田雪珂， 鐘啟文， 孫雪梅， 張廣楠， 楊世鵬， 譚 龍， 王麗慧

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海西寧810016)

葉用萵苣(LactvcasativaL.)，又被稱為生菜，屬菊科萵苣屬，一年生或兩年生草本作物[1]，具有生育期短、產(chǎn)量高的特點，在設(shè)施栽培中應(yīng)用廣泛[2]。葉用萵苣喜冷涼[3]，可分為皺葉生菜、散葉生菜、結(jié)球生菜三類[4]。葉用萵苣含有豐富的類胡蘿卜素、維生素C、可溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)[5]，具有降血壓、預(yù)防心律失常[6]等保健功能。維生素C通常被轉(zhuǎn)化成2種形式：一是抗壞血酸(AA)，具有抗氧化特性；二是氧化產(chǎn)物脫氫抗壞血酸(DHAA)[7]，用于維持人體正常生長發(fā)育。維生素C人體不能自身合成，必須通過食物獲取，且容易被高溫破壞，而葉用萵苣營養(yǎng)豐富，可做涼菜食用[8]，作為補充維生素C的蔬菜具有較大優(yōu)勢。

種質(zhì)資源是研究作物遺傳生長的基礎(chǔ)[9]，也是影響現(xiàn)有遺傳資源質(zhì)量和數(shù)量、創(chuàng)新改良深度以及支持當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素[10]。種質(zhì)資源鑒定是科學(xué)研究的主要任務(wù)之一。通過資源的鑒定，評價遺傳資源在生產(chǎn)和科研方面的應(yīng)用潛力[11]。種質(zhì)資源表型評價比分子評價更為直接，已被廣泛應(yīng)用于核心種質(zhì)的構(gòu)建和分類[12]。如Lebeda等利用該方法對野生萵苣進行農(nóng)藝性狀的調(diào)查[13]。董潔等[14]利用表型評價對55份葉用萵苣進行研究，其變異系數(shù)分布范圍為8.82%～98.85%。目前隨著中國對生菜多樣性需求的增加，資源的引進和種質(zhì)資源的豐富顯得極其重要。種質(zhì)資源引進是豐富遺傳資源多樣性的重要手段[15-17]。據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2021年中國已收集萵苣資源4 000份[18]，并開展了農(nóng)藝性狀調(diào)查、抗病試驗、品質(zhì)分析，通過試驗驗證培育出了一些優(yōu)良品種。采用主成分分析、聚類分析、多樣性指數(shù)等統(tǒng)計分析方法對種質(zhì)資源質(zhì)量進行綜合評價，可使質(zhì)量評價更加科學(xué)可靠。近年來，將主成分分析和聚類分析相結(jié)合的綜合評價分析方法應(yīng)用于葡萄[19]、楊梅[20]、蘋果[21]、獼猴桃[22]和枸杞子[23]等果實品質(zhì)評價的研究已成為熱點。

本研究以青海省農(nóng)林科學(xué)院收集的13份葉用萵苣種質(zhì)資源為材料，于2021年在青海省西寧市園藝創(chuàng)新基地進行栽培及鑒定，對葉形和葉色等質(zhì)量性狀以及葉柄厚等數(shù)量性狀進行評價，結(jié)合聚類分析和主成分分析進行綜合評價并篩選優(yōu)良種質(zhì)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

供試材料為青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝創(chuàng)新基地收集到的葉用萵苣種質(zhì)資源，共計13份。

1.2 試驗方法

調(diào)查并記錄葉用萵苣的株高、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄厚、葉柄寬、葉數(shù)。對質(zhì)量性狀進行賦值并將數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，賦值標(biāo)準(zhǔn)參考李錫香等[24]的《萵苣種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》(表1) 。

表1 葉用萵苣種質(zhì)資源10個描述型性狀及分級標(biāo)準(zhǔn)

