陳 平,李林海,吳 為

(重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院,中國重慶 404100)

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關(guān)死亡的第4大病因,其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的病理類型[1]。由于高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,進(jìn)展期肝癌患者的5年生存率仍較低。另一方面,肝癌細(xì)胞耐藥的發(fā)展,使得現(xiàn)有靶向藥物的治療效果并不理想。因此,深入探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找與預(yù)后有關(guān)的生物標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄延伸因子B1(transcription elongation factor B subunit 1,TCEB1),又名延伸蛋白C(elongin C,ELOC),和延伸蛋白A/A2、延伸蛋白B一起組成轉(zhuǎn)錄因子B(SⅢ)復(fù)合體,通過與RNA多聚酶Ⅱ的直接相互作用,激活轉(zhuǎn)錄延長[2]。研究表明,TCEB1基因的突變和拷貝數(shù)擴(kuò)增分別與腎癌和前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3～5],但TCEB1基因在肝癌中的表達(dá)、改變情況及臨床意義尚不清楚。本研究利用生物信息分析工具對(duì)肝細(xì)胞癌患者腫瘤樣本、癌旁正常組織或健康對(duì)照樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析,探索TCEB1基因在肝癌中的表達(dá)、改變情況、預(yù)后價(jià)值及其潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 GEPIA2分析

GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2;http://gepia2.cancer-pku.cn;2021-07-05)[6]是一個(gè)可分析9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)健康樣本RNA序列數(shù)據(jù)的網(wǎng)站服務(wù)器,其樣本來自于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因型組織表達(dá)數(shù)據(jù)集(The Genotype-tissue Expression,GTEx)。本研究利用該平臺(tái)分析TCEB1在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)差異,以及TCEB1 mRNA水平和肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。參數(shù)設(shè)置全部選擇默認(rèn)。

1.2 UALCAN分析

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/;2021-07-05)[7]可在線分析TCGA數(shù)據(jù),比較腫瘤分級(jí)、分期、患者年齡、種族、腫瘤分子亞型等不同臨床病理特征與基因表達(dá)的相關(guān)性。本研究利用該平臺(tái)分析TCEB1基因表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。參數(shù)設(shè)置全部選擇默認(rèn)。

1.3 cBioPortal分析

cBioPortal(http://www.cbioportal.org;2022-09-28)[8]包含多個(gè)數(shù)據(jù)庫,如TCGA和國際癌癥基因組聯(lián)盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)等,共涉及283項(xiàng)大型腫瘤相關(guān)的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究,并提供分析癌癥相關(guān)基因數(shù)據(jù)的可視化工具。本研究利用cBioPortal分析肝癌組織中TCEB1基因的改變情況(如基因突變、擴(kuò)增等)及其與患者預(yù)后的關(guān)系。參數(shù)設(shè)置全部選擇默認(rèn)。

1.4 TCEB1相關(guān)基因及其富集分析

LinkedOmics(http://www.linkedomics.org/login.php;2021-07-05)[9]是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的分析平臺(tái),可分析來自TCGA的32種原發(fā)性腫瘤的多組學(xué)數(shù)據(jù)。LinkFinder是LinkedOmics的一個(gè)分析模塊,在本研究中用于探究TCEB1的相關(guān)基因,結(jié)果以火山圖、熱圖呈現(xiàn)。條件設(shè)置如下:1)“Cancer cohort:TCGA_LIHC”;2)“Search dataset:TCGA LIHC RNAseq”;3)“Gene:TCEB1”;4)“Target dataset:TCGA LIHC RNAseq”;5)“Statistical method:Pearson correlation test”,以偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜0.01為相關(guān)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)[10]。篩選P＜0.05且相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5[11]的相關(guān)基因輸入Metascape(http://metascape.org),種屬選擇H.sapiens,隨后進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能注釋、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,并利用在線工具微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)對(duì)分析結(jié)果作圖。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

GeneMANIA(http://genemania.org/;2021-07-05)[12]可在線構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(proteinprotein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)站使用生物信息學(xué)方法可顯示一系列相互作用的蛋白質(zhì),同時(shí)可顯示蛋白質(zhì)物理相互作用、共表達(dá)、共定位、基因富集分析和網(wǎng)站預(yù)測(cè)等。本研究利用Gene-MANIA構(gòu)建TCEB1的PPI網(wǎng)絡(luò)。參數(shù)設(shè)置全部選擇默認(rèn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TCEB1基因不同拷貝數(shù)的組間比較,若符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),若不符合正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗(yàn)。其余所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為數(shù)據(jù)庫自動(dòng)計(jì)算生成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCEB1在肝癌和正常肝臟組織差異表達(dá)

