陳亞輝， 張師瑒， 楊慶山， 宋志忠， 姜 姜

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京210037；2.不列顛哥倫比亞大學(xué)理學(xué)院，溫哥華V6T 1Z4；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院鹽堿地造林試驗(yàn)站，山東濟(jì)南250000；4.魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院，山東煙臺(tái)264039)

鹽漬土在全球分布廣泛，其土壤中鹽分含量高，土壤理化性質(zhì)差，嚴(yán)重危害植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1-3]。鹽漬土含有大量的Na+類鹽分，Na+能夠破壞蛋白質(zhì)和膜的穩(wěn)定性，產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS(Reactive oxygen species)信號(hào)的產(chǎn)生，使植物細(xì)胞功能紊亂，影響植物正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[4-6]。近二十年來(lái)，受全球人類活動(dòng)和氣候變化的影響，鹽漬土面積不斷擴(kuò)大[7]，如何科學(xué)修復(fù)鹽漬化土壤和改善生態(tài)環(huán)境成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)[8]。

多枝檉柳(TamarixramosissimaLcdcb)屬于雙子葉泌鹽鹽生植物[9]，能通過(guò)被稱為囊狀毛狀體或“鹽腺”的特殊結(jié)構(gòu)將鹽從葉片表面排出[10]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，多枝檉柳形成了耐鹽、耐干旱、抗風(fēng)沙等優(yōu)良特性，以適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境。在檉柳屬植物中，對(duì)剛毛檉柳(TamarixhispidaWilld.)耐鹽分子機(jī)制的研究較為深入。Lei等[11]發(fā)現(xiàn)在150 mmol/L NaCl脅迫條件下，剛毛檉柳ThCOL2基因過(guò)表達(dá)后，可通過(guò)調(diào)控保護(hù)酶的活性并降低體內(nèi)O2·-和H2O2的積累，進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳對(duì)ROS的清除能力，以減少細(xì)胞損傷和死亡，增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力。因此，推測(cè)ThCOL2基因能夠響應(yīng)鹽脅迫。王培龍等[12]在剛毛檉柳中通過(guò)克隆獲得ThPP2C基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因參與植物耐鹽脅迫和脫落酸、茉莉酸等激素應(yīng)答。此外，有關(guān)多枝檉柳耐鹽研究多集中在其在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)和生理響應(yīng)，如魯艷等[13]發(fā)現(xiàn)低濃度(≤100 mmol/L)NaCl脅迫會(huì)促進(jìn)多枝檉柳的生長(zhǎng)，而高濃度(≥200 mmol/L)NaCl脅迫則抑制其生長(zhǎng)；劉詠梅等[14]采用液體培養(yǎng)法分析了甘肅檉柳(T.gansuensisH.Z.Zhang)、多枝檉柳和細(xì)穗檉柳(T．leptostachysBunge)3種檉柳材料在不同濃度NaCl脅迫條件下的生理指標(biāo)和SOS1基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，3種多枝檉柳表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力，可將多枝檉柳作為檉柳屬代表性植物進(jìn)行耐鹽機(jī)制研究。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)已被廣泛用于植物抗逆研究，對(duì)揭示植物耐鹽的分子機(jī)理起到推動(dòng)作用[15-16]。WRKY、bHLH、bZIP、NAC、MYB、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子均參與鹽脅迫[17-27]。張惠媛等[17]的研究結(jié)果表明，小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY33受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和小麥的耐鹽性；屈興紅等[28]研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因來(lái)參與調(diào)控超氧化物歧化酶(SOD)等氧化還原酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以適應(yīng)鹽脅迫；練冬梅等[29]發(fā)現(xiàn)黃秋葵在鹽脅迫處理24 h后，MYB4轉(zhuǎn)錄因子基因呈上調(diào)表達(dá)，黃秋葵幼苗耐鹽性增強(qiáng)；Wang等[30]研究剛毛檉柳ThbZIP1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ThbZIP1可以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶的活性，并增加可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量，這表明ThbZIP1是通過(guò)介導(dǎo)多種生理途徑的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)耐鹽性。此外，MAPK(Mitogen-activated protein kinase)級(jí)聯(lián)是廣泛存在于真核生物中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[31]，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。它由MAPKKK-MAPKK-MAPK3類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，通過(guò)磷酸化將信號(hào)進(jìn)行傳遞和放大[32]。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑作用于下游靶蛋白進(jìn)而激活相應(yīng)的抗逆基因表達(dá)，調(diào)節(jié)滲透平衡、離子平衡以及氧化還原平衡，從而提高植物抵抗逆境脅迫的能力。有研究結(jié)果表明MKK4/5-MAPK3/MAPK6在信號(hào)傳遞過(guò)程中通過(guò)未知的機(jī)制啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子WRKY22/WRKY29，誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)[33]。Teige等[34]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtMEKK1-AtMAPKK2-AtMAPK4/AtMAPK6反應(yīng)途徑在抵抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用，能夠提高對(duì)鹽脅迫的抗性。

