趙晨陽,陳昱臻,付曉越,侯芙芳,高友鶴

(北京師范大學生命科學學院基因工程藥物及生物技術(shù)北京市重點實驗室,中國北京 100875)

目前,藥物一致性評價采用的是化學和生物方法:化學方法是測定藥物的溶出曲線等;生物方法多是對健康受試者進行藥物的試用,通過空腹服藥和采集靜脈血進行檢測,對比相關(guān)指標,得出被測藥物是否具有一致性的結(jié)論。根據(jù)現(xiàn)有的藥物一致性評價方法,我們產(chǎn)生了利用尿液蛋白質(zhì)生物標志物進行一致性評價的設計思路。生物標志物最基本的特征是“變化”,合適的生物標志物能夠更早、更靈敏地反映身體變化。血液作為常用的檢測樣本,有著嚴格的穩(wěn)態(tài)調(diào)控,其中大多數(shù)變化信息會被機體的調(diào)節(jié)機制清除,僅在相當短的時間內(nèi)存在。相比之下,尿液是血液濾過的產(chǎn)物,不受體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制的嚴格調(diào)節(jié),可以容納并積累更多、更大的變化[1],而且,尿蛋白可在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定[2],尿液蛋白質(zhì)組的復雜性相對較低,更容易檢測到低豐度蛋白質(zhì)的變化特征[3],可見尿液是良好的生物標志物來源。不過,尿液蛋白質(zhì)組易受多種因素的影響,如飲食、藥物治療、日常活動等,要使實驗結(jié)果更為準確,關(guān)鍵是采用簡單且可控制的系統(tǒng)。由于動物模型的遺傳和環(huán)境因素可以人為控制,能夠最大程度減少無關(guān)的影響因素,因此采用動物模型開展尿液生物標志物的研究是一種非常合適的實驗方法。那么對于最廣泛應用的他汀類降脂藥,我們是否可以從尿液的角度對原研藥和仿制藥進行一致性評價呢？

他汀類藥物是一種還原酶抑制劑,是臨床上廣泛使用的降血脂藥物[4]。其降脂作用機制為競爭性抑制膽固醇合成的限速酶——羥甲基戊二酰輔酶A還原酶,從而降低細胞內(nèi)的膽固醇水平;這一機制也可以上調(diào)患者肝細胞表面低密度蛋白質(zhì)的受體表達,從而對患者體內(nèi)的血脂進行調(diào)節(jié)[5]。他汀類藥物還有除調(diào)脂以外的多種療效,它的多效性在治療動脈粥樣硬化、冠心病、心房顫動、室性心律失常及抗心肌肥厚等方面發(fā)揮了重要作用[6]。本研究通過將合適劑量的兩種阿托伐他汀片分別灌胃到大鼠,收集了大鼠灌胃前后的尿液并進行了非標記定量蛋白質(zhì)組學分析,探究了兩種藥物灌胃后的蛋白質(zhì)組變化并進行了比較,創(chuàng)新性地為藥物一致性評價提供了新的評價方法。

1 材料與方法

1.1 灌胃動物模型的建立

健康SD(Sprague Dawley)雄性大鼠,體重(160±20)g,10只,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠在標準環(huán)境[室溫(22±1)℃、濕度65%～70%]中飼養(yǎng)3 d后開始實驗,一切實驗操作遵循北京師范大學生命科學學院倫理委員會的審查和批準。

采用自身前后對照的方式,將10只大鼠隨機均分為A、B兩組,每組5只大鼠。A組用A廠藥物研磨后溶于生理鹽水內(nèi)進行灌胃操作,B組用B廠藥物研磨后溶于生理鹽水內(nèi)進行灌胃操作,A、B兩種藥物劑型相同,劑量均為10 mg/kg[7],每日1次于同一時間灌胃,持續(xù)5 d,每天稱取大鼠重量,按大鼠重量給與對應劑量的藥品。

1.2 尿液樣品的收集

大鼠灌胃給藥處理前統(tǒng)一將其置于代謝籠中收集12 h的尿液,然后在標準環(huán)境下飼養(yǎng)3 d后進行灌胃給藥,第5天灌胃給藥處理后再將大鼠置于代謝籠中收集12 h的尿液。在尿液收集過程中大鼠禁食禁水,兩次收集的尿液都放入-80℃冰箱保存。

1.3 尿液樣品的處理

尿蛋白提取和定量:將兩個時間點收集到的大鼠尿液在4℃的條件下以12 000g離心40 min,取上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中,3倍上清體積加入預冷乙醇。均勻混合后在-20℃條件下沉淀過夜。第2天,將乙醇上清混合液于4℃條件下以12 000g離心30 min,棄上清,留蛋白質(zhì)沉淀,倒扣于濾紙上,用吹風機冷風吹干。將蛋白質(zhì)沉淀重懸于120 μL裂解液[8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、25 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT,德國Sigma公司)、50 mmol/L Tris],用槍頭反復吹打,直到無沉淀為止,并于渦旋混合器完全混勻2 h?；旌暇鶆蚝?℃條件下12 000g離心30 min,取上清蛋白質(zhì)置于新的EP管內(nèi),用Bradford法測量蛋白質(zhì)濃度。