通過GEPIA在線分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)集中肝癌組織和正常肝組織TCEB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn),與正常肝組織比較,肝癌組織中TCEB1 mRNA的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)(圖1)。

圖1 TCEB1在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of TCEB1 in HCC and normal liver tissues

進(jìn)一步利用UALCAN分析TCGA數(shù)據(jù),以了解不同臨床病理特征肝癌組織中TCEB1的表達(dá)。結(jié)果顯示:肝癌組織中TCEB1 mRNA水平越高,患者腫瘤分級(jí)越差(P＜0.05)(圖2A),但肝癌組織中TCEB1 mRNA水平在各腫瘤分期中無顯著差異(圖2B);TCEB1在男性患者肝癌組織中的mRNA表達(dá)量明顯高于女性患者(P＜0.05)(圖2C);TP53突變的肝癌組織中TCEB1 mRNA水平較無突變的肝癌組織明顯升高(P＜0.05)(圖2D)。

圖2 TCEB1 mRNA表達(dá)水平與肝癌患者不同臨床病理參數(shù)和基因表型的關(guān)系(*P＜0.05)(A)TCEB1在肝癌不同分級(jí)中的表達(dá);(B)TCEB1在肝癌不同分期中的表達(dá);(C)TCEB1在不同性別肝癌患者中的表達(dá);(D)TCEB1在不同TP53基因表型中的表達(dá)。Fig.2 Relationships between the expression level of TCEB1 mRNA and different clinicopathological features and between the expression level of TCEB1 mRNA and gene phenotypes in HCC patients(*P＜0.05)(A)The expression level of TCEB1 in different grades of HCC;(B)The expression level of TCEB1 in different tumor stages of HCC;(C)The expression level of TCEB1 in male and female patients with HCC;(D)The expression level of TCEB1 in HCC with or without TP53 mutation.

2.2 TCEB1的表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

利用GEPIA在線分析TCGA數(shù)據(jù)集中364例肝癌組織TCEB1基因的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。以TCEB1基因表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),將患者分為TCEB1基因高表達(dá)組(n=182)和低表達(dá)組(n=182)。結(jié)果表明,TCEB1基因高表達(dá)組患者的總體生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)組(P=0.025)(圖3A),但兩組患者的無病生存時(shí)間無明顯差異(P=0.16)(圖 3B)。

圖3 TCEB1基因表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系(A)TCEB1基因表達(dá)與肝癌患者生存時(shí)間的關(guān)系;(B)TCEB1基因表達(dá)與肝癌患者無病生存時(shí)間的關(guān)系。Fig.3 Relationship between TCEB1 expression and the prognosis of HCC patients(A)Relationship between TCEB1 expression and the overall survival of HCC patients;(B)Relationship between TCEB1 expression and the disease free survival of HCC patients.

2.3 肝癌中TCEB1基因改變情況

為了解TCEB1在肝癌組織中是否存在基因突變或拷貝數(shù)擴(kuò)增等基因改變,我們檢索了cBio-Portal數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)在7個(gè)研究共1 136例肝癌患者中有52例患者(5%)的TCEB1發(fā)生了基因改變(基因突變、拷貝數(shù)擴(kuò)增或結(jié)構(gòu)變異)(圖4A)。TCEB1基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與其mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(圖4B)。數(shù)據(jù)分析中共有3個(gè)研究(MERiC,Basel 2021;AMC,Hepatology 2014;TCGA,Firehose Legacy)提供了患者的生存數(shù)據(jù),其中,MERiC對(duì)患者生存數(shù)據(jù)的描述為患者生存狀態(tài),另外兩項(xiàng)研究對(duì)患者生存數(shù)據(jù)的描述為患者總體生存狀態(tài)。因此,我們只納入了后兩項(xiàng)研究進(jìn)行生存分析,結(jié)果顯示,發(fā)生TCEB1基因改變的肝癌患者的總生存時(shí)間顯著低于無基因改變的患者(P=0.012 9)(圖4C),但兩組患者的無病生存時(shí)間無顯著差異(P=0.379)(圖4D),表明TCEB1基因改變可能提示預(yù)后不良。

圖4 肝癌組織中TCEB1基因改變情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系(A)TCEB1基因改變視覺圖;(B)TCEB1基因拷貝數(shù)變異與其mRNA表達(dá)的關(guān)系;(C)肝癌患者有/無TCEB1基因改變的總生存曲線;(D)肝癌患者有/無TCEB1基因改變的無病生存曲線。Fig.4 The gene alteration of TCEB1 in HCC tissues and its relationship with prognosis of patients(A)OncoPrint plot of TCEB1 alterations;(B)Relationship between TCEB1 expression and copy number variations(CNVs)in HCC;(C)The overall survival curve of HCC patients with/without TCEB1 alteration;(D)The disease free survival curve of HCC patients with/without TCEB1 alteration.