本研究以多枝檉柳為研究材料，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選200 mmol/L NaCl脅迫處理下葉片中的差異表達(dá)基因，并利用qRT-PCR驗(yàn)證候選基因的表達(dá)差異，從轉(zhuǎn)錄水平揭示多枝檉柳響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵基因及其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為研究檉柳屬植物耐鹽機(jī)制提供理論支撐和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試多枝檉柳由山東省林業(yè)科學(xué)院東營(yíng)試驗(yàn)基地提供，試驗(yàn)于2019年10月-2021年3月在南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。選取5個(gè)月苗齡、長(zhǎng)勢(shì)相近的多枝檉柳扦插苗轉(zhuǎn)移至盛有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的24孔水培箱(尺寸為40 cm×30 cm×16 cm)中，放置于溫度(26±2) ℃、相對(duì)濕度40%～55%的溫室大棚中馴化培養(yǎng)2個(gè)月后備用。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和處理組，每組8株，3次重復(fù)。以1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)多枝檉柳為對(duì)照組(CK)，以添加200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)多枝檉柳為處理組，每3 d更換1次培養(yǎng)液。分別在處理0 h、48 h、168 h時(shí)采集葉片樣品，并立即放置于液氮中處理，然后移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

液氮處理后的葉片樣品送往基迪奧生物科技(廣州)有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用Illumina HiSeqTM4000將純化后的PCR產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作在平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序(PE150)分析，利用Fastp軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到過(guò)濾后的數(shù)據(jù)，使用Trinity軟件[35]對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。首先將具有一定長(zhǎng)度的重疊的過(guò)濾后的數(shù)據(jù)連成更長(zhǎng)的片段，通過(guò)數(shù)據(jù)重疊得到不含高于RawReads百分比的組裝片段，組裝出Unigene，再使用BLAST2 GO[36]和KOBAS[37]得到GO功能和KEGG注釋。

1.4 差異基因篩選

使用DESeq2[38]軟件對(duì)測(cè)序所得的reads count數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到最終正確的FDR值(經(jīng)過(guò)BH校正后的P值)，F(xiàn)DR<0.05被認(rèn)為是顯著富集。基于差異分析結(jié)果，我們篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因?yàn)轱@著差異基因。

1.5 qRT-PCR驗(yàn)證

利用Omega Bio-Tek公司(美國(guó))的Omega試劑盒提取葉片材料的總RNA，采用寶生物工程 (大連) 有限公司 的PrimerScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成1鏈cDNA作為模板。設(shè)計(jì)DEGs特異性表達(dá)引物，使用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的PowerUpTMSYBR Green Master mix試劑，在應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI ViiATM7 Real-time PCR system儀器進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，所用引物見(jiàn)表1，每個(gè)候選基因進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。以Actin為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法[39]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

表1 特異性表達(dá)引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 利用IlluminaHiSeqTM4000進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在200 mmol/L NaCl脅迫條件下，多枝檉柳葉片在處理0 h、48 h和168 h時(shí)均得到多條高質(zhì)量堿基序列(堿基長(zhǎng)度：6 017 997 220～6 782 061 623 bp)，且Q20、Q30分別達(dá)到95%以上和90%以上，且G+C含量均達(dá)到44%以上(表2)，表明本研究開展的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，符合進(jìn)一步研究的要求。

表2 堿基信息統(tǒng)計(jì)表

2.1.2 Unigene基本注釋 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，共拼接獲得105 702個(gè)Unigene，在NR、KEGG、KOG和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因注釋的Unigene分別有53 385個(gè)、46 062個(gè)、31 587個(gè)和36 087個(gè)，同時(shí)在這4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均有注釋的Unigene共27 670個(gè)(圖1)。