試驗材料于2020年種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝創(chuàng)新基地，從每份材料中選擇3株生物學(xué)重復(fù)對其農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，并選取3個獨立的生物學(xué)樣本用于后續(xù)營養(yǎng)指標(biāo)的測定。栽培基質(zhì)為珍珠巖∶蛭石=1∶1(質(zhì)量比)，混合均勻。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel2019對測試數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、聚類分析、主成分分析。并對13份葉用萵苣種質(zhì)資源的10個農(nóng)藝性狀及6個營養(yǎng)指標(biāo)的平均值(μ)、范圍(R)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)、變異系數(shù)(CV)和多樣性指數(shù)(H′)，使用Duncan’s多重比較法分析差異的顯著性。根據(jù)各性狀數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差對多樣性指數(shù)進行分級，分為9個級別：第1級為[Xi<(μ-2.0s)]，[Xi<(μ-1.5s)]為第2級，每級增加0.5s，至第9級為[Xi>(μ+2.0s)]。因此，根據(jù)相對頻率(Pi)計算多樣性指數(shù)H′。采用香農(nóng)多樣性指數(shù)(H′)，計算公式如下[25]：

隸屬函數(shù)計算公式如下[26]：

Xi為所調(diào)查各指標(biāo)的測定值，Xmax、Xmin為樣品某一指標(biāo)的最大值、最小值。

1.4 營養(yǎng)品質(zhì)性狀測定

1.4.1 可溶性蛋白質(zhì)含量測定 參考王學(xué)奎等方法[27]進行測定。

1.4.2 有機酸含量測定 有機酸提取方法：預(yù)冷研缽，稱取2 g葉片，加入2.5 ml KH2PO4緩沖液，研磨均勻，再用2.5 ml KH2PO4緩沖液沖洗研缽，移至10 ml離心管中，定容，12 000 r/min離心10 min，取1 ml上清液，過0.22 μm濾膜，放入樣品瓶中采用二元梯度液相色譜儀進行測定。流動相A為緩沖液KH2PO4，流動相B為甲醇(色譜純)，流速0.5 ml/min，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm、214 nm，進樣量20 μl。

1.4.3 可溶性碳水化合物含量測定 可溶性碳水化合物的提取方法：稱取肉質(zhì)莖粉末0.84 g于試管中，加20 ml超純水，搖勻，沸水浴30 min，晾至室溫，將上清液倒入10 ml離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用蒸餾水定容至25 ml。取上清液1 ml，過0.22 μm過濾器，用高效液相色譜儀測定可溶性碳水化合物含量。流動相為超純水，進樣量5 μl，柱溫80 ℃，流速1 ml/min。

1.5 試驗儀器

可溶性碳水化合物含量測定儀器：日本島津高效液相色譜儀(RID-20A)，色譜柱Shodex SUGAR SC1011，預(yù)柱Shodex SUGAR SC- G6B，檢測器為示差檢測器。有機酸含量測定儀器：日本島津高效液相色譜儀(SPD-20A)，色譜柱Shodex SUGAR SC18，預(yù)柱Shim-pack GIST，檢測器為紫外檢測器。分光光度計：Specord210plus型可見光分光光度計(德國耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品)，離心機：AG 22331 Hamburg 型離心機(Eppendorf公司產(chǎn)品)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用萵苣種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀及營養(yǎng)品質(zhì)的遺傳多樣性分析

由表2可知，13份葉用萵苣種質(zhì)資源的16個性狀均呈現(xiàn)不同程度的多樣性，各指標(biāo)的變異系數(shù)范圍為17.94%～91.86%，其中蘋果酸含量的變異系數(shù)最高(91.86%)，變幅為882.13～9 528.48 μg/g，其余指標(biāo)的變異系數(shù)依次排列為葡萄糖含量(59.61%)>蔗糖含量(56.24%)>抗壞血酸含量(55.38%)>葉柄長(48.2%)>果糖含量(44.48%)>葉片數(shù)(38.41%)>葉柄厚(32.54%)>葉柄寬(27.51%)>葉寬(27.06%)>單株質(zhì)量(24.53%)>干質(zhì)量(24.06%)>株高(23.89%)>葉長(23.52%)> 鮮質(zhì)量(20.80%)，可溶性蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)最小，為17.94%，變化范圍為2.72～5.19 mg/g。其中葉柄長、葉柄厚、葉片數(shù)、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、抗壞血酸含量和蘋果酸含量變異系數(shù)均≥30%，具有較大的改良潛力。多樣性指數(shù)的變化范圍為1.38～1.99，以葉長為最大，其余依次是單株質(zhì)量>葡萄糖含量>抗壞血酸含量>葉寬>葉柄長=果糖含量>可溶性蛋白含量>株高=葉柄寬=葉柄厚=鮮質(zhì)量>干質(zhì)量>蔗糖含量>蘋果酸含量，葉片數(shù)的多樣性指數(shù)最小，為1.38，所有性狀的的多樣性指數(shù)均大于1.3。