尿蛋白酶切:取100 μg尿蛋白樣品加入1.5 mL離心管中,加入25 mmol/L NH4HCO3溶液使總體積為200 μL;加入20 mmol/L DTT溶液,渦旋混勻后,金屬浴(97℃)加熱5 min,隨后冷卻至室溫;加入50 mmol/L的碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA,德國Sigma公司),渦旋混勻后,室溫避光反應40 min。向10 kD超濾管(美國Pall公司)中加入200 μL UA溶液(8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.5),按照14 000g、5 min、18℃的條件離心洗滌兩次;加入處理后的蛋白質(zhì)樣品,在14 000g、40 min、18℃條件下進行離心,再加入200 μL UA溶液,渦旋混勻,于18℃條件下14 000g離心40 min,棄下層濾過液,重復兩次;加入25 mmol/L NH4HCO3溶液,渦旋混勻,在18℃條件下14 000g離心40 min,棄下層濾過液,重復兩次。更換新的套管,加入100 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液,以胰酶∶蛋白質(zhì)為1∶50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶(Trypsin Gold,美國Promega公司)進行消化,37℃水浴過夜后收集溶有肽段的溶液[8]。最后通過HLB柱(美國Waters公司)除鹽,用真空干燥儀進行抽干,于-80℃條件下保存。

1.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

酶解后的樣品加入0.1%的甲酸復溶,使用BCA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)對肽段進行定量,將肽段稀釋為0.5 μg/μL。取每個樣品9 μL制備混合多肽樣,按照說明書,使用高pH反相肽分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行分離。離心收集10份流出液,使用真空干燥儀抽干后用0.1%甲酸復溶。以樣品∶iRT(indexed retention time,英國BioGnosis公司)為10∶1的體積比例加入iRT。每個樣品(單個實驗樣品和10個流出液)取1 μg使用EASY-nLC1200色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行質(zhì)譜分析并采集數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

十個流出液的raw文件通過PD(Proteome Discoverer 2.1,美國Thermo Fisher Scientific公司)軟件進行分析,分析結(jié)果用于建立DIA(data independent acquisition)采集方法。新建立的DIA方法用于進行單個實驗樣品的DIA模式采集。采集結(jié)束后使用Spectronaut(英國BiogGnosis公司)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理和分析。導入每個樣本DIA采集的raw文件進行搜庫。采用二級肽段所有碎片離子峰面積進行蛋白質(zhì)定量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采取自身對照的方式,將灌胃前后鑒定到的蛋白質(zhì)進行比較,篩選差異蛋白質(zhì)。差異蛋白質(zhì)篩選條件為:組間變化倍數(shù)(fold change)≥1.50或≤0.67,配對t檢驗分析的P校正值＜0.05。對篩選到的差異蛋白質(zhì)使用UniProt網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/;2022-03-03)和DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/;2022-03-03)進行生物學分析,并在PubMed數(shù)據(jù)庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/;2022-03-03)上對已報道文獻進行檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗動物的行為學分析

在造模前后對A、B兩組大鼠進行行為學觀察,觀察結(jié)果顯示,兩組大鼠活動正常,飲食飲水均正常,且兩組大鼠之間無明顯的行為學差異。同時,在灌胃給藥處理前及給藥處理的5 d時間里,兩組大鼠體重均持續(xù)增加(圖1),生長狀況正常。

圖1 A、B組大鼠體重變化Fig.1 Weight changes of rats in groups A and B

2.2 尿液蛋白質(zhì)組變化分析

2.2.1 尿液蛋白質(zhì)鑒定情況

在灌胃給藥處理后,對所收集到的兩組大鼠共20個尿液蛋白質(zhì)樣品(灌胃前后)進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析?？偣茶b定到1 261個蛋白質(zhì),其中特異性多肽≥2個,蛋白質(zhì)水平錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜1%。A、B兩組大鼠灌胃前后尿液樣本的比較結(jié)果表明,相對于灌胃給藥前,灌胃給A藥后鑒定到116個差異蛋白質(zhì),灌胃給B藥后鑒定到66個差異蛋白質(zhì),差異蛋白質(zhì)的詳細信息列于表1(A組)和表2(B組)。用韋恩圖展示A、B兩種藥物灌胃處理后鑒定到的差異蛋白質(zhì)的重疊情況,發(fā)現(xiàn)有24個蛋白質(zhì)在兩組大鼠中均被鑒定到(圖2)。同時,我們對總蛋白質(zhì)進行了偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLSDA),結(jié)果如圖3所示,橙色區(qū)域和藍色區(qū)域分別代表灌胃B藥物和A藥物的樣本情況,灰色區(qū)域是灌胃前的樣本情況。從圖中可知,藥物灌胃帶來的差異是十分明顯的,且這兩種藥物的區(qū)別不大。

