張星和 楊曉娜 鄒章玉 左榮艷

（1.保山學院 資源環(huán)境學院；2.云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點實驗室，云南 保山 678000）

火棘Pyracantha fortuneana（Maxim．）Li是一種薔薇科蘋果亞科火棘屬植物，為常綠野生灌木[1]。據(jù)《中國植物志》記載，火棘屬有10種，在我國主要分布有7種，云南地區(qū)多為火棘[2-3]?；鸺粌H資源豐富，具有很多的營養(yǎng)成分，而且藥用價值高，為“藥食同源”植物?！侗静菥V目》和《滇南本草》記錄，火棘果性味甘酸，具有健脾消積、生津止渴、清熱解毒、活血止血等作用，用來治積食、崩漏等[4-6]。目前對火棘果中黃酮類、多糖、維生素及色素等研究較多[7-14]，而對其原花青素提取及抗氧化性報道相對較少[15-18]。鄢又玉[19]等以湖北恩施地區(qū)火棘果為原料，先做單因素實驗，后利用中心組合和響應面法優(yōu)化了火棘果原花青素的提取工藝，結果表明：提取溫度，乙醇量以及酸量對原花青素的提取影響顯著；隨后將火棘果原花青素抗氧化能力與其總抗氧化能力比較，證明了原花青素所貢獻的抗氧化能力在火棘果總抗氧化能力中占了很大比例。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是以黃烷醇為基本結構的一類聚多酚化合物的總稱，是目前世界上清除人體自由基最好的天然抗氧化劑之一，體內(nèi)活性非常強[20-24]。人們對于原花青素作為抗氧化劑認可度非常高。高純的原花青素一般為紅棕色粉末，可溶于水和丙酮、甲醇等有機溶劑。其提取方法主要有溶劑提取法、酶提法、超聲波輔助法、超臨界CO2萃取和微波輔助法等[25-28]。微波輔助是一種具有很強化學效應和熱效應的高頻電磁波，能使目標分子相互摩擦碰撞，從而提高粉末溫度并促進細胞破裂，使原花青素更好地滲出到提取液中，提高得率。關于微波輔助提取火棘果原花青素尚未見報道。本文采用了微波輔助法提取楚雄地區(qū)野生火棘果原花青素，用正交實驗法優(yōu)化提取工藝，并采用OH˙、DPPH˙、ABTS+、普魯士藍法、鉬酸銨法、金屬螯合能力6種方法測定火棘果原花青素的抗氧活性，補充和完善了火棘果原花青素抗氧化活性，為火棘果這一特色“藥食同源”植物的開發(fā)和高值轉(zhuǎn)化、利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料（野生火棘果）：采自云南楚雄武定[成熟、飽滿果實采摘→沖洗→晾曬→60℃烘干→粉碎→過篩（100目）→火棘果粉末備用]。

試劑：標準品，中國食品藥品檢定研究院，純度99.2%；香草醛，天津市光復精細化工研究所，純度99.0%；ABTS，酷爾化學，純度98%；DPPH，阿拉丁試劑網(wǎng)，純度≥97.0%；菲洛嗪水合物，酷爾化學，純度97%；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

M1-211A微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司；721-可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DFT-250A250克手提式高速萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；TDL-4型離心機：安亭儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取工藝及最佳條件確定

取1 g火棘果粉末放入100 mL錐形瓶，倒入一定體積和濃度的乙醇溶液封口、浸泡，分別在不同微波時間、功率下進行提取數(shù)次，將提取液抽濾后離心，得到上清液，按含量測定方法于499 nm處測定其吸光度A，以縱坐標A求出橫坐標x，即提取液中原花青素含量，從而計算原花青素的提取率。分別對乙醇濃度、水料比、微波時間和微波功率進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，設計L9(34)正交實驗（如表1所示），探討最佳提取條件。每個樣品均做3個平行。

表1 正交試驗因素與水平

1.3.2 原花青素含量測定及提取率計算

以兒茶素為標準品，無水乙醇為溶劑配制一系列濃度的溶液，再按香草醛-鹽酸法顯色：1.0 mL溶液+6 mL 4%香草醛-甲醇溶液+3 mL濃鹽酸。30℃恒溫水浴保溫避光反應10 min，于499 nm測定吸光度A。以兒茶素濃度（mg/mL）為橫坐標，A為縱坐標作圖添加趨勢線，得標準曲線y=18.522x+0.012 8，R2=0.999。說明在操作范圍內(nèi)濃度與吸光度呈線性，標準曲線可用。