圖1 NaCl脅迫下多枝檉柳葉片表達(dá)基因注釋到4大數(shù)據(jù)庫(kù)的韋恩圖

2.2 差異表達(dá)基因數(shù)量分析

將多枝檉柳在NaCl脅迫處理后0 h、48 h和168 h的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)與對(duì)照進(jìn)行比較，以FDR<0.05且|log2FC|>1篩選差異表達(dá)基因。在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48h比較組中共檢測(cè)到11 754個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，其中6 374個(gè)基因的表達(dá)水平上調(diào)，5 380個(gè)基因的表達(dá)水平下調(diào)；在200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168h比較組中共11 645個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了改變，有3 837個(gè)基因的表達(dá)水平受NaCl脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，7 808個(gè)基因的表達(dá)水平受抑制下調(diào)；在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中共檢測(cè)到7 768個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生改變，其中2 542個(gè)基因受NaCl脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，5 226個(gè)基因的表達(dá)水平受抑制下調(diào)(圖2)。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見(jiàn)表2注。

2.3 差異表達(dá)基因的GO分析

通過(guò)GO注釋分析，上述差異表達(dá)基因(DEGs)可分為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類別，共51個(gè)不同分類組(圖3)。在生物過(guò)程大類中，DEGs主要富集在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單有機(jī)體過(guò)程和刺激響應(yīng)中；在分子功能大類中，DEGs主要富集在催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和結(jié)構(gòu)分子活性；在細(xì)胞成分大類中，DEGs主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器和膜。此外，隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，上調(diào)的DEGs數(shù)量顯著減少，且DEGs整體數(shù)量下降。由此推測(cè)，隨著高鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，多枝檉柳葉片在轉(zhuǎn)錄水平有大量DEGs表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。

A表示CK -0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見(jiàn)表2注。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對(duì)上述DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，根據(jù)其不同的代謝和信號(hào)通路可分為5個(gè)KEGG通路分支，包括代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和細(xì)胞過(guò)程，這5個(gè)通路分支又進(jìn)一步分成19個(gè)小類(圖4)，更加直觀地顯示了多枝檉柳在鹽脅迫下發(fā)生調(diào)節(jié)和改變的代謝過(guò)程和信號(hào)通路。特別地，CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和細(xì)胞過(guò)程通路分支的差異基因分別為1 882個(gè)、716個(gè)、132個(gè)、121個(gè)和99個(gè)。在200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和細(xì)胞過(guò)程等通路分支的差異基因分別為1 700個(gè)、446個(gè)、146個(gè)、103個(gè)和87個(gè)。在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和細(xì)胞過(guò)程等通路分支的差異基因分別為1 514個(gè)、545個(gè)、121個(gè)、80個(gè)和69個(gè)。在3個(gè)比較組中，參與代謝通路分支的差異表達(dá)基因最多，參與細(xì)胞過(guò)程通路分支的差異表達(dá)基因最少。此外，隨著高鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，5個(gè)KEGG通路分支的DEGs數(shù)量均逐漸下降，其中，遺傳信息處理通路中的下降最為明顯。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見(jiàn)表2注。a:代謝；b：遺傳信息處理；c：環(huán)境信息處理；d：有機(jī)系統(tǒng)；e：細(xì)胞過(guò)程。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

由KEGG通路分析結(jié)果可知，在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h和CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中分別注釋到的1 762個(gè)、1 426個(gè)和1 366個(gè)DEGs，并分別富集到129個(gè)、133個(gè)和127個(gè)KEGG通路中(圖5)，更加直觀地反映出植物鹽脅迫下是哪些代謝通路的表達(dá)發(fā)生了變化。其中，在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h比較組中，在前20個(gè)KEGG通路中，核糖體(ko03010)注釋到435個(gè)DEGs，占24.69%，其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、植物病原體相互作用(ko04626)、苯丙烷生物合成(ko00940)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)和植物MAPK信號(hào)通路(ko04016)，分別注釋到416個(gè)(23.61%)、88個(gè)(4.99%)、69個(gè)(3.92%)、69個(gè)(3.92%)和59個(gè)(3.35%)DEGs。200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在前20個(gè)通路中，代謝途徑(ko1100)通路注釋到684個(gè)DEGs，占47.97%；其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)、植物病原體相互作用(ko04626)、植物MAPK信號(hào)通路(ko04016)和苯丙烷生物合成(ko00940)等，分別注釋到382個(gè)(26.79%)、82個(gè)(5.75%)、72個(gè)(5.05%)、64個(gè)(4.49%)和59個(gè)(4.14%)DEGs。CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在前20個(gè)通路中，代謝途徑(ko1100)通路注釋到614個(gè)DEGs，占44.95%；其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、核糖體(ko03010)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)、植物病原體相互作用(ko04626)和植物MAPK信號(hào)通路(ko04016)等，分別注釋到351個(gè)(25.70%)、296個(gè)(21.67%)、72個(gè)(5.27%)、63個(gè)(4.61%)和49個(gè)(3.59%)DEGs。由此可知，多枝檉柳受到高鹽脅迫后，DEGs在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原體相互作用、植物MAPK信號(hào)通路和苯丙烷生物合成等KEGG通路上顯著富集。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見(jiàn)表2注。

