常 青

(濮陽職業(yè)技術學院，河南濮陽 457000)

作為陸地植物初級生產(chǎn)力的主要限制因子，氮在植物生長發(fā)育及生理代謝中具有不可替代的作用[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用氮肥是保障作物品質及產(chǎn)量的常規(guī)措施，然而施氮量與產(chǎn)量間存在一定閾值，當?shù)适┯眠^高時作物的氮肥利用率反而降低[2]。此外，氮肥的廣泛運用和過量施用帶來的負面影響日趨嚴重，如何有效降低氮肥使用量，提高作物氮利用率已成為發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)的關鍵問題[3]。為了提高作物氮肥利用率，已經(jīng)開展了作物育種、緩釋控釋技術以及均衡施肥等多種策略[4]，盡管上述策略在作物生產(chǎn)中表現(xiàn)出良好的生產(chǎn)效果，但確定最佳氮素管理實踐，仍是一個亟待探索的過程。

關于施氮水平對植物的影響，許多研究已經(jīng)探索了煙草、大豆及水稻等減肥實踐，發(fā)現(xiàn)適宜減施氮肥，產(chǎn)量無明顯變化，當減施比例提高時，氮肥利用率顯著下降[8]，但不同作物適宜的氮肥減施比例不同。玉米(ZeamaysL.)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的農(nóng)作物之一，具有較高的代謝能力，為了獲得最大產(chǎn)量，玉米植株需要大量的化學氮肥，使用的主要氮肥類型是尿素[9]。因此，在不影響作物產(chǎn)量的情況下提高尿素中氮的利用效率，仍是亟待解決的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2020年5—6月在濮陽市農(nóng)業(yè)科學院溫室大棚中進行。供試玉米品種為鄭單958，是河南省目前主栽的優(yōu)良品種之一，使用1%次氯酸鈉對種子表面進行消毒并暗處理催芽24 h。供試氮肥為15N-尿素(15N含量為10.11%)，購自上?；ぱ芯吭河邢薰?。供試生物炭由河南省生物炭工程技術研究中心提供，采用玉米和小麥秸稈(質量比為1 ∶2)在低氧、440 ℃條件下連續(xù)炭化65 min制得，其基本性質：全碳含量為49.82%，總氮含量為2.13%，比表面積為15.66 m2/g，容重為 0.26 g/cm3，pH值為8.36，主要官能團為羥基、烷烴和酰胺基[13]。

供試土壤取自濮陽市農(nóng)業(yè)科學院清豐試驗田(114°46′49″N，35°44′17″E)，為0～20 cm土層土壤。土壤類型為黃褐土。土壤理化性質：有機質含量為20.59 g/kg，全氮含量為1.16 g/kg，堿解氮含量為78.44 mg/kg，有效磷含量為19.01 mg/kg，速效鉀含量為137.36 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗設置2因素3水平完全隨機組合設計，因素1：施用生物炭(BC)，設置施用0、3%、9%等3個生物炭水平，分別記作：BC0、BC3、BC9；因素2：施用氮素(N)，設置施用100%、80%、60%等3個氮素水平，分別記作：N100、N80、N60；共設置9個處理組合。其中，施用生物炭處理的0、3%、9%為施用生物炭的質量與培養(yǎng)土壤質量之比，施用氮素處理的100%、80%、60%為施氮量與常規(guī)施氮量(150 kg/hm2，種植密度7.5×104株/hm2)的質量之比，即N100、N80、N60的施氮量分別為2.0、1.6、1.2 g/盆。每個處理重復3次。

采用黑色聚乙烯塑膠桶，每盆裝土4 kg。稱取相應質量的上述生物炭及15N-尿素與土壤充分攪拌均勻后裝盆，其中每盆純磷施入量為1 g(P2O5∶K2O=1 ∶1)。每盆播種已催芽的玉米種子6粒，7 d后間苗至每盆3株，土壤持水量保持為80%，共培育35 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 玉米植株、土壤氮測定 培養(yǎng)結束后，將玉米植物地上部、根系分離，65 ℃烘干并稱質量以確定植株干物質。在測定15N豐度和全氮(TN)含量之前，將植物樣品和風干土壤樣品細磨并通過 0.15 mm 網(wǎng)篩。植物和土壤15N同位素比采用穩(wěn)定同位素比質譜儀(DELTA plus XP，Thermo Finnigan，USA)測定；葉片全碳(TC)含量采用重鉻酸鉀-硫酸氧化法測定[14]。