表2 葉用萵苣種質(zhì)資源表型及品質(zhì)性狀的變異情況

2.2 葉用萵苣主要農(nóng)藝性狀的鑒定評價

葉片是葉用萵苣的主要食用部位[4]。13份葉用萵苣種質(zhì)資源中，結(jié)球萵苣1份，散葉萵苣12份。其中紫葉萵苣有6份，綠葉萵苣7份。各性狀調(diào)查結(jié)果見表3。由表3可以看出，葉用萵苣的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出多種類型，其中結(jié)球萵苣為綠葉萵苣(那羅)，且結(jié)球性較松。葉片形狀以提琴形為主，匙形次之。葉尖分為圓形、鈍尖、尖。葉緣以鈍齒狀為主。葉裂以無裂為主。葉面均有光澤。葉片顏色以淺綠色和紫紅色為主。

表3 13 份葉用萵苣種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)特征

2.3 葉用萵苣資源基本性狀的相關(guān)性

葉片是葉用萵苣加工利用的主要部分，在葉用萵苣栽培過程中，選擇葉片較長、較寬且單株質(zhì)量較大的資源具有重要意義。由表4可知，樣品干質(zhì)量與葉柄寬相關(guān)性最大，為0.890；葉寬與可溶性蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系，與葉片數(shù)呈負相關(guān)關(guān)系。葉長與葉柄長、果糖含量正相關(guān)，葉柄寬與葉柄厚正相關(guān)，樣品鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均與單株質(zhì)量極顯著正相關(guān)。在實際生產(chǎn)中，株高可以用葉長來衡量，而利用葉柄長短可以衡量葉片的長度，從而預(yù)測葉用萵苣的產(chǎn)量和品質(zhì)。

表4 葉用萵苣16個基本性狀的相關(guān)性

描述型性狀及分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.4 葉用萵苣資源來源及隸屬函數(shù)分析

由表5可知，13份葉用萵苣資源的隸屬函數(shù)均值介于0.427～0.532，隸屬函數(shù)均值為0.493。大于均值的資源名稱分別是京研羅馬、超級意大利、紅象、紅莎、綠雅、普希金、羅生1號、綠莎及貝爾紫。其中羅生1號均值最高(0.532)，原因是該材料在表型性狀上極具優(yōu)勢，尤其是集中在葉寬、鮮質(zhì)量及單株質(zhì)量方面。

表5 13份葉用萵苣資源10個性狀隸屬函數(shù)均值

2.5 葉用萵苣種質(zhì)資源聚類分析

利用SPSS16.0對13份葉用萵苣資源農(nóng)藝性狀進行聚類分析(圖1)，在歐氏距離為4處將13份葉用萵苣資源聚為5大類。其中，類群1中包括5份資源，該類資源的葉長分布在13.07～19.53 cm，干質(zhì)量分布在2.87～3.38 g，單株質(zhì)量分布在54.27～57.91 g。類群2包括1份資源。類群3包括3份資源，該類資源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，葉柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。類群4包括3份資源，該類資源的葉寬分布在10.93～11.40 cm，鮮質(zhì)量主要分布在75.38～76.36 g。類群5包括1份資源。

圖1 13份葉用萵苣資源基于10個性狀的聚類結(jié)果

2.6 葉用萵苣種質(zhì)資源主成分分析

以特征值大于1、方差貢獻率在80%以上為標(biāo)準(zhǔn)，對葉用萵苣16個指標(biāo)進行主成分分析，得到累計方差貢獻率為95.44%，可以解釋近90%的遺傳信息。