用1.0 mL樣品溶液代替標準品，同樣的方法避光反應、顯色后測定吸光度。將測定出的吸光度值代入標準曲線換算含量，按式（1）計算原花青素提取率：

式中c為提取液濃度mg/mL，V為提取液的體積mL，m為稱取粉末質(zhì)量g。

1.3.3 原花青素的鑒定及最大吸收波長確定

分別取1 mL提取液和標準品溶液按1.3.2水浴顯色，用紫外可見分光光度計于320～700 nm波長范圍內(nèi)進行全波段掃描，比較二者的最大吸收波長。

1.3.4 抗氧化活性研究

1.3.4.1 OH·（羥基自由基）的清除能力測定

采用水楊酸法[29,30]，先用無水乙醇配制相同濃度如7.5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸溶液，等比例混合均勻，作為儲備液。然后按1 mL原花青素提取液（或超純水）+2 mL檢測儲備液（或超純水）+超純水=5 mL于526 nm波長處測定溶液體系的吸光度。根據(jù)三個不同的吸光度按式（2）計算OH·的清除率。

式中A1為提取液+儲備液，A2為提取液+水，A0為儲備液+水。

1.3.4.2 DPPH·（DPPH自由基）的清除能力測定

方法同（1），2 mL 0.2%mmol/L DPPH溶液為儲備液在517 nm下測定吸光度。

1.3.4.3 ABTS+·的清除能力

參考HUANG W Y和劉玉革等[31,32]方法，由7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合反應12 h來提供ABTS+·。0.5 mL提取液+2 mL ABTS+·反應30 min在734 nm測定其吸光度A2。以乙醇溶液作對照測得A1。清除率計算見公式（3）。

1.3.4.4 鐵離子的螯合能力測定

方法同（3），于562 nm波長處測定反應物的吸光度。螯合率（MCC）計算見公式（3）。

1.3.4.5 總抗氧化性的測定

鉬酸銨法測定提取物的總抗氧化性。稱取6.67 mL濃硫酸+2.13 g磷酸鈉+0.99 g四水合鉬酸銨+200.0 mL蒸餾水，充分溶解為鉬酸銨工作液。0.3 mL提取液+3.0 mL鉬酸銨溶液，90℃恒溫水浴條件下加熱1.5 h，靜置，冷卻，3 000 r/min離心15 min，鉬酸銨溶液作空白，于695 nm處測定溶液中鉬離子的吸光度。

1.3.4.6 原花青素還原能力的測定

1 mL提取液+1 mL0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)+1 mL 1%K3Fe(CN)6溶液50℃恒溫水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸離心10 min。取2 mL上清液+3 mL去離子水+2 mL 0.1%FeCl3溶液于700 nm波長下測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 確定提取物的吸收波長

根據(jù)1.3.3將標準品、提取物顯色后進行全波長掃描，結果如圖1所示。

圖1 紫外吸收光譜

圖（a）為標準品的光譜圖，圖（b）為提取物的光譜圖，結果顯示二者最大吸收波長均為499 nm，與文獻報道500 nm基本一致。同時也表明微波輔助提取火棘果產(chǎn)物確實為原花青素。此后測定含量均在499 nm。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取率受乙醇濃度的影響情況

分別用55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液對火棘果粉末進行提取，結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度與提取率的關系

從圖2看出，隨著所用提取劑濃度的增加，火棘果原花青素提取率先逐漸增大，然后減小。當提取劑濃度達85%時，提取率為11.34 mg/g，為原花青素的最大溶出量；當濃度為55%～65%范圍內(nèi)提取率相對較低，可能由于水分含量相對較高，提取劑極性相對較大。根據(jù)極性溶劑利于極性相對較大物質(zhì)的溶解而抑制細胞中原花青素溶出，導致提取率相對較低。此后隨著乙醇濃度增加，結果與上述相反。綜上所述，選取乙醇濃度75%、85%、95%為正交試驗水平。