1.3.2 核磁共振和代謝物分析測定 稱取0.50 g植物樣品在液氮中快速研磨，移入離心管中 7 000 r/min、4 ℃快速離心5 min，加入2 mL甲醇和2 mL三氯甲烷，渦旋30 s，并在冰浴中超聲提取 60 s。然后10 000 r/min、4 ℃高速離心20 min；重復該步驟3次，分別收集底部有機相(非極性相)和上層水相(極性相)。對于水相，在真空下旋轉蒸發(fā)除去甲醇(<5%)，然后將上清液在-80 ℃冷凍24 h。對于有機相，在旋轉真空蒸發(fā)器中進行減壓干燥，接著加入800 μL 純重水(D2O)、160 μL磷酸鹽緩沖鹽水(pH值為7)、10%重水以及0.02 mmol/L 3-三甲基硅基-[2，2，3，3-D4]-丙酸鈉(TSP)，旋蒸蒸發(fā)3 min；加入1 mL含有0.03% 四甲基硅烷(TMS)的氚代三氯甲烷-d(CDCl3)至干燥有機組分中，并采用TSP和TMS作為內(nèi)標。將水樣、有機相提取物分別轉移到埃彭多夫管中，12 000g離心 5 min。移取0.65 mL樣品轉移到核磁共振(NMR)樣品管中。對每個樣本進行核磁共振分析。

使用Bruker AVANCE Ⅲ 600 超導高分辨核磁共振譜儀(Bruker AVANCE Ⅲ 600，Germany)掃描生成極性和非極性代謝譜。使用TopSpin 2.1軟件(Bruker Biospin)對樣品處理、自動化和采集進行控制，對于水相、有機相樣品，皆使用標準的1H 90°脈沖序列，每個光譜為32 k數(shù)據(jù)點，譜寬為16×10-6Hz。水相頻域譜采用手動調整，有機相采用CDCl3對光譜自動調整，1H NMR譜的基線校正、相位校正以及等寬累積處理參考Sun等的研究[16]。以上分析均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.3 氮素相關代謝基因表達分析 使用TRIpure Reagent Plant RNA Mini Kit(BioTeke，中國北京)按照試劑盒說明提取葉部、根系總RNA，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒(HiScript? Ⅱ QRT SuperMix，Vazyme Biotech，中國南京)按照試劑盒說明合成第1條cDNA。以ZmUBC為看家基因，采用StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific，USA)對cDNA進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析。氮素相關代謝基因(ZmAS1、ZmGS1)的特異性引物序列見表1。反應體系：10 μL 2×SYBR Premix ExTaqⅡ、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2.0 μL cDNA和10 μL ddH2O。擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72.0 ℃ 30 s，40個PCR循環(huán)。借助RQ Manager(ThermoFisher Scientific，USA)采用2-ΔΔCT斷層掃描方法分析數(shù)據(jù)。

表1 ZmGS1、ZmAS2和ZmUBC的實時PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

來自15N標記尿素的氮素(Ndff)、土壤氮素殘留以及植物氮素利用率(NUE)等的計算公式[17]如下：

玉米器官Ndff=玉米器官15N原子百分超/15N- 尿素原子百分超×100%；

土壤Ndff=土壤的15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；

NUE=玉米干質量×植株全氮含量×玉米整株Ndff/施氮量×100%；

土壤殘留率=土壤總干質量×土壤全 N含量×土壤Ndff/施氮量×100%；

氮肥損失率=100%-NUE-土壤氮肥殘留率。

根據(jù)Sun等的方法[16]分配和量化代謝物，基于代謝物的半定量數(shù)據(jù)計算處理之間代謝物的響應比生成代謝物相關網(wǎng)絡，并采用Cytoscape 2.8.3(http：//www.cytoscape.org/)對玉米氮組分與代謝物之間的關系進行典型對應分析(CCA)。采用進行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)和最小顯著法(LSD)進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(P<0.05)，圖片采用Origin 2018進行繪制。

2 結果與分析

2.1 生物炭與氮肥配施對玉米氮相關指標的影響

2.2 生物炭與氮肥配施對15N標記氮肥去向的影響

由圖1-A可知，在不添加生物炭(BC0)處理中，隨著施氮量降低，玉米地上部的N利用率升高，而玉米根部的N利用率降低。在添加BC處理中，玉米地上部的氮利用率隨著施氮量的降低而增加，這與各處理在根系中的趨勢一致。就BC處理來看，與不添加生物炭處理(BC0)相比，以添加3%比例的生物炭處理(BC3)具有最高的土壤殘留率和最低的氮肥損失率，而在9%比例的生物炭處理(BC9)中，玉米地上部利用率、根系利用率及土壤殘留率皆明顯降低、氮肥損失率增加。由圖1-B可知，在玉米氮素利用率中，當添加3%生物炭且氮肥施用比例為60%時(BC3N60)，玉米植株的氮素利用率最高，為29.4%；其他處理較BC3N60處理降低2.0～14.7百分點，其中與BC3N80、BC0N80、BC0N100處理無顯著差異外，皆顯著高于其他處理。