質(zhì)量指標(biāo)聚類分析可以從多個維度分析評價指標(biāo)[28-29]。由表6可知，第1主成分因子能夠反映原始數(shù)據(jù)中41.804%的信息，其中與株高、葉長和葉寬相關(guān)的指數(shù)因子載荷值高于0.817。第2主成分因子的方差貢獻率為21.157%，主要由樣品的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量決定，負荷值分別為0.811和0.691。葉用萵苣的產(chǎn)量取決于植株高度、葉片長度、葉片寬度和鮮質(zhì)量[30]，增加其中一個可以提高產(chǎn)量，因此第1和第2主要成分可以定義為產(chǎn)量影響因子。第3主成分因子的方差貢獻率為18.093%，決定其大小的分別為單株質(zhì)量、可溶性蛋白質(zhì)含量和抗壞血酸含量，特征值分別為0.419、0.663和0.701。決定第4主成分大小的因子主要為葉柄厚及葉片數(shù)，特征值分別為0.474和0.650。第5主成分因子的方差貢獻率為6.798%，各指標(biāo)之間相差不大，僅抗壞血酸、果糖含量等表現(xiàn)較為突出，因此可將第3、4、5主成分命名為營養(yǎng)成分影響因子。前5個主成分共篩選出株高、鮮質(zhì)量、單株質(zhì)量、可溶性蛋白質(zhì)含量、葉柄厚、抗壞血酸含量、果糖含量7個代表性指標(biāo)，作為葉用萵苣種質(zhì)資源評選和選育工作的重要指標(biāo)。

表6 葉用萵苣種質(zhì)資源主成分特征值

以X1～X16分別代表標(biāo)準(zhǔn)化的16個指標(biāo)數(shù)據(jù)數(shù)值代入到2個主成分中，獲得5個主成分因子得分公式[31-32]如下：F1=0.096X1+0.094X2+0.849X3+0.367X4+0.744X5+0.784X6-0.517X7+0.303X8+0.637X9+0.681X10+0.641X11+0.156X12+0.601X13+0.871X14+0.333X15+0.507X16，F(xiàn)2=-0.199X1-0.224X2+0.048X3-0.870X4+0.556X5+0.152X6-0.482X7+0.811X8+0.691X9+0.431X10+0.075X11+0.105X12-0.095X13-0.217X14-0.160X15-0.743X16，F(xiàn)3=-0.229X1-0.338X2+0.272X3+0.238X4-0.184X5+0.077X6-0.041X7+0.328X8-0.146X9+0.419X10+0.663X11-0.941X12-0.452X13-0.44X14+0.701X15+0.189X16，F(xiàn)4=-0.236X1-0.008X2-0.387X3+0.096X4+0.044X5+0.474X6+0.650X7-0.087X8+0.044X9-0.014X10-0.159X11-0.167X12+0.322X13+0.216X14+0.306X15+0.208X16，F(xiàn)5=0.164X1+0.057X2-0.115X3-0.132X4+0.267X5-0.180X6+0.110X7-0.303X8+0.290X9-0.340X10+0.135X11+0.147X12-0.553X13+0.174X14+0.493X15+0.009X16。各指標(biāo)綜合得分公式為F=0.418F1+0.212F2+0.181F3+0.076F4+0.068F5，按照計算公式得到葉用萵苣種質(zhì)資源綜合得分。綜合得分越大，種質(zhì)資源越好。由表7可知，綜合得分排名較高的4個品種依次為普希金(3.65)>超級意大利(3.47)>綠雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在種質(zhì)資源應(yīng)用中可優(yōu)先考慮這些品種。

表7 葉用萵苣性狀綜合評價表

2.7 葉用萵苣農(nóng)藝性狀顯著性差異分析

由表8可知，各品種之間農(nóng)藝性狀存在顯著差異。貝爾紫的株高最高，為27.27 cm，株高最小的品種為那羅(13.83 cm)。葉長最大的品種為京研羅馬(25.33 cm)，最短的品種為鳳蝶(11.27 cm)。葉寬值最大的品種為紅莎，最小的品種為鳳蝶(僅為5.17 cm)。葉柄最長的品種為綠雅，京研羅馬次之；葉柄最寬的為普希金，最窄的為鳳蝶；葉柄厚最厚的為超級意大利，最薄的為紅莎(0.91 mm)；葉片數(shù)最多的品種為鳳蝶，最少的品種為紅莎和綠雅。樣品鮮質(zhì)量和干質(zhì)量最大的品種為超級意大利和普希金，最低的品種均為鳳蝶。單株質(zhì)量最大的為超級意大利，京研羅馬次之。綜上所述，京研羅馬的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好，在品種選育時可重點關(guān)注該品種。