2.6 注釋到KEGG通路的關(guān)鍵差異表達(dá)基因分析

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境中起到主要作用，尤其是在響應(yīng)鹽脅迫中具有重要作用。本研究有8個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因注釋到KEGG通路中，主要為WRKY和bZIP 2種類型。

注釋到KEGG通路(ko04626和ko04016)中響應(yīng)鹽脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因共5個(gè)，其中Unigene0010090、Unigene0077293和Unigene0079542在處理0 h、48 h和168 h時(shí)的表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢(shì)，而Unigene0014406和Unigene0024962在處理0 h、48 h和168 h時(shí)的表達(dá)水平一直呈上升趨勢(shì)(表3)。有3個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因注釋到KEGG通路(ko04016、ko01100、ko01110、ko01200、ko01212、ko04146、ko00071、ko00640、ko00410、ko01040、ko00592和ko04075)來(lái)參與鹽脅迫的調(diào)控，其中Unigene0026888和Unigene0008868在處理0 h、48 h和168 h時(shí)的表達(dá)水平呈先上升后下降趨勢(shì)，而Unigene0010561在0 h、48 h和168 h時(shí)的表達(dá)水平呈先下降后上升趨勢(shì)(表3)。

表3 注釋到KEGG通路的轉(zhuǎn)錄因子基因

2.7 KEGG通路中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析

MAPK級(jí)聯(lián)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)等生理過(guò)程。由圖6可知，CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h和200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在KEGG 通路中，DEGs表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。

由圖6可知，本研究中共有16個(gè)DEGs參與NaCl脅迫條件下MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在病原體攻擊——細(xì)胞死亡和H2O2產(chǎn)生(圖6A)信號(hào)傳遞過(guò)程中MKK4/MKK5、MPK3/MPK6和WRKY22/WRKY29含有的基因(Unigene0054151、Unigene0055797和Unigene0070215)、病原體攻擊—— 植物防御中活性氧的積累(圖6A)信號(hào)傳遞過(guò)程中MPK4含有的基因(Unigene0016609)以及鹽——耐鹽性(圖6B)信號(hào)傳遞過(guò)程中MKK4/6含有的基因(Unigene0016609)表達(dá)均在0 h、48 h和168 h呈先下降后上升趨勢(shì)。

圖6A表明，H2O2可以激活A(yù)NP1-MKK4/MKK5-MAPK3/MAPK6信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。本研究中，多枝檉柳在受到鹽脅迫后，信號(hào)從MKK4/MKK5傳遞到MPK3/MPK6過(guò)程中，在NaCl處理168 h時(shí)可能啟動(dòng)了WRKY22/WRKY29防御基因，導(dǎo)致表達(dá)上調(diào)(圖6A、表4)；同時(shí)，鹽脅迫下MEKK1被激活后，又激活了MKK2，再直接靶向MPK4/MPK6，組成MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6模塊介導(dǎo)抵御鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)(圖6B、表4)。此外，在病原體攻擊—— 植物防御中活性氧積累的信號(hào)傳遞過(guò)程中，MEKK1在鹽脅迫下被激活，傳遞給未知機(jī)制，再到達(dá)MPK4，最終形成一個(gè)防御活性氧積累信號(hào)。其中，圖6A中的MPK4和圖6B中的MPK4/MPK6中都包含相同基因(Unigene0016609)，且激活過(guò)程相近。由此推斷，鹽脅迫下在病原體攻擊—— 植物防御中活性氧積累的信號(hào)傳遞過(guò)程中，可能是MKK2激活了MPK4。