表2 不同生物炭和氮肥處理對玉米葉部礦質氮組分、全氮和全碳含量的影響

2.3 生物炭與氮肥配施對玉米葉片氮代謝譜的影響

由圖2可知，在玉米幼苗的葉片中，降低施N水平導致氨基酸含量普遍增加。當添加BC時，減少N輸入則減少了葉片中的糖庫，同時發(fā)現(xiàn)玉米葉片中的糖分對N減少和BC添加在單個糖指標中具有強烈響應。結果表明，某些糖組分的反應不僅在合成量上同時也在組分上都與糖庫總體趨勢不同，例如果糖、蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖含量隨著N添加量的減少而減少；而加入BC后，果糖和蔗糖含量均不同程度的表現(xiàn)為增加趨勢，表明生物炭降低了糖水解的通量。此外，添加BC的情況下，減少N施入量改變了葉片中的有機酸含量，特別是當BC添加量為9%時。與BC0N100處理相比，由于減少N添加、BC施用比例提高使得乳酸和莽草酸含量增加，同時其在不同處理間的有機酸譜中顯示出非常高的穩(wěn)定性。在葉片中，與BC0N100對照相比，在有機酸庫中，如蘋果酸和琥珀酸含量，隨著BC添加和N減少，皆表現(xiàn)為下降趨勢。

2.4 生物炭與氮肥配施下玉米葉片氮代謝物網(wǎng)絡相關分析

基于添加生物炭比例的影響，構建了基于相關性的共線網(wǎng)絡，網(wǎng)絡相關性圖可以表明添加生物炭后各氨基酸組分網(wǎng)絡特性的變化。由圖3-D可知，在葉片中，隨著生物炭施用比例的增加，互相關聯(lián)較少(1～10條)的代謝物數(shù)量呈先增加后減少趨勢，而相互關聯(lián)較多(11～20條)的代謝物數(shù)量減少。將BC添加比例從0增加到3%，然后到9%后，其網(wǎng)絡密度從0.19降低到0.14，然后增加到0.15；網(wǎng)絡異質性從0.60增加到0.63，然后上升到0.69。整體來看，在葉片中，施用BC減少了氨基酸組分關系間的數(shù)量，隨后對網(wǎng)絡密度產(chǎn)生了負面影響，表明添加生物炭稀釋了新陳代謝間的關系從而達到了調節(jié)氮素代謝的目的。

2.5 生物炭與氮肥配施對玉米葉片氮素代謝基因表達影響

植物中的氮代謝過程已被證明是多種相互依賴的途徑，其中涉及許多基因，包含一系列蛋白質、酶和代謝物。其中，谷氨酰胺合成酶(GS)和天冬酰胺合成酶(AS)被認為在植物氮代謝過程中具有重要作用。由圖4-A可知，在ZmGS1相對表達水平方面，相對豐度峰值出現(xiàn)在BC3N80處理，其次為BC9N100處理，二者無顯著差異，同時BC3N80處理顯著高于其他處理，而BC9N100處理與任一處理均無顯著差異。在ZmAS1相對表達水平方面(圖4-B)，以BC0N80處理的相對表達水平最高，其他處理較其降低11.81%～47.22%，其中與BC0N60、BC3N100、BC9N60處理的差異達顯著水平。此外，在添加BC條件下，ZmGS1基因的相對表達豐度整體比ZmAS1基因更高，這意味著在添加BC的代謝調整過程中，ZmGS1基因可能比ZmAS1基因更敏感。

2.6 生物炭與氮肥配施下氮素組分與代謝組特征的典范對應分析

3 討論與結論

相同的代謝物可能涉及多個代謝途徑，因此代謝物之間的關系可以采用網(wǎng)絡相關性分析來揭示。本研究結果表明，葉片的網(wǎng)絡密度、網(wǎng)絡異質性隨著BC施用比例的增加分別呈降低、增加趨勢。前人研究表明，為了讓細胞適應新的環(huán)境條件，植物體的新陳代謝會發(fā)生協(xié)同變化，然后導致與環(huán)境條件更為適配的代謝特征[25]。添加BC與施氮水平可改變代謝物之間的串聯(lián)，從而影響葉片C、N代謝，進而刺激植物生長。在N供應減少條件下，BC添加影響了葉部組織之間廣泛的網(wǎng)絡差異，這一結果部分歸因于C、N之間的平衡，也取決于植物本身對二者生理狀態(tài)差異的調整能力[26]。

在高等植物中，天冬酰胺合成酶負責氨同化的第一步，谷氨酰胺合成酶則參與后續(xù)氨的固定、儲存與運輸[27]。在植物的N再利用階段，AS與GS共同作用于運輸含氮分子，催化谷氨酰胺和天冬氨酸形成天冬酰胺，該過程對于環(huán)境壓力下的氮循環(huán)至關重要[28]。在本研究中，觀察到玉米根系中ZmGS1的表達受BC添加比例的影響較大，尤其在BC3處理中，這意味著添加3%BC條件下ZmGS1基因在改善氨同化和增加N再利用方面發(fā)揮著更為重要的作用。與ZmGS1的表達不同，ZmAS1在葉片中的表達受BC添加和N減少的影響較小，這與Sun等對玉米葉片的研究[16]一致，即AS活性在低氮脅迫下與銨同化循環(huán)相關的谷氨酰胺合酶和谷氨酰胺酮戊二酸氨基轉移酶的轉錄水平較低[11]。