2.2.2 提取率受水料比的影響情況

分別按30、40、50、60、70 mL的乙醇溶液與1 g火棘果粉末比即水料比（mL/g）進行原花青素的提取，結果如圖3所示。

圖3 水料比與提取率的關系

從圖3看出，隨著乙醇溶液體積的不斷增加，原花青素提取率先上升，當水液比在50 mL/g時，提取率為5.179 mg/g。當繼續(xù)增加乙醇溶液的用量，提取率出現(xiàn)降低?？赡苁窃谌軇w積小時火棘果粉末沒有得到充分浸泡，且溶劑量較少溶劑僅能溶解有限的原花青素，使提取出的溶液容易達到飽和狀態(tài)，從而抑制原花青素溶解于溶劑中，所以提取率偏低。當提取溶劑增加時，在溶劑浸泡下火棘果粉末能在短時間被微波破壞其細胞結構，使原花青素能被快速溶解到溶劑中。綜上所述，選取40、50、60 mL/g水料比作為正交試驗考察水平。

2.2.3 提取率受微波功率的影響情況

分別按140 W、280 W、420 W、560 W、700 W的功率進行提取，結果如圖4所示。

圖4 微波功率與提取率的關系

從圖4看出，提取工藝中微波功率的不同會造成提取率的變化。當功率不斷增加時，火棘果原花青素提取率先不斷增加，然后逐漸降低。當功率為420 W時，原花青素提取率為5.02 mg/g達到最大值?？赡苁请S微波功率增大，能量增大，有利于原花青素的擴散、溶出；當功率過大時，體系溫度過高，導致原料可能發(fā)生化學變化，產(chǎn)生雜質(zhì)過多。此外，高溫會造成原花青素熱降解，使提取率降低。綜上所述，選取微波功率280 W、420 W、560 W為正交試驗考察水平。

2.2.4 提取率受微波時間的影響情況

按照20 s、40 s、60 s、80 s、100 s微波加熱進行原花青素的提取，結果見圖5。

圖5 微波時間與提取率的關系

從圖5看出，微波時間影響火棘果原花青素的提取。隨著時間增長，火棘果原花青素提取率先呈現(xiàn)不斷增加趨勢，然后逐漸減少。當提取時間為60 s時，提取率為4.62 mg/g達到最大值。可能短時提取不利于提取物從細胞中溶出，當微波60 s時，火棘果果肉細胞內(nèi)外兩部分有效成分濃度接近于達到平衡狀態(tài)，故提取效果最佳。而繼續(xù)延長提取時間又會使溶出的原花青素的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)改變，提取率再次下降。綜上所述，選取提取時間40 s、60 s、80 s為正交試驗考察水平。

2.3 正交試驗結果與驗證

正交試驗結果見表2。

表2 提取工藝正交試驗結果

通過R值比較各因素對火棘果提取物原花青素提取率的影響關系為A＞B＞D＞C，即乙醇濃度＞水料比＞時間＞功率。說明乙醇濃度對火棘果原花青素提取率的影響最大，水料比其次，提取率受時間和功率的影響相對較小。比較k值大小，得最佳提取組合為（A2B1C3D3）：乙醇濃度85%、水料比40 mL/g、微波功率560 W、微波時間80 s。在最優(yōu)條件下做三個平行試驗，平均提取率為12.51 mg/g，提取率比表2最高提取率稍高。

2.4 抗氧化性結果

2.4.1 對OH·的清除能力

火棘果原花青素對OH·的清除結果見圖6。

圖6 原花青素提取物與OH·清除率的關系

從圖6看出，火棘果提取物與OH·的清除存在某種量效關系，在57～172 μg/mL范圍內(nèi)OH·的清除率隨火棘果原花青素濃度增加而逐漸增大。當原花青素濃度為172 μg/mL時，清除率為65.11%。表明：火棘果提取物原花青素對OH·具有一定的清除能力。