2.4 TCEB1相關(guān)基因及其富集分析結(jié)果

為探索TCEB1在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能的生物學(xué)功能,我們利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析TCGA_LIHC數(shù)據(jù)集中TCEB1的相關(guān)基因。結(jié)果表明,以FDR＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn),共有9 554個(gè)相關(guān)基因,其中4 152個(gè)基因與TCEB1顯著正相關(guān),5 402個(gè)基因與TCEB1顯著負(fù)相關(guān)(圖5A)。圖5B和5C分別顯示與TCEB1呈顯著正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因。

圖5 TCEB1相關(guān)基因(A)TCEB1相關(guān)基因火山圖;(B)TCEB1正相關(guān)基因熱圖(前50個(gè)基因);(C)TCEB1負(fù)相關(guān)基因熱圖(前50個(gè)基因)。Fig.5 TCEB1 correlated genes in HCC(A)Volcanic map showing the global highly correlated genes with TCEB1;(B)Heat map showing the top 50 genes positively correlated with TCEB1;(C)Heat map showing the top 50 genes negatively correlated with TCEB1.

我們進(jìn)一步將P＜0.05且相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5的相關(guān)基因通過Metascape進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析。GO注釋結(jié)果表明,TCEB1及其相關(guān)基因在生物過程(biological process,BP)中主要富集在核糖核蛋白復(fù)合體生物合成、基因翻譯、線粒體的組織等(圖6A),在細(xì)胞組分(cellular component,CC)中主要富集在核糖體亞單位、包含線粒體蛋白的復(fù)合體、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體等部位(圖6B),在分子功能(molecular function,MF)中主要與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、鈣黏著蛋白的結(jié)合等有關(guān)(圖6C)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,TCEB1相關(guān)基因主要富集在核糖體、腎細(xì)胞癌、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解等信號(hào)通路(圖6D)。

圖6 TCEB1相關(guān)基因的前10條GO注釋和KEGG通路分析(A)生物過程;(B)細(xì)胞組分;(C)分子功能;(D)KEGG分析。Fig.6 The top 10 significantly enriched GO annotations and KEGG pathways of TCEB1 related genes(A)The biological process;(B)Cellular component;(C)Molecular function;(D)KEGG analysis.

2.5 TCEB1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

GeneMANIA分析共篩選出20個(gè)已證實(shí)或預(yù)測(cè)的與TCEB1相互作用的蛋白質(zhì),包括TCEB2、VHL、CUL2、PPRC1、SOCS1、CUL5、RAB40B、PRKAG2、CTD-2410N18.5、SKP1、RBX1、SLC25A39、CBFB、SOCS3、C6orf141、NEK9、STK16、NELFE、TCEB3、POLR2K,相互作用關(guān)系包括物理相互作用、共表達(dá)、共定位、共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、遺傳互作(圖7)。

圖7 TCEB1的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.7 The protein-protein interaction network of TCEB1

3 討論

TCEB1是轉(zhuǎn)錄激活因子延伸蛋白復(fù)合體(SⅢ)、VHL(von Hippel-Lindau)蛋白復(fù)合體和E3泛素連接酶的組成成分[13～15],在細(xì)胞中有許多功能。研究表明,含有TCEB1的泛素連接酶可作用于許多轉(zhuǎn)錄因子,如低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)[16]、p53[17]、c-Myc[18]和核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)[19]。TCEB1 不僅可作為底物受體與泛素連接酶的底物直接相互作用[20],還可介導(dǎo)cullin蛋白與底物受體間的連接[21]。TCEB1位于8q21.11染色體區(qū),近年來8號(hào)染色體長臂(8q)的擴(kuò)增被認(rèn)為與前列腺癌的浸潤性進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)[22]。Porkka等[23]通過熒光原位雜交分析表明,23%的激素非依賴型前列腺癌有TCEB1基因擴(kuò)增,且TCEB1基因擴(kuò)增與進(jìn)展期雄激素非依賴型前列腺癌有關(guān),而激素依賴型前列腺癌沒有TCEB1基因擴(kuò)增。Agell等[22]的研究表明,在進(jìn)展期前列腺癌中,TCEB1的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加。Jalava等[3]的研究表明,TCEB1可能通過增加侵襲相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞的侵襲。Hakimi等[24]通過對(duì)TCEB1基因突變的腎細(xì)胞癌進(jìn)行遺傳和病理特征分析發(fā)現(xiàn),發(fā)生TCEB1基因突變的腎細(xì)胞癌是一種不同于透明細(xì)胞腎癌和透明細(xì)胞乳頭狀腎癌的特殊類型腎癌。