在鹽脅迫——脅迫適應(yīng)信號(hào)傳遞過(guò)程中，由脫落酸(ABA)信號(hào)傳遞給PYR/PYL信號(hào)，在PYR/PYL信號(hào)傳遞中有2個(gè)基因(Unigene0071368和Unigene0030832)表達(dá)在鹽脅迫0 h、48 h和168 h后呈先下降后上升趨勢(shì)；有3個(gè)基因(Unigene0011883、Unigene0017324和Unigene0005290)表達(dá)在鹽脅迫0 h、48 h和168 h后呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)信號(hào)傳遞到PP2C時(shí)，有3個(gè)基因(Unigene0002530、Unigene0087395和Unigene0051628)在0 h、48 h和168 h時(shí)表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)，與信號(hào)傳遞到SnRK2時(shí)Unigene0056876基因的表達(dá)一致。信號(hào)傳遞到MAPKKK17/MAPKKK18時(shí)，有1個(gè)基因(Unigene0025820)在0 h、48 h和168 h時(shí)表達(dá)一直下調(diào)。經(jīng)MAPKKK17/MAPKKK18信號(hào)傳遞到MPK1/MPK2時(shí)，Unigene0064719基因表達(dá)在0 h、48 h和168 h中呈先下降后上升趨勢(shì)(圖6C，表4)。由此可以推論，在ABA信號(hào)中SnRK2起主要的調(diào)控作用。多枝檉柳受到高鹽脅迫后，SnRK2與ABA結(jié)合的PYR/PYL蛋白和PP2C相互作用并抑制其活性，使SnRK2始終保持磷酸化活性狀態(tài)，來(lái)激活脅迫響應(yīng)途徑。

A：病原體攻擊——細(xì)胞死亡和H2O2產(chǎn)生;B:鹽——耐鹽性;C:鹽脅迫——脅迫適應(yīng)。a：CK1-0 h;b：CK2-0 h;c：CK3-0 h;d：NaCl1-48 h;e：NaCl2-48 h;f：NaCl3-48 h;g：NaCl1-168 h;h：NaCl2-168 h;i：NaCl3-168 h；CK1-0 h、CK2-0 h、CK3-0 h、NaCl1-48 h、NaCl2-48 h、NaCl3-48 h、NaCl1-168 h、NaCl2-168 h、NaCl3-168 h見(jiàn)表2注。

表4 MAPK信號(hào)途徑相關(guān)的KEGG基因注釋

2.8 qRT-PCR驗(yàn)證

本研究隨機(jī)選取8個(gè)與耐鹽相關(guān)的DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果(表5)顯示，Unigene0104732、Unigene0083695和Unigene0069097基因表達(dá)水平受NaCl脅迫誘導(dǎo)呈先上升后下降趨勢(shì)；Unigene0024962響應(yīng)NaCl脅迫，表達(dá)水平顯著上升，Unigene0090596、Unigene0007135和Unigene0088781基因表達(dá)水平受NaCl脅迫影響先下降后上升，而Unigene0028215基因表達(dá)水平受NaCl抑制顯著下降。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果完全一致(圖7)，證明本研究所得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的，可為研究多枝檉柳耐鹽機(jī)制提供基因資源和轉(zhuǎn)錄水平依據(jù)。

表5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的表達(dá)變化

CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見(jiàn)表2注。

3 討論

檉柳屬(TamarixLinn.)植物在適應(yīng)環(huán)境的長(zhǎng)期過(guò)程中演變出一系列復(fù)雜的機(jī)制抵抗鹽脅迫。從分子層面來(lái)講，植物響應(yīng)鹽脅迫是一個(gè)多基因參與及調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，涉及代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、能量產(chǎn)生和運(yùn)輸、離子滲透和轉(zhuǎn)運(yùn)等諸多通路的相關(guān)基因[40-41]。因此，對(duì)多枝檉柳植物進(jìn)行全面的轉(zhuǎn)錄組分析，有助于揭示檉柳屬植物應(yīng)答鹽脅迫環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制。