2.4.2 對DPPH·的清除能力

火棘果原花青素對DPPH·的清除結果見圖7。

圖7 原花青素提取物與DPPH·清除率的關系

從圖7看出，火棘果原花青素在體外可使DPPH·被清除，當濃度為6～30 μg/mL時，其濃度與清除率近似于呈現(xiàn)正相關，且DPPH·清除率與火棘果原花青素質(zhì)量濃度線性關系良好。當原花青素濃度達到30 μg/mL時，原花青素對DPPH·的清除率達到了68%。結果說明火棘果提取物原花青素可使三分之一以上的DPPH·被清除，清除能力一般。

2.4.3 對ABTS+·的清除能力

火棘果原花青素對ABTS+·的清除結果見圖8。

圖8 原花青素提取物與ABTS+·清除率的關系

從圖8看出，當原花青素濃度為4.80～12.49 μg/mL時，ABTS+·的清除率隨原花青素濃度增加而不斷增加，而且增長速度相對較快，在濃度為12.49 μg/mL時，清除率高達94%。因此，火棘果原花青素對ABTS+·的清除能力非常強，適用于陽離子自由基豐富的體系。通過三種自由基清除試驗可看出，火棘果提取的原花青素具有較強的清除自由基能力，具備了作為食品中天然抗氧化劑的可能。

2.4.4 對金屬離子的螯合能力

火棘果原花青素對鐵離子的螯合率結果見圖9。

圖9 原花青素提取物對金屬螯合能力的影響

由圖9可知，火棘果提取物原花青素濃度在91.8～150 μg/mL范圍內(nèi)，螯合率隨原花青素濃度增加而不斷增加，小于110 μg/mL時增長趨勢相對較緩慢，在110～150 μg/mL范圍內(nèi)增長較快，濃度為153 μg/mL時，螯合率達到21.97%。可能由于提取物原花青素濃度增加，體系所含有效濃度增加，進而金屬離子與原花青素碰撞、結合的幾率增加，最終導致螯合率隨濃度呈現(xiàn)一定的增長趨勢。結果說明火棘果提取物原花青素擁有一定的螯合能力，但鐵離子的鰲合作用較差，不大明顯。

2.4.5 總抗氧化活性分析

可用測定綠色Mo5+磷酸鹽的吸光度大小間接判斷原花青素的總抗氧化性，結果如圖10所示。

圖10 原花青素提取物與抗氧化能力的關系

從圖10看出，當原花青素濃度為74～223 μg/mL時，原花青素濃度與生成物質(zhì)吸光度趨近于線性正相關，在濃度為223 μg/mL時，Mo5+磷酸鹽吸光度達到0.782，再次表明火棘果提取物原花青素存在一定抗氧化活性，且對ABTS+·的清除最顯著。

2.4.6 還原能力的分析

采用普魯士藍法表征原花青素的還原能力：鐵氰化鉀與火棘果提取物原花青素反應生成亞鐵氰化鐵。其生成量越多，顏色越明顯，提取物還原能力也越強。結果見圖11。

圖11 原花青素提取物對還原能力的影響

從圖11看出，當火棘果原花青素濃度在37～112 μg/mL時，吸光度隨原花青素含量增加而呈現(xiàn)增大，并在原花青素濃度為112 μg/mL時，吸光度達到0.751。結果表明：火棘果原花青素濃度與普魯士藍生成量呈一定的量效關系，原花青素還原性與濃度有關。

3 結論與展望

以微波輔助法提取火棘果中原花青素，最佳提取條件為：微波時間80 s、功率560 W、水料比40（mL/g）、乙醇濃度85%，由此條件下得火棘果原花青素提取率為12.51 mg/g。然后采用6種常用抗氧化活性的檢測方法：OH·、DPPH·、ABTS+·、金屬螯合能力、普魯士藍法、鉬酸銨法分別對火棘果原花青素提取物進行抗氧化性質(zhì)研究。結果顯示火棘果原花青素具有多種抗氧化活性，且與濃度呈正向量效關系。其中，火棘果原花青素對ABTS+·效果最明顯，當原花青素濃度為12.49 μg/mL時，清除率達94%。為了更好地實現(xiàn)火棘果的高值轉(zhuǎn)化與利用，后續(xù)可將原花青素純化，然后作為抗氧化劑應用于某一具體的食品體系中，比較與常見抗氧劑如Vc和BHT性能的差異，從而使提取物更符合應用理念。