圖2 A、B兩組大鼠灌胃給藥處理鑒定到的差異蛋白質(zhì)的韋恩圖Fig.2 The Venn diagram of differential proteins identified in urine samples of rats treated with intragastric drug administration in groups A and B

圖3 鑒定到的總蛋白質(zhì)偏最小二乘法判別分析結(jié)果Fig.3 Partial least squares-discriminant analysis of the identified urine proteins

2.2.2 灌胃A組大鼠差異蛋白質(zhì)的功能分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對灌胃A組大鼠鑒定到的差異蛋白質(zhì)從生物學過程、細胞成分和分子功能3個方面進行功能富集分析(圖 4,https://www.bioinformatics.com.cn)。從圖中可以看出,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細胞黏附、底物黏附依賴性細胞擴散、內(nèi)肽酶活性的負調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化的正向調(diào)控、細胞遷移、蛋白質(zhì)水解等生物學過程。在細胞成分上,這些差異蛋白質(zhì)大多來自胞外和細胞質(zhì)膜外,而在分子功能中,我們發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)大多具有整合素結(jié)合、水解酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性、胰島素樣生長因子結(jié)合等功能。

2.2.3 灌胃B組大鼠差異蛋白質(zhì)的功能分析

同上,我們通過功能分析發(fā)現(xiàn),灌胃B組大鼠鑒定到的差異蛋白質(zhì)主要參與了蛋白質(zhì)水解、肝細胞生長因子刺激的細胞反應、免疫反應、半胱氨酸代謝、甲狀腺激素刺激的細胞反應、谷胱甘肽代謝等生物學過程(圖5,https://www.bioinformatics.com.cn)。在細胞成分上,這些差異蛋白質(zhì)仍舊是源于胞外區(qū)、分泌體;在分子功能中,差異蛋白質(zhì)主要具有肽酶活性、羧肽酶活性、水解酶活性、肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、谷氨酰半胱氨酸連接酶活性等功能(圖 5)。

圖4 A組灌胃大鼠差異蛋白質(zhì)功能分析Fig.4 Functional analysis of differential proteins in group A

圖5 B組灌胃大鼠差異蛋白質(zhì)功能分析Fig.5 Functional analysis of differential proteins in group B

3 討論

本研究使用源于兩種藥廠的阿托伐他汀片分別建立了大鼠灌胃模型,通過對灌胃前后收集的尿液進行非標記LC-MS/MS鑒定和分析,探究不同藥廠所制藥物對大鼠尿蛋白的影響。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,將灌胃后的尿液和灌胃前的尿液進行對比,在A組灌胃模型中共鑒定到116個差異蛋白質(zhì)(表1),在B組灌胃模型中共鑒定到66個差異蛋白質(zhì)(表2),其中有24個蛋白質(zhì)在兩組中都被鑒定到(圖 2)。

表1 A組鑒定到的尿液差異蛋白質(zhì)Table 1 The differential proteins identified in group A

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

表2 B組鑒定到的尿液差異蛋白質(zhì)Table 2 The differential proteins identified in group B

表2 (續(xù))

根據(jù)偏最小二乘法判別分析結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn),尿蛋白可以顯示出阿托伐他汀對機體的顯著影響,而不同廠家的成分、劑型、劑量一致的藥物對機體產(chǎn)生的差異影響也能被觀測到,這說明我們能從尿蛋白中看到很細致的變化。從差異蛋白質(zhì)的生物學功能分析結(jié)果上看,我們不能很明顯地區(qū)分出這些影響源自于藥物的藥理作用還是毒理作用,首先我們沒有觀察到和降脂有顯著關(guān)系的生物學通路,其次如果有他汀類藥物副作用的話,我們可能會看到和平滑肌細胞遷移、血小板黏附下調(diào)相關(guān)的生物學通路[9],而這些在本研究中并沒有觀測到。從目前的研究階段來看,可能是因為劑量的問題讓我們沒有看到顯著的藥理或毒理作用,但在本研究中,即使是很小的劑量,我們依舊可以通過尿液觀測到機體受到的影響,這充分說明了尿液的靈敏性,以及其用于藥物一致性評價的巨大潛力。

4 結(jié)論

通過建立阿托伐他汀大鼠灌胃模型,我們能從尿液上顯著區(qū)分藥物帶來的影響;針對產(chǎn)自不同藥廠的阿托伐他汀片,尿蛋白甚至可以檢測到兩種藥物之間細致的差別,這充分驗證了尿液的靈敏性,同時提示尿液蛋白質(zhì)組學在藥物一致性評價上有很大潛力。