既往關(guān)于TCEB1在腫瘤中的研究主要集中在泌尿系統(tǒng),尚無在肝癌中的報(bào)道。本研究通過對(duì)TCGA等數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘和分析發(fā)現(xiàn),TCEB1在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肝組織(圖1),且TCEB1 mRNA在男性患者、腫瘤分級(jí)高、合并TP53突變的肝癌組織中水平更高(圖2),提示TCEB1可能作為促癌基因參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。TCEB1基因在肝癌中的表達(dá)與性激素、TP53突變的相關(guān)性及具體的分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。生存分析結(jié)果表明,TCEB1 mRNA水平與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(圖3),提示TCEB1可作為肝癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。

通過cBioPortal在線分析7個(gè)研究共1 136例肝癌患者的肝癌樣本,我們發(fā)現(xiàn)有52例(5%)樣本存在TCEB1基因改變(圖4A),且基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與TCEB1 mRNA水平呈正相關(guān)(圖4B),提示TCEB1在肝癌組織中的表達(dá)量增加可能部分與基因拷貝數(shù)擴(kuò)增有關(guān)。生存分析表明,與未發(fā)生TCEB1基因改變的肝癌患者比較,發(fā)生TCEB1基因改變的患者總生存時(shí)間顯著縮短,提示預(yù)后不良(圖4C)。但各研究中患者生存數(shù)據(jù)的定義可能不同,因此,TCEB1的基因改變與患者預(yù)后的確切關(guān)系有待進(jìn)一步大樣本研究證實(shí)。

為進(jìn)一步探索TCEB1在肝癌中可能的生物學(xué)功能,我們對(duì)TCEB1相關(guān)基因進(jìn)行了功能注釋和通路富集分析,結(jié)果提示,TCEB1相關(guān)基因的分子功能主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA的催化活性、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、鈣黏著蛋白結(jié)合等(圖6C),部分與已知TCEB1的功能相一致。鈣黏著蛋白是一組跨膜糖蛋白,主要參與同源細(xì)胞間的連接。目前,至少有9種鈣黏著蛋白亞家族與腫瘤有關(guān),其中E-鈣黏著蛋白的功能缺失被認(rèn)為是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的重要事件,而后者是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要信號(hào),因此,E-鈣黏著蛋白被認(rèn)為是腫瘤生長侵襲的重要抑制因子[25]。本研究提示,TCEB1相關(guān)基因的分子功能與鈣黏著蛋白結(jié)合有關(guān),說明TCEB1可能通過影響鈣黏著蛋白的分子功能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,但這一假設(shè)需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

通過GeneMANIA構(gòu)建的TCEB1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示,TCEB2、VHL、CUL2(Cullin2)等在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用(圖7)。VHL是腫瘤抑制蛋白,研究表明在體外它可與延伸蛋白A競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合延伸蛋白B和C,從而抑制延伸蛋白活性[26]。此外,VHL蛋白可與轉(zhuǎn)錄延伸蛋白B和C(TCEB2和 TCEB1)、CUL2、Rbx1形成 VCB-CR 復(fù)合體,參與低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)的蛋白質(zhì)降解[16,27～28]。另有研究表明,TCEB1突變可破壞TCEB1與VHL的結(jié)合,導(dǎo)致VHL介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解功能缺失,這是透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的共同特征[29]。TCEB1突變?cè)诟伟┌l(fā)生發(fā)展中的作用和具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究通過對(duì)TCGA等公共數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn),TCEB1在肝癌組織中顯著高表達(dá),且為肝癌患者的不良預(yù)后因素,提示其可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展;通過對(duì)TCEB1相關(guān)基因進(jìn)行GO和KEGG分析以及構(gòu)建TCEB1蛋白互作網(wǎng)絡(luò),初步探討了TCBE1在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能的生物學(xué)功能。本研究為肝癌患者的預(yù)后評(píng)估提供了新思路,為其治療提供了新的潛在分子靶點(diǎn)。