檉柳屬植物長(zhǎng)期以來(lái)進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)非生物脅迫的不利逆境[42]，轉(zhuǎn)錄因子是所有非生物脅迫反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)因子[43]。WRKY是轉(zhuǎn)錄因子的大家族之一，已被證明參與多種代謝過(guò)程，并在與植物生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄重編程調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[44-46]。本研究中，編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的Unigene0024962在200 mmol/L NaCl處理48 h和168 h后表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Unigene0079542的表達(dá)水平在200 mmol/L NaCl處理48 h時(shí)出現(xiàn)下降，而在168 h時(shí)呈上升，表明隨著鹽脅迫時(shí)間的變化，Unigene0079542響應(yīng)鹽脅迫的方式發(fā)生了改變，與大豆[47]和長(zhǎng)葉紅砂[48]中WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因受NaCl處理而上調(diào)的報(bào)道相類似。然而，與本研究結(jié)果相反的是，Lin等[49]發(fā)現(xiàn)辣椒CaWRKY27基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量受NaCl脅迫而下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子Unigene0014406持續(xù)受NaCl脅迫處理的誘導(dǎo)，暗示該基因可能持續(xù)參與鹽生植物多枝檉柳響應(yīng)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。此外，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)和環(huán)境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[50-51]。多枝檉柳葉片中bZIP轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Unigene0008868表達(dá)受NaCl誘導(dǎo)而顯著上調(diào)，這與Huang等[52]在苧麻中發(fā)現(xiàn)的bZIP2表達(dá)規(guī)律相似，并暗示bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。同時(shí)，MYB是植物體內(nèi)數(shù)量和功能最多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在非生物脅迫中也起到非常重要的作用[53-55]。本研究中MYB編碼基因Unigene0088781在多枝檉柳葉片中的表達(dá)水平受NaCl脅迫先下降后上升，暗示該基因在受NaCl脅迫一定時(shí)間后才開始響應(yīng)鹽脅迫，類似現(xiàn)象已在紫花苜蓿幼苗[56]和玫瑰花瓣[57]中報(bào)道。綜上可知，WRKY、MYB和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子參與多枝檉柳應(yīng)答鹽脅迫的調(diào)控過(guò)程。

植物MAPK級(jí)聯(lián)的功能包括參與生長(zhǎng)發(fā)育、抗病反應(yīng)、非生物脅迫應(yīng)答和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程[58-64]。已有研究結(jié)果表明，MEKK1-MPK4能夠介導(dǎo)水稻的鹽脅迫信號(hào)，水稻在鹽脅迫下，OsMEKK1基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，且OsMEKK1會(huì)磷酸化OsMPK4，而NaCl脅迫激活水稻中OsMEKK1和OsMPK4的酶活性進(jìn)而調(diào)控水稻對(duì)NaCl的耐受性，并且MEKK1-MPK4級(jí)聯(lián)通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)介導(dǎo)鹽信號(hào)[31,65]。Mehlmer等[66]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，鹽脅迫下的MKK2-MPK4/MPK6途徑負(fù)責(zé)適應(yīng)鹽脅迫。與前人研究結(jié)果[66]相同的是，本研究中多枝檉柳可能也是通過(guò)MEKK1-MPK4和MKK2-MPK4/MPK6途徑響應(yīng)鹽脅迫信號(hào)。此外，MAPK級(jí)聯(lián)還參與植物多種激素信號(hào)，包括水楊酸(SA)[67]、生長(zhǎng)激素(AUX)[68]、脫落酸(ABA )[69]和茉莉酸(JA)[70]等，其中，脫落酸參與高等植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆等生理過(guò)程，在非生物脅迫中起著關(guān)鍵作用，高鹽、高溫等非生物脅迫可刺激植物體內(nèi)脫落酸的合成，并啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)途徑來(lái)激活植物抗逆機(jī)制[71]。ABA-PYR-PP2C-SnRK2負(fù)責(zé)脫落酸信號(hào)感應(yīng)和傳遞的中央信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，PYR/PYL/RCAR家族成員幾乎都參與了脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[72-73]。本研究中多枝檉柳在NaCl脅迫下也可能形成PYR-PP2C-SnRK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，進(jìn)而參與脫落酸激活，啟動(dòng)抗鹽機(jī)制。

4 結(jié)論

在高鹽脅迫下，WRKY、MYB和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子參與多枝檉柳的耐鹽調(diào)節(jié)過(guò)程；高鹽脅迫下多枝檉柳的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)響應(yīng)鹽脅迫。本研究為進(jìn)一步研究多枝檉柳耐鹽分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。