuàng)4號(hào)、蘇創(chuàng)5號(hào)7個(gè)西瓜品種[24-26]進(jìn)行種子純度鑒定，構(gòu)建了以KASP技術(shù)為基礎(chǔ)的種子純度檢測體系，具有高效、簡單、便捷等特點(diǎn)，方便了種子生產(chǎn)銷售中種子純度的鑒定。

致謝:感謝中國計(jì)量大學(xué)徐沛研究員對本論文提供指紋圖譜構(gòu)建方面的幫助！