表8 13份葉用萵苣資源農(nóng)藝性狀差異顯著性分析

2.8 葉用萵苣營養(yǎng)成分差異顯著性分析

由圖2可知，綠莎的抗壞血酸含量最高，為290.35 μg/g，含量最低的為羅生1號(29.53 μg/g)。蘋果酸的含量最高的品種為京研羅馬(9 528.48 μg/g)，最低的品種為普希金(882.13 μg/g)。貝爾紫中可溶性蛋白質(zhì)含量最高，為5.19 mg/g，含量最低的品種為雅丹，僅為2.72 mg/g，極差為2.47 mg/g。葉片中果糖含量最高的品種為綠雅，達到215.43 mg/g，超級意大利次之，果糖含量為181.08 mg/g，鳳蝶的果糖含量最低，僅為43.91 mg/g。葡萄糖含量最高的品種為超級意大利，為226.51 mg/g。蔗糖含量最高的品種為貝爾紫，為221.46 mg/g，紅莎的蔗糖含量最低，為27.62 mg/g。綜上所述，貝爾紫的可溶性蛋白質(zhì)含量及蔗糖含量較高，在生產(chǎn)中可根據(jù)需求培育高品質(zhì)的品種。

A:綠雅；B：超級意大利；C：羅生1號；D：貝爾紫；E：紅象；F：綠莎；G：京研羅馬；H：雅丹；I：那羅；J：紅莎；K：鳳蝶；L：普希金；M：京研意大利。同一指標(biāo)中不同小寫字母代表0.05水平差異顯著。

3 討論

3.1 葉用萵苣資源表型性狀及營養(yǎng)品質(zhì)的多樣性

植物的表型性狀具有較為直觀、便于調(diào)查等特點，是評價種質(zhì)資源多樣性的重要指標(biāo)。表型性狀受遺傳因素與環(huán)境因素的共同影響。株型中的重要表型性狀是株高和莖粗，能夠反映植株的活力及生長狀況[33]。本研究對13份葉用萵苣的10個農(nóng)藝性狀及6個營養(yǎng)成分進行多樣性指數(shù)計算、主成分分析、生理指標(biāo)的測定，結(jié)果表明這些種質(zhì)資源的遺傳背景較為豐富，這與小麥[34]、高粱[35-36]、黃瓜[37]等其他作物的研究結(jié)果相似。變異系數(shù)通常用來反映性狀之間的離散程度以及在種質(zhì)資源之間的變異程度[38-39]。本研究中測得的指標(biāo)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均大于10%，變異系數(shù)最大的是蘋果酸含量，為85%，變化范圍為882.13～9 528.48 μg/g，可溶性蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)最小(17.94%)，變化范圍為2.72～5.19 mg/g，表明所收集到的資源遺傳多樣性較為豐富。

3.2 葉用萵苣種質(zhì)資源表型性狀及營養(yǎng)品質(zhì)的綜合評價

基于主成分分析進行種質(zhì)資源表型性狀評價已廣泛應(yīng)用于西瓜[40]、番茄[41]、桃子[42]、柑橘[43]等作物。本研究中將16個性狀分為5個主成分，累計貢獻率達到95.44%，將1、2、3主成分歸為產(chǎn)量影響因子，4、5主成分歸為營養(yǎng)成分影響因子， 各主成分所包含的性狀可以作為葉用萵苣種質(zhì)資源創(chuàng)新的參考。

聚類分析可根據(jù)性狀的相似程度對資源進行分類，用于反映親緣關(guān)系的遠近[44-46]?；诒硇托誀顚ξ锓N進行聚類分析已被廣泛應(yīng)用于蔬菜研究中。如王業(yè)社等[47]利用聚類分析方法將紫薇品種劃分為5大類群，將具有相對一致特征的品種劃分為一個類群，組群間具有較大的差異。本研究把13份葉用萵苣材料分為5個群，類群1中包括6份資源，該類資源的葉長分布在13.07～19.53 cm，干質(zhì)量分布2.87～3.38，單株質(zhì)量分布在54.27～57.91 g。類群2包括1份資源。類群3包括3份資源，該類資源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，葉柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。類群4包括3份資源，該類資源的葉寬分布在10.93～11.40 cm，鮮質(zhì)量主要分布在75.38～76.36 g。類群5包括1份資源。開展種質(zhì)資源評價是種質(zhì)資源篩選的主要環(huán)節(jié)，根據(jù)篩選結(jié)果可以選出大量優(yōu)異種質(zhì)資源。本研究根據(jù)綜合得分對13份葉用萵苣種質(zhì)資源進行評價，綜合得分排名較高的4個品種依次為普希金(3.65)>超級意大利(3.47)>綠雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在后續(xù)品種選育過程中可根據(jù)品種抗逆性及產(chǎn)量穩(wěn)定性等持續(xù)觀測。